生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽的合成及类抗菌肽囊泡的制备方法和应用与流程

本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽的合成及抗菌肽囊泡的制备方法和应用。

背景技术：

抗生素滥用导致耐药菌的产生，寻找不同于传统抗生素抗菌机理的抗菌剂迫在眉睫。天然抗菌肽具有广谱高效杀菌活性，其膜破坏机理不同于传统抗生素，即通过静电作用吸附到细菌细胞膜的表面，然后疏水氨基酸残基插入到细菌细胞膜中，导致其细胞膜上产生孔洞。这种特殊的抗菌机理使细菌对抗菌肽难以产生耐药性。然而天然抗菌肽的提取过程复杂，产量低而且成本高，因此化学合成的方式合成与天然抗菌肽结构相似的抗菌剂有深远的研究意义。与此同时，部分抗菌肽的疏水性氨基酸残基如苯环等对人体正常细胞有较大毒性，制约了抗菌肽在临床医疗等领域的发展，合成无细胞毒性、生物相容性好的抗菌剂一直是抗菌材料研究者的共同目标。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，首要目的是提供一种生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽。

本发明的第二个目的在于提供一种生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽的合成。

本发明的第三个目的在于提供一种类抗菌肽囊泡的制备方法和应用。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽，其结构式如下：

其中，x选自1‐100中的整数，y选自1‐100中的整数，x和y分别代表各链段的聚合度，r1表示亲水性氨基酸的亲水基团，r2表示二异氰酸酯的烷烃链段，r3表示生物可降解的疏水性高分子的重复单元，a表示亲水性氨基酸聚合的引发剂，a’表示疏水性高分子聚合的引发剂。

优选地，亲水性氨基酸选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的任意一种。

优选地，二异氰酸酯选自六亚甲基二异氰酸酯、二甲苯烷二异氰酸酯、对苯二亚甲基二异氰酸酯和对苯二异氰酸酯中的任意一种。

优选地，疏水性高分子选自聚己内酯、聚乳酸、聚羟基乙酸和聚三亚甲基碳酸酯中的任意一种或几种。

一种上述的生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽的制备方法，其包括如下步骤：

(1)、含氨基保护基团的亲水性多肽链段的制备：

(1‐1)、将含氨基保护基团的亲水性氨基酸和三光气在有机溶剂中反应，得到含氨基保护基团的亲水性氨基酸‐n‐羧基‐α‐氨基酸酐单体，其结构式为：

其中，r1表示亲水性氨基酸的亲水基团，z’表示氨基保护基团；

(1‐2)、将含氨基保护基团的亲水性氨基酸‐n‐羧基‐α‐氨基酸酐单体和亲水性氨基酸聚合的引发剂溶于有机溶剂中，并在真空下反应，得到含氨基保护基团的亲水性多肽链段，其结构式为：

其中，a表示亲水性氨基酸聚合的引发剂；

(2)、一端氨基封端的疏水性高分子链段的制备：

(2‐1)、将疏水性高分子的环状单体、催化剂、含氨基保护基团的疏水性高分子聚合的引发剂溶于有机溶剂中，并在氮气保护下反应，得到含氨基保护基团的疏水性高分子链段，其结构式为：

其中，r3表示生物可降解的疏水性高分子的重复单元，a’表示疏水性高分子聚合的引发剂，z’表示氨基保护基团；

(2‐2)、在含氨基保护基团的疏水性高分子链段内加入脱保护剂进行反应，得到第一反应液；在第一反应液内加入沉淀剂，取沉淀物作为第一粗产物；将第一粗产物洗涤、干燥，得到一端氨基封端的疏水性高分子链段，其结构式为：

(3)、生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽的制备：

(3‐1)、将步骤(1)的含氨基保护基团的亲水性多肽链段和二异氰酸酯在有机溶剂中反应，得到第二反应液；在第二反应液内加入正己烷，纯化得到：

其中，r2表示二异氰酸酯的烷烃链段；

(3‐2)、将步骤(2)的一端氨基封端的疏水性高分子链段溶于有机溶剂内，并加入步骤(3‐1)内进行反应，得到含氨基保护基团的嵌段聚合物，其结构式为：

(3‐3)、在步骤(3‐2)内加入脱保护剂进行反应，得到第二粗产物；将第二粗产物透析、干燥，得到生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽，其结构式为：

