本发明属于细胞工程与免疫学领域，具体涉及一株猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞csfv-3h3g6及基于抗体3h3g6的猪瘟病毒间接免疫荧光检测试剂盒。
背景技术：
猪瘟（classicalswinefever，csf）是由猪瘟病毒（classicalswinefevervirus，csfv）引起的一种高度接触性传染病，以发热和出血为主要特征，该病流行广泛，发病率和死亡率高。给养猪业造成了严重的经济损失，oie将其列为必须呈报的传染病。现阶段csf仍然是对全球养猪业威胁最大的疾病。在我国，猪瘟的危害也十分严重，是我国猪的四大疫病之一。
猪瘟病毒是黄病毒科瘟病毒属的重要成员之一，基因组为单股正链rna，长约12.3kb，编码一个多聚蛋白，经后期的剪切加工形成4个成熟的结构蛋白（c、e0、e1、e2）和8个成熟的非结构蛋白（npro、p7、ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b）。猪瘟病毒囊膜e2蛋白是诱导机体产生特异性抗体的主要蛋白，也是研究猪瘟亚单位疫苗，标记疫苗和检测方法的主要的目标蛋白。
e2是csfv的主要保护性抗原蛋白。其在猪瘟病毒多聚蛋白上的位置始于氨基酸残基690，终止于氨基酸残基1060，编码370个氨基酸。常以二聚体形式存在于病毒粒子及csfv感染的细胞表面，其二聚体包括分子量为100kda的同源二聚体及与e1形成的分子量为75kda的异源二聚体。在体外e2可诱导产生病毒的中和抗体，体内可诱导抗csfv的保护性免疫，保护猪抵抗致死量csfv的攻击。e2是3个病毒糖蛋白中保守性最低，最易变异的分子。利用单克隆抗体竞争结合和抗原捕捉实验对e2蛋白的抗原结构分析的结果表明，e2蛋白上存在4个抗原区，即a、b、c、d，所有这4个区均位于e2蛋白n端氨基酸残基690~866之间，是e2蛋白最具抗原性的部分。e2携带有能刺激csfv中和抗体产生的抗原决定簇，参与病毒感染过程，诱导中和抗体产生。缺乏e2的csfv不能诱导机体产生中和抗体。
elisa检测分析感染猪血清中的csfv抗体，该方法操作简便、诊断快速，常用于规模化养猪场的猪瘟监测。间接免疫荧光法简便、快速、检出率较高，许多国家和地区己将该法作为执行消灭csf规划的法定诊断方法，也是我国实验室诊断csf的最常用方法之一。单克隆抗体不仅可用于猪瘟病毒与牛病毒性腹泻粘膜病病毒之间的鉴别，也可用于猪瘟强毒株与弱毒株之间的鉴别，这对csf的诊断具有重要意义和实用价值。csfv与同属的bvdv、bdv存在较强的交叉免疫反应，能互相诱导一定程度的同源病毒抗体。国外研制的对猪瘟病毒、瘟病毒属其它病毒特异的单克隆抗体，结合elisa方法和免疫荧光检测方法可以准确检测猪瘟病毒在猪体内的感染情况，并与感染其它病毒区分开来。
技术实现要素：
为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种分泌猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株csfv-3h3g6，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体3h3g6，以及该杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体在免疫检测领域的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一株表达猪瘟病毒e2蛋白3h3g6单克隆抗体杂交瘤细胞系csfv-3h3g6，由如下方法制得：
（1）重组猪瘟病毒e2抗原制备：
将猪瘟病毒e2蛋白与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂充分混合，制成重组猪瘟病毒e2抗原；
（2）免疫小鼠和融合：
将步骤（1）制备的重组猪瘟病毒e2抗原免疫雌性balb/c小鼠；
第一次免疫：取重组猪瘟病毒e2抗原与等体积的弗氏完全佐剂混匀后，腹腔注射balb/c小鼠；
第二次免疫：首免2周后，取重组猪瘟病毒e2抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混匀后，多点皮下注射balb/c小鼠；
