一种安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd及其鉴定方法与流程

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，尤其涉及一种安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd及其鉴定方法。

背景技术：

随着全球气候变暖，干旱半干旱区土壤盐渍化日益严重，具体表现为盐渍化土地面积不断扩展，盐渍化程度日益加剧，重度盐渍化土地呈增长趋势，无利用价值碱斑面积扩大，严重影响土地生产力提高和国民经济发展。目前世界上有100多个国家存在不同类型盐碱地10亿hm²，约占全球可耕地面积的10％。我国盐碱地面积达9913万hm²，主要分布在华北、西北和东北等干旱、半干旱地区。我国东北西部松嫩平原有盐碱地面积370余万hm²，是世界上三大苏打盐碱地集中分布区之一。同时，由于工业污染、不合理灌溉和化肥使用不当等原因，次生盐碱化土壤面积也在迅速增加。盐碱地影响植被生长，使农作物减产或绝收，间接造成生态环境恶化。

目前认为实现盐碱地土壤改良需要多学科共同攻关才能得以完成。从生物学角度，主要的方法则是从微生物和植物同时入手，高效耐盐微生物与植物协同作用。研究表明固氮菌、根瘤菌等微生物肥料的施用与化学肥料相比，在促进高效耐盐碱植物改良盐碱地土壤方面，效果更加明显。但很多植物无法直接获得盐碱地贫瘠的碳氮源，且只施用化学肥料则会造成更严重的环境灾难。

可用于土壤改良的微生物肥料和植物却不具有抵抗高盐碱的能力，这成了目前技术的难题。因此，除了发掘高效耐盐碱的微生物和植物资源以外，规模化地发掘高效耐盐碱的新功能基因用以构建相应基因工程菌株微生物肥料和转基因植物显得尤为重要。

在原核生物中，na+依赖性的转运蛋白是na+/h+逆向转运蛋白，次级转运体可以促进钠离子的排出和质子的进入，因此在碱性条件下来调控钠离子和ph的稳态。由于na+/h+转运蛋白同时具有li+/h+转运蛋白活性，它们也被称为na+(li+)/h+逆向转运蛋白。其中有些报道显示出同时具有k+/h+逆向转运蛋白。由于大肠杆菌的ant基因首次发现影响宿主的na+/h+逆向转运蛋白活性因此命名为nhaa，na+(li+)/h+逆向转运蛋白基因或具有na+(li+)/h+逆向转运蛋白活性在大肠杆菌突变体缺少两个或三个逆向转运蛋白的ep432或knabc中越来越多被克隆和功能鉴定。结合编码基因的数量和底物的特异性，na+/h+逆向转运蛋白分为两大类：一类na+/h+逆向转运蛋白主要用于na+和li+的底物由单个基因编码，例如nhaa，nhab，nhac，nhad，nhee，napa，nhap，nhag或nhah，均分为单价阳离子/质子逆向转运蛋白1型家族(cpa-1)家族与napak+/h+逆向转运蛋白高度一致，分为cpa-2家族。另一类具有底物的单价阳离子/质子逆向转运蛋白对于na+和li+，有时用于k+，由含有六个或七个基因的多顺反子操纵子编码，命名为，如mrp，mnh，pha2或sha，它们分组为cpa-3家族由于其独特的多基因结构性质。除了上述两个主要类别之外，还有一些非特异性na+/h+逆向转运蛋白也不断显示出na+/h+逆向转运蛋白活性。例如，据报道，分类为cpa-1家族的chaa具有ca2+(na+)/h+和k+/h+逆向转运蛋白活性。mlen，一种新型hct(2-羟基-羧酸酯转运体)家族转运蛋白，呈现出na+/h+逆向转运蛋白活性同时具有交换细胞质乳酸盐和周质的苹果酸盐的活性。一个独特的四环素/h+逆向转运蛋白，teta(l)，属于mf(majorfacilitator)家族，一个初级的na+泵，nap属于ndh(nadh脱氢酶)家族被报道具有na+/h+逆向转运蛋白活性。大肠杆菌多药耐药(mdr)蛋白，mdfa属于具有广泛特异性mdr表型的mf家族也被表征为显示na+(k+)/h+逆向转运蛋白活性。推定的配对小多药抗性(psmr)家族蛋白psmrab作为yvdsr的同系物，其特征在于主要作为新型双组分na+/h+逆向转运蛋白。

所以，对抗盐基因的分离是当前利用基因工程方法进行抗盐作物培育的首要任务。

综上所述，现有技术存在的问题是：

目前技术缺陷在于可用于土壤改良的微生物肥料和植物不具备高效的耐盐碱的能力，并在规模化地发掘高效耐盐碱的新功能基因用以构建相应基因工程菌株微生物肥料和转基因植物方面缺乏理论依据，且在进行抗盐作物培育方面缺乏有效的鉴定方法。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd及其鉴定方法。利用构建基因文库的创新技术手段，发现一种高效的安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd，所述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd，含一个完整开放阅读框orf，orf的核苷酸序列为seqidno.1，并通过新型基因工程手段构建高效耐盐菌株，从而培育高效土壤改良微生物和植物。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd编码的蛋白，核苷酸序列为seqidno.2。

进一步功能验证显示，所述蛋白在荧光猝灭实验中具有na⁺(li⁺、k⁺)/h⁺逆向转运蛋白活性，且na⁺(li⁺、k⁺)/h⁺逆向转运蛋白活性具有ph依赖性。

本发明的另一目的在于提供一种安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd的鉴定方法包括以下步骤：