优选地，氨基保护基团选自苄氧基羰基和叔丁氧基羰基中的任意一种。

优选地，疏水性高分子的环状单体选自己内酯、丙交酯、乙交酯和三亚甲基碳酸酯中的任意一种或几种。

优选地，亲水性氨基酸聚合的引发剂选自异丁胺、正丁胺、异丙胺、丙胺和苯胺中的任意一种。

优选地，含氨基保护基团的疏水性高分子聚合的引发剂选自叔丁氧基羰基-氨基乙醇和叔丁氧基羰基-氨基丙醇中的任意一种。

优选地，脱保护剂选自含25wt％氯化氢的甲醇溶液、含33wt％氢溴酸的乙醇溶液、三氟乙酸和含30wt％氢溴酸的乙酸溶液中的任意一种。

优选地，沉淀剂选自水、正己烷、丙酮、甲醇和乙醇中的任意一种或几种。

优选地，有机溶剂选自四氢呋喃、n,n‐二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲苯、丙酮和二甲基亚砜中的任意一种或几种。

优选地，亲水性氨基酸与三光气的摩尔比为2‐2.3:1。

优选地，亲水性氨基酸聚合的引发剂与含氨基保护基团的亲水性氨基酸‐n‐羧基‐α‐氨基酸酐单体的摩尔比为1:1‐100。

优选地，含氨基保护基团的疏水性高分子聚合的引发剂与疏水性高分子的环状单体的摩尔比为1:1‐100。

优选地，步骤(1‐1)的反应的温度为40‐60℃，反应的时间为3‐6h。

优选地，步骤(1‐2)的反应的温度为20‐35℃，反应的时间为10‐16h。

优选地，步骤(2‐1)的反应的温度为90‐120℃，反应的时间为32‐48h。

优选地，步骤(2‐2)的反应的温度为20‐35℃，反应的时间为2‐6h。

优选地，步骤(3‐1)的反应的温度为10‐30℃，反应的时间为0.5‐1h。

优选地，步骤(3‐2)的反应的温度为10‐30℃，反应的时间为0.5‐1h。

优选地，步骤(3‐3)的反应的温度为20‐35℃，反应的时间为2‐6h。

一种类抗菌肽囊泡，其由上述的生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽自组装而成。

一种上述的类抗菌肽囊泡的制备方法，其包括如下步骤：

(a)、将生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽

溶于有机溶剂内，得到悬浊液；

(b)、在悬浊液里滴加去离子水，搅拌，透析，得到类抗菌肽囊泡。

优选地，步骤(a)中，有机溶剂选自四氢呋喃、二甲基亚砜、n,n‐二甲基甲酰胺、二氯甲烷和丙酮中的任意一种或几种。

优选地，步骤(a)中，悬浊液的浓度为1‐100mg/ml。

优选地，步骤(b)中，透析的时间为12‐24h。

一种上述的类抗菌肽囊泡作为抗菌剂或药物载体在临床抗炎症、抗癌药物靶向释放或纳米医学方面中的应用。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

第一、本发明制备的类抗菌肽囊泡选用了生物可降解的疏水性高分子链段代替了抗菌肽中的疏水性氨基酸链段，因此没有细胞毒性，且具有优异的生物相容性和生物可降解性。

第二、本发明制备的类抗菌肽囊泡具有优异的广谱抗菌性能，与天然抗菌肽类似的膜破坏抗菌机理相同，均不易诱导细菌产生耐药性。

第三、本发明制备的类抗菌肽囊泡能够在水中形成稳定的组装体，可以作为抗菌剂或药物载体在临床抗炎症、抗癌药物靶向释放或纳米医学方面得以应用。

第四、本发明制备的类抗菌肽囊泡的结构可控、合成步骤简便、成本低廉，且能够实现产业化生产。

附图说明

图1为本发明的类抗菌肽囊泡(polylys20‐hdi‐pcl16和polylys11‐hdi‐pcl16)的粒径和粒子多分散性指数(pdi)图，横轴为流体力学直径(hydrodynamicdiameter，nm)。

图2为本发明的实施例1的类抗菌肽囊泡polylys20‐hdi‐pcl16的透射电镜(tem)图。

图3为本发明的实施例2的类抗菌肽囊泡polylys11‐hdi‐pcl16的透射电镜(tem)图。

具体实施方式

本发明提供了一种生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽的合成及类抗菌肽囊泡的制备方法和应用。

<生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽>

一种生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽，其由含氨基保护基团的亲水性多肽链段和一端氨基封端的疏水性高分子链段通过与二异氰酸酯单元的异氰酸根形成共价键相连制成，其结构式如下：

其中，x选自1‐100中的整数，y选自1‐100中的整数，x和y分别代表各链段的聚合度，r1表示亲水性氨基酸的亲水基团，r2表示二异氰酸酯的烷烃链段，r3表示生物可降解的疏水性高分子的重复单元，a表示亲水性氨基酸聚合的引发剂，a’表示疏水性高分子聚合的引发剂。

(亲水性氨基酸)

亲水性氨基酸可以选自赖氨酸(lys)、精氨酸和组氨酸中的任意一种，亲水性氨基酸的亲水基团可以为精氨酸的胍基、赖氨酸的氨基和组氨酸的咪唑基。

其中，本发明的含氨基保护基团的亲水性氨基酸优选为苄氧基羰基-赖氨酸。

(二异氰酸酯)