第三次免疫：二免2周后，取重组猪瘟病毒e2抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混匀后，腹腔注射balb/c小鼠；第三次免疫10天后小鼠尾静脉取血，以重组抗原包被，elisa检测血清效价，取效价大于1:105的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合；用含20%小牛血清的hatrpmi-1640培养基筛选融合细胞；
（3）筛选分泌猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞
间接elisa法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100%细胞阳性率，筛选到5株能获得稳定分泌抗猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体细胞株，将5株细胞表达的抗体分别跟猪瘟标准强毒石门株及多株野毒株和猪瘟兔弱毒疫苗株反应，得到一株仅能与猪瘟标准强毒石门株及野毒株猪瘟野毒结合，但与猪瘟兔化弱毒疫苗株不发生反应的细胞株，标记为csfv-3h3g6。
一种猪瘟病毒e2蛋白的3h3g6单克隆抗体，为上述csfv-3h3g6单克隆细胞株表达。所述单克隆抗体为igg2b的亚型，轻链为κ链。
一种猪瘟病毒间接免疫荧光检测试剂盒，含有上述的猪瘟病毒e2蛋白3h3g6单克隆抗体。
上述猪瘟病毒间接免疫荧光检测试剂盒，含有fitc标记的单克隆抗体3h3g6。
利用上述杂交瘤细胞系csfv-3h3g6表达单克隆抗体的方法，包括如下步骤：无血清培养csfv-3h3g6杂交瘤细胞，收集上清，采用亲和色谱法proteingsepharosefastflow纯化单克隆抗体，并通过sepharoses-200分子筛选脱盐，pbs洗脱，以sds-page测定单克隆抗体纯度，纯度达到99%以上。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1．本发明用哺乳动物细胞表达获得的e2蛋白进行免疫，该蛋白接近病毒蛋白的天然构象与修饰加工，抗原性好，制备的单克隆抗体与天然蛋白亲和力好；
2．本发明提供的间接免疫荧光检测试剂盒，含fitc标记的猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体3h3g6，该抗体能与猪瘟野毒结合，但与猪瘟兔化弱毒疫苗株不发生反应，该试剂盒将在猪瘟疫苗毒株和野毒株的鉴别诊断中发挥重要作用。
附图说明
图1为基于猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体建立猪瘟间接免疫荧光检测结果；
图中，a为感染猪瘟病毒标准强毒石门株的pkwrl细胞3h3g6标记抗体检测结果，b为感染猪瘟病毒标准强毒石门株的pkwrl细胞wh303标记抗体检测结果，c为未感染病毒的pkwrl细胞检测结果。
图2为猪瘟间接免疫荧光检测方法灵敏性评价结果；
图中，a为100倍稀释酶标抗体，b为500倍稀释酶标抗体，c为1000倍稀释酶标抗体，d为2000倍稀释酶标抗体，e为4000倍稀释抗体，f为8000倍稀释抗体，h为阴性对照。
图3为猪瘟间接免疫荧光检测方法特异性评价结果；
图中，a为猪瘟标准强毒石门株病毒感染pkwrl细胞，b为猪瘟兔化弱毒株感染pkwrl细胞，c为牛病毒性腹泻病毒感染的pkwrl细胞，d为猪伪狂犬病毒感染pkwrl细胞，e为猪蓝耳病毒感染的pkwrl细胞，f为猪圆环病毒2型感染的pkwrl细胞，g为猪细小病毒感染的pkwrl细胞。
图4为猪瘟兔化弱毒株与野毒株鉴别诊断结果；
图中，a为猪瘟病毒兔化弱毒株（hclv）感染的pkwrl细胞，b为猪瘟病毒标准强毒石门株(sm)株感染的pkwrl细胞、c为猪瘟病毒gd53-2.1c株感染的pkwrl细胞、d为猪瘟病毒gd176-2.1b株感染的pkwrl细胞、e为猪瘟病毒gd2-2.1c株感染的pkwrl细胞、f为猪瘟病毒gd49-2.1j株感染的pkwrl细胞、g为猪瘟病毒hy-11-2.1h株感染的pkwrl细胞，h为阴性对照pkwrl细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例所涉及的材料及其来源如下所示：
哺乳动物细胞表达的猪瘟病毒e2蛋白由广州伯尼兹生物科技有限公司生产保存；猪瘟兔化弱毒疫苗株及野毒株由军事医学科学院军事兽医研究所提供。牛血清白蛋白和琼脂糖购自amresco公司；二氨基联苯胺购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；二甲基亚砜0.25%胰蛋白酶、dmem培养基及胎牛血清为sigma公司产品。