二异氰酸酯可以选自六亚甲基二异氰酸酯(hdi)、二甲苯烷二异氰酸酯(mdi)、对苯二亚甲基二异氰酸酯(xdi)和对苯二异氰酸酯(ppdi)中的任意一种。

(疏水性高分子)

疏水性高分子可以选自聚己内酯(pcl)、聚乳酸(pla)、聚羟基乙酸(pga)和聚三亚甲基碳酸酯(ptmc)中的任意一种或几种。

实际上，上述类抗菌肽与天然阳离子型抗菌肽的结构相似，故其抗菌机理也与天然阳离子型抗菌肽相似，均是膜破坏型抗菌机理。上述类抗菌肽的亲水链段上的正电荷与带有负电荷的细菌细胞膜产生静电吸附作用，疏水链段插入细胞膜内部，破坏膜的完整性，导致细胞膜内的细胞内容物外泄，最终引起细菌死亡。上述类抗菌肽用作抗菌剂时，也不易诱导细菌产生耐药性。

<生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽的制备方法>

一种上述的生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽的制备方法，其包括如下步骤：

(1)、含氨基保护基团的亲水性多肽链段的制备：

(1‐1)、将含氨基保护基团的亲水性氨基酸和三光气在有机溶剂中反应，得到含氨基保护基团的亲水性氨基酸‐n‐羧基‐α‐氨基酸酐单体，其结构式为：

其中，r1表示亲水性氨基酸的亲水基团，z’表示氨基保护基团；

(1‐2)、将含氨基保护基团的亲水性氨基酸‐n‐羧基‐α‐氨基酸酐单体和亲水性氨基酸聚合的引发剂溶于有机溶剂中，并在真空下反应，得到含氨基保护基团的亲水性多肽链段，其结构式为：

其中，a表示亲水性氨基酸聚合的引发剂；

(2)、一端氨基封端的疏水性高分子链段的制备：

(2‐1)、将疏水性高分子的环状单体、催化剂、含氨基保护基团的疏水性高分子聚合的引发剂溶于有机溶剂中，并在氮气保护下反应，得到含氨基保护基团的疏水性高分子链段，其结构式为：

其中，r3表示生物可降解的疏水性高分子的重复单元，a’表示疏水性高分子聚合的引发剂，z’表示氨基保护基团；

(2‐2)、在含氨基保护基团的疏水性高分子链段内加入脱保护剂进行反应，得到第一反应液；在第一反应液内加入沉淀剂，取沉淀物作为第一粗产物；将第一粗产物洗涤、干燥，得到一端氨基封端的疏水性高分子链段，其结构式为：

(3)、生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽的制备：

(3‐1)、将步骤(1)的含氨基保护基团的亲水性多肽链段和过量(即为上述亲水性多肽链段物质的量的4‐10倍)的二异氰酸酯在有机溶剂中反应，得到第二反应液；在第二反应液内加入正己烷，除去过量的未反应的二异氰酸酯，纯化得到：

其中，r2表示二异氰酸酯的烷烃链段；

(3‐2)、将步骤(2)的一端氨基封端的疏水性高分子链段溶于有机溶剂内，并加入步骤(3‐1)内进行反应，得到含氨基保护基团的嵌段聚合物，其结构式为：

(3‐3)、在步骤(3‐2)内加入脱保护剂进行反应，得到第二粗产物；将第二粗产物透析、干燥，得到生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽，其结构式为：

其中，在步骤(1‐1)中，反应的温度可以为40‐60℃，优选为50℃；反应的时间可以为3‐6h，优选为5h。

在步骤(1‐2)中，反应的温度可以为20‐35℃，优选为25℃；反应的时间可以为10‐16h，优选为12h。

在步骤(2‐1)中，反应的温度可以为90‐120℃，优选为110℃；反应的时间可以为32‐48h，优选为48h。

在步骤(2‐2)中，反应的温度可以为20‐35℃，优选为25℃；反应的时间可以为2‐6h，优选为3h。

在步骤(3‐1)中，反应的温度可以为10‐30℃，优选为20℃；反应的时间可以为0.5‐1h，优选为40min。

在步骤(3‐2)中，反应的温度可以为10‐30℃，优选为20℃；反应的时间可以为0.5‐1h，优选为40min。

在步骤(3‐3)中，反应的温度可以为20‐35℃，优选为25℃；反应的时间可以为2‐6h，优选为4h。

(氨基保护基团)

氨基保护基团可以选自苄氧基羰基(cbz)和叔丁氧基羰基(boc)中的任意一种。

(疏水性高分子的环状单体)

疏水性高分子的环状单体可以选自己内酯、丙交酯、乙交酯和三亚甲基碳酸酯中的任意一种或几种。

(亲水性氨基酸聚合的引发剂)

亲水性氨基酸聚合的引发剂可以选自异丁胺、正丁胺、异丙胺、丙胺和苯胺中的任意一种。

(含氨基保护基团的疏水性高分子聚合的引发剂)

含氨基保护基团的疏水性高分子聚合的引发剂可以选自叔丁氧基羰基(boc)-氨基乙醇和叔丁氧基羰基(boc)-氨基丙醇中的任意一种。

(脱保护剂)

脱保护剂可以选自含25wt％氯化氢(hcl)的甲醇溶液、含33wt％氢溴酸(hbr)的乙醇溶液、三氟乙酸和含30wt％氢溴酸(hbr)的乙酸溶液中的任意一种。

(沉淀剂)

沉淀剂可以选自水、正己烷、丙酮、甲醇和乙醇中的任意一种或几种。

(有机溶剂)

有机溶剂可以选自四氢呋喃(thf)、n,n‐二甲基甲酰胺(dmf)、二氯甲烷(dcm)、甲苯、丙酮和二甲基亚砜(dmso)中的任意一种或几种。

亲水性氨基酸与三光气的摩尔比可以为2‐2.3:1，优选为2:1。

亲水性氨基酸聚合的引发剂与含氨基保护基团的亲水性氨基酸‐n‐羧基‐α‐氨基酸酐单体的摩尔比可以为1:1‐100，优选为1:23。

含氨基保护基团的疏水性高分子聚合的引发剂与疏水性高分子的环状单体的摩尔比可以为1:1‐100，优选为1:20。

<类抗菌肽囊泡>

一种类抗菌肽囊泡，其由上述的生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽自组装而成。

<类抗菌肽囊泡的制备方法>

一种上述的类抗菌肽囊泡的制备方法，其包括如下步骤：

(a)、将生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽

溶于有机溶剂内，得到悬浊液；

(b)、在悬浊液里滴加去离子水，过夜搅拌，透析，得到类抗菌肽囊泡。

其中，在步骤(a)中，有机溶剂可以选自四氢呋喃(thf)、二甲基亚砜(dmso)、n,n‐二甲基甲酰胺(dmf)、二氯甲烷(dcm)和丙酮中的任意一种或几种。

悬浊液的浓度可以为1‐100mg/ml，优选为5mg/ml。

在步骤(b)中，透析的时间可以为12‐24h，优选为24h。

<类抗菌肽囊泡的应用>

一种上述的类抗菌肽囊泡可以作为抗菌剂在临床抗炎症、抗癌药物靶向释放或纳米医学等方面得以应用。

一种上述的类抗菌肽囊泡也可以作为药物载体在临床抗炎症、抗癌药物靶向释放或纳米医学等方面得以应用。

实际上，本发明选用由n‐羧基‐α‐氨基酸酐(n‐carboxy‐α‐anhydride，nca)开环聚合而成的赖氨酸(lysine)、端氨基聚己内酯(pcl)和六亚甲基二异氰酸酯(hdi)通过偶联反应制备得到上述两亲性嵌段共聚类抗菌肽。其中，亲水氨基酸(赖氨酸)链段带有大量正电荷，与负电荷的细菌磷脂双分子层产生静电作用而吸附在细胞膜上，同时疏水性高分子(聚己内酯)链段插入磷脂双分子层内，破坏细胞膜的完整性从而达到杀菌抑菌的目的，由于聚己内酯是应用广泛的生物可降解且生物相容性优良的高分子，其比含有苯环等结构的疏水性氨基酸链段毒性低。因此，本发明制备的上述两亲性嵌段共聚类抗菌肽无细胞毒性、生物可降解且能形成稳定的组装体，即组装为类抗菌肽囊泡，作为抗菌剂或药物载体在临床抗炎症、抗癌药物靶向释放或纳米医学等方面都具有广泛的应用前景。

以下结合附图所示实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：

本实施例的生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽的合成及类抗菌肽囊泡的制备方法，其包括如下步骤：

(1)将20.000g(71.428mmol)苄氧羰基‐赖氨酸和10.598g(35.714mmol)三光气加入200ml四氢呋喃中，反应温度为50℃，且反应5h，得到苄氧羰基‐赖氨酸‐n‐羧基‐α‐氨基酸酐单体，其结构式为：

(2)将30.475mg(0.417mmol)异丁胺(作为引发剂)、3.000g(9.804mmol)苄氧羰基‐赖氨酸‐n‐羧基‐α‐氨基酸酐单体溶解于20ml二甲基亚砜中，在25℃下抽真空反应12h，得到聚(苄氧羰基‐赖氨酸)，其结构式为：