实施例1.单克隆抗体的制备与鉴定
1、单克隆杂交瘤细胞csfv-3h3g6的制备
1.1重组猪瘟病毒e2抗原制备
哺乳动物细胞表达的猪瘟病毒e2蛋白为广州伯尼兹生物科技有限公司生产保存，与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂充分混合，抗原浓度为100μg/ml。
1.2免疫小鼠
将1.1中制备的免疫原免疫6周龄雌性balb/c小鼠。
第一次免疫：取重组抗原与等体积的弗氏完全佐剂混匀后，以每只50μg/500μl的量腹腔注射balb/c小鼠；
第二次免疫：首免2周后，取重组抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混匀后，以每只50μg/500μl的量多点皮下注射balb/c小鼠；
第三次免疫：二免2周后，取重组抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混匀后，以每只50μg/500μl的量腹腔注射balb/c小鼠；第三次免疫10天后小鼠尾静脉取血，以重组抗原包被，elisa检测血清效价，取效价大于1:105的balb/c小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50%peg-4000进行融合；用含20%小牛血清的hatrpmi-1640培养基筛选融合细胞。
弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均使用商品化产品。
1.3免疫血清效价测定
采用间接elisa法测定免疫血清效价。取100μg重组猪瘟病毒e2蛋白溶解于10ml0.05mph9.6碳酸盐缓冲液，包被96孔酶标板，100μl/孔，4℃过夜。次日，使用pbs（含有0.05%（v/v）tween-20）洗板三次，小鼠于第三次免疫后15天眼眶采血，鼠免疫血清用含1%bsa10mmpbs以10-1-10-8倍稀释，加入96孔板，100μl/孔37℃1h，pbs（含有0.05%（v/v）tween-20）洗板三次后，加入1:1000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠igg二抗，100μl/孔37℃1h，同上洗板后，tmb显色，100μl/孔，室温避光10min，加100μl/孔2mh2so4终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值的比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。
1.4杂交瘤细胞的制备
无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株sp2/0按1:1的比例混合，500×g室温离心5min，弃上清，用手指轻弹离心管底部，使沉淀松散，离心管置于37℃水浴中，缓慢滴入37℃预热的聚乙二醇，边滴边摇离心管，1min内滴完，滴完后静置2min，每隔1min加入37℃预热的无血清1640培养基1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml来终止聚乙二醇的作用，细胞混合物500×g室温离心5min，弃上清，加入hat培养液轻轻重悬细胞，将细胞分至96孔板中，每孔200μl。培养三天后，观察细胞融合情况，更换一半hat培养液，连续数日，直至有克隆形成，更换ht培养液培养一天，更换1640完全培养基。
1.5筛选分泌猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞
间接elisa法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100%细胞阳性率，，筛选到5株能获得稳定分泌抗猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体细胞株，将5株细胞表达的抗体分别跟猪瘟标准强毒石门株及多株野毒株和猪瘟兔弱毒疫苗株反应，得到一株仅能与猪瘟标准强毒石门株及野毒株猪瘟野毒结合，但与猪瘟兔化弱毒疫苗株不发生反应的细胞株，标记为csfv-3h3g6。将克隆化后阳性率达100%的细胞扩增培养后液氮冻存。
2、杂交瘤细胞培养上清制备和纯化