(3)将2.121g(13.158mmol)叔丁氧羰基(boc)‐氨基乙醇(作为引发剂)、30.00g(263.16mmol)己内酯加入100ml甲苯中，加入2滴辛酸亚锡(作为催化剂)，并在体系中通入氮气保护，在110℃下反应48h，得到混合液；在混合液内滴入1000ml甲醇沉淀得到粗产物，将粗产物过滤、洗涤、干燥，得到叔丁氧羰基保护的端氨基聚己内酯，其结构式为：

(4)将叔丁氧羰基保护的端氨基聚己内酯溶于20ml丙酮中，加入50ml含25wt％氯化氢(hcl)的甲醇溶液(作为脱保护剂)，25℃下搅拌反应3h；真空下旋转蒸发反应液中的溶剂，用水沉淀出脱保护后的粗产物，并且多次洗涤至粗产物呈中性，过滤、干燥得到一端氨基封端的聚己内酯，其结构式为：

(5)将2.73g步骤(2)所得聚(苄氧羰基‐赖氨酸)溶解于20ml二甲基亚砜中，完全溶解后加入10倍于聚(苄氧羰基‐赖氨酸)物质的量的六亚甲基二异氰酸酯(0.86g)，20℃下反应40min；然后加入大量(约100ml)正己烷(作为萃取剂)萃取未反应的六亚甲基二异氰酸酯，静置后将上层正己烷倾倒，重复5次萃取操作；30℃下旋蒸30min除去残留微量正己烷，得到纯净的反应液，其结构式为：

(6)将1.40g步骤(4)所得一端氨基封端的聚己内酯溶于二甲基亚砜中，完全溶解后加入步骤(5)所得反应液中，20℃下反应40min，得到混合液；在所得混合液内加入1000ml水沉淀得到粗产物，将粗产物过滤、洗涤、干燥得到聚(苄氧羰基‐赖氨酸)‐六亚甲基二异氰酸酯‐聚己内酯嵌段聚合物，其结构式为：

(7)向步骤(6)所得聚(苄氧羰基‐赖氨酸)‐六亚甲基二异氰酸酯‐聚己内酯嵌段聚合物中加入含30wt％hbr的乙酸溶液(作为脱保护剂)，25℃下搅拌反应4h；然后真空下50℃旋转蒸发除去反应体系中的二甲基亚砜，再用碳酸氢钠调节ph值至弱酸性，最后将粗产物置于透析袋(截留分子量为3500)中透析48h，在冷冻干燥机中冻干，得到聚赖氨酸‐六亚甲基二异氰酸酯‐聚己内酯类抗菌肽(polylys20‐hdi‐pcl16)，其结构式为：

(8)将5.5mg步骤(7)所得聚赖氨酸‐六亚甲基二异氰酸酯‐聚己内酯类抗菌肽(polylys20‐hdi‐pcl16)溶于1ml四氢呋喃中，完全溶解后在悬浊液中逐滴缓慢加入5.5mg去离子水，10min内滴加完毕，滴加完毕后过夜搅拌，然后用截留分子量为3500的透析袋透析24h除去四氢呋喃，期间每2h换一次水，得到类抗菌肽囊泡polylys20‐hdi‐pcl16。

实际上，在步骤(1‐1)中，反应的温度在40‐60℃之内、反应的时间在3‐6h之内均是可以的。

在步骤(1‐2)中，反应的温度在20‐35℃之内、反应的时间在10‐16h之内均是可以的。

在步骤(2‐1)中，反应的温度在90‐120℃之内、反应的时间在32‐48h之内均是可以的。

在步骤(2‐2)中，反应的温度在20‐35℃之内、反应的时间在2‐6h之内均是可以的。

在步骤(3‐1)中，反应的温度在10‐30℃之内、反应的时间在0.5‐1h之内均是可以的。

在步骤(3‐2)中，反应的温度在10‐30℃之内、反应的时间在0.5‐1h之内均是可以的。

在步骤(3‐3)中，反应的温度在20‐35℃之内、反应的时间在2‐6h之内均是可以的。

实施例2：

本实施例的生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽的合成及类抗菌肽囊泡的制备方法，其包括如下步骤：

(1)将10.000g(35.714mmol)苄氧羰基‐赖氨酸和5.299g(17.857mmol)三光气加入100ml四氢呋喃中，反应温度为50℃，且反应5h，得到苄氧羰基‐赖氨酸‐n‐羧基‐α‐氨基酸酐单体，其结构式为：

(2)将92.348mg(1.263mmol)异丁胺(作为引发剂)、5.000g(16.340mmol)苄氧羰基‐赖氨酸‐n‐羧基‐α‐氨基酸酐单体溶解于20ml二甲基亚砜中，在20℃下抽真空反应12h，得到聚(苄氧羰基‐赖氨酸)，其结构式为：

(3)将2.121g(13.158mmol)叔丁氧羰基(boc)‐氨基乙醇(作为引发剂)、30.00g(263.16mmol)己内酯加入100ml甲苯中，加入2滴辛酸亚锡(作为催化剂)，并在体系中通入氮气保护，在110℃下反应48h，得到混合液；在混合液内滴入1000ml甲醇沉淀得到粗产物，将粗产物过滤、洗涤、干燥，得到叔丁氧羰基保护的端氨基聚己内酯，其结构式为：

(4)将叔丁氧羰基保护的端氨基聚己内酯溶于20ml丙酮中，加入50ml含25wt％氯化氢(hcl)的甲醇溶液(作为脱保护剂)，20℃下搅拌反应3h；真空下旋转蒸发反应液中的溶剂，用水沉淀出脱保护后的粗产物，并且多次洗涤至粗产物呈中性，过滤、干燥得到一端氨基封端的聚己内酯，其结构式为：

(5)将3.20g步骤(2)所得聚(苄氧羰基‐赖氨酸)溶解于20ml二甲基亚砜中，完全溶解后加入10倍于聚(苄氧羰基‐赖氨酸)物质的量的六亚甲基二异氰酸酯(1.82g)，30℃下反应40min；然后加入大量(约100ml)正己烷(作为萃取剂)萃取未反应的六亚甲基二异氰酸酯，静置后将上层正己烷倾倒，重复5次萃取操作；30℃下旋蒸30min除去残留微量正己烷，得到纯净的反应液，其结构式为：

(6)将2.10g步骤(4)所得一端氨基封端的聚己内酯溶于二甲基亚砜中，完全溶解后加入步骤(5)所得反应液中，25℃下反应40min，得到混合液；在所得混合液内加入1000ml水沉淀得到粗产物，将粗产物过滤、洗涤、干燥得到聚(苄氧羰基‐赖氨酸)‐六亚甲基二异氰酸酯‐聚己内酯嵌段聚合物，其结构式为：

(7)向步骤(6)所得聚(苄氧羰基‐赖氨酸)‐六亚甲基二异氰酸酯‐聚己内酯嵌段聚合物中加入含30wt％hbr的乙酸溶液(作为脱保护剂)，20℃下搅拌反应5h；然后真空下50℃旋转蒸发除去反应体系中的二甲基亚砜，再用碳酸氢钠调节ph值至弱酸性，最后将粗产物置于透析袋(截留分子量为3500)中透析48h，在冷冻干燥机中冻干，得到聚赖氨酸‐六亚甲基二异氰酸酯‐聚己内酯类抗菌肽(polylys11‐hdi‐pcl16)，其结构式为：

(8)将5.5mg步骤(7)所得聚赖氨酸‐六亚甲基二异氰酸酯‐聚己内酯类抗菌肽(polylys11‐hdi‐pcl16)溶于1ml四氢呋喃中，完全溶解后在悬浊液中逐滴缓慢加入5.5mg去离子水，10min内滴加完毕，滴加完毕后过夜搅拌，然后用截留分子量为3500的透析袋透析24h除去四氢呋喃，期间每2h换一次水，得到类抗菌肽囊泡polylys11‐hdi‐pcl16。

实施例3：

本实施例的生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽的合成及类抗菌肽囊泡的制备方法，其包括如下步骤：

(1)将10.000g(35.714mmol)苄氧羰基‐赖氨酸和5.299g(17.857mmol)三光气加入100ml四氢呋喃中，反应温度为50℃，且反应5h，得到苄氧羰基‐赖氨酸‐n‐羧基‐α‐氨基酸酐单体，其结构式为：

(2)将20.317mg(0.278mmol)异丁胺(作为引发剂)、3.000g(9.804mmol)苄氧羰基‐赖氨酸‐n‐羧基‐α‐氨基酸酐单体溶解于20ml二甲基亚砜中，在30℃下抽真空反应12h，得到聚(苄氧羰基‐赖氨酸)，其结构式为：

(3)将2.121g(13.158mmol)叔丁氧羰基(boc)‐氨基乙醇(作为引发剂)、30.00g(263.16mmol)己内酯加入100ml甲苯中，加入2滴辛酸亚锡(作为催化剂)，并在体系中通入氮气保护，在110℃下反应48h，得到混合液；在混合液内滴入1000ml甲醇沉淀得到粗产物，将粗产物过滤、洗涤、干燥，得到叔丁氧羰基保护的端氨基聚己内酯，其结构式为：

(4)将叔丁氧羰基保护的端氨基聚己内酯溶于20ml丙酮中，加入50ml含25wt％氯化氢(hcl)的甲醇溶液(作为脱保护剂)，30℃下搅拌反应3h；真空下旋转蒸发反应液中的溶剂，用水沉淀出脱保护后的粗产物，并且多次洗涤至粗产物呈中性，过滤、干燥得到一端氨基封端的聚己内酯，其结构式为：