无血清培养csfv-3h3g6杂交瘤细胞，收集上清。采用亲和色谱法proteingsepharosefastflow纯化单克隆抗体，并通过sepharoses-200分子筛脱盐，pbs洗脱，以sds-page测定单克隆抗体的纯度，纯度达到95%以上。
实施例2.单克隆抗体的特性鉴定
1、抗体浓度的测定
经杂交瘤细胞csfv-3h3g6制备的上清经纯化后获得猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体，使用bio-rad公司生产的smartspecplus蛋白测定仪测定，其浓度为0.90mg/ml。
2、抗体亚型鉴定
采用hbt公司的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株的亚型，csfv-3h3g6分泌抗体的亚型为igg2b型，轻链为κ链。
3、纯化抗体的效价鉴定
100μg重组猪瘟病毒e2蛋白溶于10mlph9.6的0.05m碳酸盐包被液缓冲液中，加入96孔板，100μl/孔，4℃包被过夜。pbst洗板三次，用含1%bsa封闭液的pbs150μl/孔，37℃封闭1h；pbst洗板三次后，每孔加入100μl纯化抗体，37℃孵育1h，pbst洗板三次后，加入辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠igg二抗，100μl/孔37℃1h，pbst洗板三次后，tmb显色，100μl/孔，室温避光15min，加100μl/孔2mh2so4终止反应，测450nm吸收值。
实施例3.单克隆抗体的间接免疫荧光试剂盒制备
1.猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体的fitc标记
采用抗体fitc标记试剂盒对猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体进行标记，具体步骤：取43.7μl的modifierregent加入到437μl纯化的e2蛋白内混匀，将混合液体加到装有100μgfitc冻干粉的管内，20℃～25℃避光3h。再加入43.7μl的quencherreagent，混匀后静置30min，然后进行分装，-80℃保存备用。
2.猪瘟病毒间接免疫荧光检测试剂盒在猪瘟病毒检测中的应用
用pkwrl细胞以2×104个/孔的密度铺一块96孔板，于37℃、5%co2培养箱中培养。细胞贴壁12h后将猪瘟病毒稀释后接入96孔板中，每孔100μl，于37℃、5%co2培养箱中培养48h。弃去培养液，pbs洗涤2次，使用预冷的4%多聚甲醛固定细胞，室温固定1h；pbs洗涤2次加入0.1%triton，50μl/孔，透膜15～20min，加入fitc标记的猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体（1:20稀释）、设置商品化的猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体wh303（1:1000稀释，fitc标记）为阳性对照，不接毒的正常细胞为阴性对照。置于37℃温箱中孵育1h，pbs洗涤3次，于荧光显微镜下观察。以荧光强度作为评价指标，如图1所示。
3.间接免疫荧光检测方法敏感性的测定
取单克隆抗体按100、500、1000、2000、4000、8000倍稀释，进行免疫荧光实验，对比产生的荧光强度。结果如图2所示。结果表明，酶标抗体1：4000倍稀释间接免疫荧光检测仍能观察到明显荧光。
4.间接免疫荧光检测方法特异性的测定
取牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒等，猪瘟病毒标准强毒石门株和兔化弱毒株，进行免疫荧光实验，检测单克隆抗体的特异性。结果如图3所示，仅猪瘟病毒标准强毒石门株及野毒株能观察到荧光，而猪瘟兔化弱毒株、牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒均为阴性。
5.间接免疫荧光检测猪瘟兔化弱毒株与野毒株
取猪瘟病毒标准强毒石门株（sm）及野毒株(包括sm、gd53-2.1c、gd176-2.1b、gd2-2.1c、gd49-2.1j、hy-11-2.1h)和兔化弱毒株（hclv），进行免疫荧光实验，检测单克隆抗体的特异性。如图4所示，结果表明猪瘟病毒sm、gd53-2.1c、gd176-2.1b、gd2-2.1c、gd49-2.1j、hy-11-2.1h六株均为免疫荧光检测阳性而猪瘟病毒兔化弱毒株（hclv）未观察到荧光。