(5)将3.71g步骤(2)所得聚(苄氧羰基‐赖氨酸)溶解于20ml二甲基亚砜中，完全溶解后加入10倍于聚(苄氧羰基‐赖氨酸)物质的量的六亚甲基二异氰酸酯(0.79g)，25℃下反应40min；然后加入大量(约100ml)正己烷(作为萃取剂)萃取未反应的六亚甲基二异氰酸酯，静置后将上层正己烷倾倒，重复5次萃取操作；30℃下旋蒸30min除去残留微量正己烷，得到纯净的反应液，其结构式为：

(6)将0.89g步骤(4)所得一端氨基封端的聚己内酯溶于二甲基亚砜中，完全溶解后加入步骤(5)所得反应液中，25℃下反应40min，得到混合液；在所得混合液内加入1000ml水沉淀得到粗产物，将粗产物过滤、洗涤、干燥得到聚(苄氧羰基‐赖氨酸)‐六亚甲基二异氰酸酯‐聚己内酯嵌段聚合物，其结构式为：

(7)向步骤(6)所得聚(苄氧羰基‐赖氨酸)‐六亚甲基二异氰酸酯‐聚己内酯嵌段聚合物中加入含30wt％hbr的乙酸溶液(作为脱保护剂)，20℃下搅拌反应5h；然后真空下50℃旋转蒸发除去反应体系中的二甲基亚砜，再用碳酸氢钠调节ph值至弱酸性，最后将粗产物置于透析袋(截留分子量为3500)中透析48h，在冷冻干燥机中冻干，得到聚赖氨酸‐六亚甲基二异氰酸酯‐聚己内酯类抗菌肽(polylys30‐hdi‐pcl16)，其结构式为：

(8)将5.5mg步骤(7)所得聚赖氨酸‐六亚甲基二异氰酸酯‐聚己内酯类抗菌肽(polylys30‐hdi‐pcl16)溶于1ml四氢呋喃中，完全溶解后在悬浊液中逐滴缓慢加入5.5mg去离子水，10min内滴加完毕，滴加完毕后过夜搅拌，然后用截留分子量为3500的透析袋透析24h除去四氢呋喃，期间每2h换一次水，得到类抗菌肽囊泡polylys30‐hdi‐pcl16。

<实验>

以上述实施例1和实施例2的生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽囊泡作为产品分别进行如下实验。

<实验1>

本实验是为了验证生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽囊泡(polylys20‐hdi‐pcl16与polylys11‐hdi‐pcl16)在革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)中的抗菌性能。

其中，最小抑菌浓度(mic)是评估抗菌剂抗菌性能的重要参数。本实验分别使用革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)来测定生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽囊泡的抗菌性能。

实验步骤如下：

(1)分别取1ml活化好的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，用生理盐水除去lb肉骨头汤，并将大肠杆菌的菌种和金黄色葡萄球菌的菌种分别加入在1ml生理盐水中混合均匀，为方便涂板时的菌落计数，将细菌液用十倍稀释法稀释10⁵倍；

(2)配置浓度为1000μg/ml的类抗菌肽溶液，用对半稀释法得到不同浓度的类抗菌肽溶液，浓度依次为1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/m、8μg/ml、4μg/ml；各取100μl置于1ml离心管中；

(3)向步骤(2)中每一个离心管中加入100μl稀释后的细菌液(大肠杆菌或金黄色葡萄球菌)，类抗菌肽浓度变为500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml，在37℃的恒温条件下培养2h，同样条件培养未加入类抗菌肽的纯细菌作为对照样；

(4)在培养皿中加入100μl不同浓度的混合液，加入温热的10ml琼脂溶液，摇晃均匀后待琼脂凝固将培养皿倒扣，置于37℃恒温条件下培养18h后进行菌落计数，观察抑制细菌生长的最低类抗菌肽浓度。

通过上述实验，得到如下实验结果：

类抗菌肽囊泡polylys20‐hdi‐pcl16与大肠杆菌作用(实验组)后，相比于未加入类抗菌肽囊泡polylys20‐hdi‐pcl16的纯大肠杆菌(对照组)的菌落密集程度得到降低，说明类抗菌肽囊泡polylys20‐hdi‐pcl16能够有效抑制大肠杆菌的生长，在4μg/ml的浓度下，实验组的菌落数仍小于对照组菌落数的一半。在有效的抑菌浓度范围内，随着类抗菌肽囊泡polylys20‐hdi‐pcl16的浓度增加，实验组培养皿内菌落数明显减少，特别在125‐500μg/ml的浓度下无大肠杆菌的菌落生长。

类抗菌肽囊泡polylys20‐hdi‐pcl16与金黄色葡萄球菌作用(实验组)后，相比于未加入类抗菌肽囊泡polylys20‐hdi‐pcl16的纯金黄色葡萄球菌(对照组)的菌落密集程度得到降低，说明类抗菌肽囊泡polylys20‐hdi‐pcl16能够有效抑制金黄色葡萄球菌的生长，在8μg/ml的浓度下，实验组的菌落数仍小于对照组菌落数的一半。在有效的抑菌浓度范围内，随着类抗菌肽囊泡polylys20‐hdi‐pcl16的浓度增加，实验组培养皿内菌落数明显减少，特别在250‐500μg/ml的浓度下无金黄色葡萄球菌菌落生长。

类抗菌肽囊泡polylys11‐hdi‐pcl16与大肠杆菌作用(实验组)后，相比于未加入类抗菌肽囊泡polylys11‐hdi‐pcl16的纯大肠杆菌(对照组)的菌落密集程度得到降低，说明类抗菌肽囊泡polylys11‐hdi‐pcl16能够有效抑制大肠杆菌的生长，在32μg/ml的浓度下，实验组的菌落数仍小于对照组菌落数的一半。在有效的抑菌浓度范围内，随着类抗菌肽囊泡polylys11‐hdi‐pcl16的浓度增加，实验组培养皿内菌落数明显减少，浓度增加至500μg/ml时无大肠杆菌菌落生长。

类抗菌肽囊泡polylys11‐hdi‐pcl16与金黄色葡萄球菌作用(实验组)后，相比于未加入类抗菌肽囊泡polylys11‐hdi‐pcl16的纯金黄色葡萄球菌(对照组)的菌落密集程度得到降低，说明类抗菌肽囊泡polylys11‐hdi‐pcl16能够有效抑制金黄色葡萄球菌的生长，在32μg/ml的浓度下，实验组菌落数仍小于对照组菌落数的一半。在有效的抑菌浓度范围内，随着类抗菌肽囊泡polylys11‐hdi‐pcl16的浓度增加，实验组培养皿内菌落数明显减少，浓度增加至500μg/ml时无金黄色葡萄球菌菌落生长。

根据上述实验结果，分别计算类抗菌肽囊泡polylys20‐hdi‐pcl16与类抗菌肽囊泡polylys11‐hdi‐pcl16在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌中的最低抑菌浓度(mic)值，本实验中最小抑菌浓度指培养皿中菌落数小于对照组菌落数一半的类抗菌肽最低添加浓度，上述mic值如表1所示：

表1：polylys20‐hdi‐pcl16与polylys11‐hdi‐pcl16的最低抑菌浓度(mic)

从表1中可以看出，本发明制备的生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽囊泡(polylys20‐hdi‐pcl16与polylys11‐hdi‐pcl16)具有优异的抑菌杀菌效果，且对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)以及金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)均具有良好的抗菌效果，因此，本发明制备的生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽囊泡具有优异的广谱抗菌性能。

<实验2>

本实验是为了验证生物可降解的两亲性嵌段共聚类抗菌肽囊泡(polylys20‐hdi‐pcl16与polylys11‐hdi‐pcl16)的组装情况。

囊泡的粒径及粒径分布情况是组装体性能的重要参数，粒径分布情况用粒子多分散性指数pdi(polydispersedindex)表示，当pdi值小于0.3时，则表示组装体的粒径分散均匀。采用动态光散射测试来测试类抗菌肽囊泡的粒径和粒子多分散性指数pdi。

实验步骤如下：将已经组装好的类抗菌肽囊泡(polylys20‐hdi‐pcl16与polylys11‐hdi‐pcl16)溶液分别各取1.5ml放入玻璃皿中，然后放入zetasizernano系列纳米粒度和zeta电位仪中进行动态光散射测试。

类抗菌肽囊泡polylysx‐hdi‐pcly(x＝20、11，y＝16)的粒径和粒子多分散性指数pdi的值如图1所示，其中(a)x＝20，y＝16；(b)x＝11，y＝16。

从图1可以看出，类抗菌肽囊泡的粒径在80‐400nm之间，pdi值均小于0.3，说明本发明制备的类抗菌肽囊泡的粒径均匀，分散性良好。

类抗菌肽囊泡的透射电镜形貌图进一步验证上述囊泡的组装情况，其实验步骤如下：

研究人员将类抗菌肽囊泡溶液在室温下稀释至150μg/ml，取3μl滴在铜网上，在室温下干燥后用磷钨酸(pta，1.0wt％)溶液进行染色。取一滴pta溶液滴在疏水膜上，将铜网已装载样品的一面放置在pta液滴顶端，浸润1min，用滤纸吸附多余的pta溶液后，将铜网在室温下干燥一夜，即可进行透射电子显微镜测试。

类抗菌肽囊泡polylys20‐hdi‐pcl16的透射电镜图如图2所示，类抗菌肽囊泡polylys11‐hdi‐pcl16的透射电镜图如图3所示，且由图2和图3可知，类抗菌肽囊泡(polylys20‐hdi‐pcl16与polylys11‐hdi‐pcl16)在水溶液中成功组装成为囊泡。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。