(1)通过基因文库与基因功能互补相结合的筛选技术，从安达喜盐芽孢杆菌中获得含有耐盐碱相关的基因片段，所述的耐盐碱相关的基因片段中含有一个长534bp的rdd基因的完整开放阅读框orf，orf的核苷酸序列如seqidno.1；

(2)构建含有rdd基因的原核表达载体；

(3)通过化转异源宿主escherichiacoliknabc，将基因rdd电转化的方法导入至knabc宿主中，对基因rdd生理功能及编码的蛋白活性进行鉴定。

进一步，构建含有rdd基因的原核表达载体，包括原核表达载体pet28b-rdd，pet22b-rdd；所述原核表达载体pet28b-rdd，pet22b-rdd的构建方法包括：

根据rdd基因序列，首先利用primer5软件设计rdd-f/rdd-r特异引物，并在基因的5’和3’端分别引入ndei、xhoi两个酶切位点，然后进行rdd基因的pcr扩增，对rdd基因进行亚克隆；

将pcr扩增产物加a纯化后连接到克隆载体peasy-t3上，化转到trans1-t1感受态细胞中，将转化产物进行蓝白斑筛选；

用限制性内切酶进行酶切鉴定peasy–rdd重组质粒；为进一步确定序列的准确性，对连接到克隆载体peasy-t3上的插入片段进行测序。

进一步，所述对rdd基因进行亚克隆，包括：

rdd亚克隆ndei-xhoi建到pet28bndei-xhoi，然后用bglii-xhoi，构建到pet22，化转至大肠杆菌knabc中，获得重组质粒pet22b-rdd,对插入安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd片段进行双酶切验证，酶切结果正确的质粒进行基因测序。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd构建的具有na+(li+)/h+逆向转运蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd构建的耐盐碱工程菌。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd制备的开发微生物肥料。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd制备的耐盐碱性的转基因植物。

本发明的优点及积极效果为：

本发明基于基因文库筛选法并结合钠离子耐受性功能互补法，从安达喜盐芽孢杆菌的基因组中随机筛选有关na+输出的相关基因，并通过测序分析及生理生化实验来进一步确定有价值的基因，通过对其离子转运功能的鉴定和自身蛋白的定位和分析，初步验证该基因的离子转运机制，从而获得一个新型的na+/h+逆向转运蛋白。本发明的ha_rdd是新型的首次被挖掘和鉴定的新型na+/h+逆向转运蛋白，高效地构建耐盐碱菌株，成功率高达百分之百，且该方法节约60％的技术成本。

本发明与传统技术相比，首次公开安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因鉴定及其用途，从此菌中获取并具有序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列，并能够获得含有该基因的重组载体和宿主细胞，本发明所提出的rdd基因对盐碱地土壤改良具有重要意义，获得了高效耐盐碱工程菌、开发微生物肥料和提高植物耐盐碱性的转基因领域的技术效果。

本发明从分子生物学和基因工程技术出发，构建高效耐盐碱的基因工程菌株以及转基因植物，由此获得用于土壤改良的耐盐碱微生物和植物。由于细菌与植物在耐盐碱方面有很大的相似性，它们在高渗条件下，均在细胞内积累相似的化合物。因此，高效耐盐碱细菌资源库的构建及关键新功能基因的发掘，不仅可以解决构建耐盐碱细菌基因工程菌株的问题，而且优良的高效耐盐碱细菌基因可以为构建高效耐盐碱转基因植物提供重要基因资源储备，这就是本发明的核心价值所在。

附图说明

图1是本发明实施例提供的安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd的鉴定方法流程图。

图中：a.蛋白的跨膜区预测；b.蛋白的疏水性分析。

图2是本发明实施例提供的ha_rdd基因原核表达载体pet-22b-rdd的构建流程图；

图3是本发明实施例提供的构建ha_rdd基因表达载体的电泳检测图；

图中：a.ha_rdd基因pcr产物电泳结果(第1-6泳道为rddpcr产物)；b.peasy-t3-rdd；c.peasy-rdd鉴定结果(1、2:peasy-rdddigestedbyecori,3、4：peasy-t3digestedbyecoriascontrol)；d.peasy-t3-rdddigestedbyndei-xhoi；e.1-4:pet-28b-rdd，5:pet-28b对照；f.1:pet-28b-rdddigestedbyxhoiandndei2:pet-28b酶切对照；g.1:pet-22b对照2、3、4、5：pet-22b-rdd；h.pet-22b-rdd酶切鉴定(1:pet-22b酶切对照2、3、4、5：pet-22b-rdddigestedbybglii-xhoi)。

图4是本发明实施例提供的ha_rdd基因生理功能的鉴定图；

图5是本发明实施例提供的ha_rdd系统发育进化树图；

图中：◆安达喜盐芽孢杆菌rdd蛋白，◇表示rdd家族其他同源蛋白成员，▲表示已知的具有钠/氢逆向转运活性的蛋白，●表示已知的钠/氢逆向转运蛋白；

图6是本发明实施例提供的ha_rdd蛋白的同源性比对图；

图中：━表示跨膜区

图7是本发明实施例提供的ha_rdd蛋白活性的鉴定图；

图中：a.na⁺/h⁺逆向转运活性，b.li⁺/h⁺逆向转运活性，c.k⁺/h⁺逆向转运活性；

图8是本发明实施例提供的ha_rdd蛋白活性的ph轮廓图；

图9是本发明实施例提供的ha_rdd对na⁺、li⁺、k⁺的亲和能力图；

图10是本发明实施例提供的ha_rdd的k⁺/h⁺活性的鉴定图；

图11是本发明实施例提供的ha_rdd蛋白细胞定位图；

图中：m为预染蛋白分子量标准marker，1、3、5泳道为表达有rdd蛋白的相应样品，2、4、6泳道为阴性对照相应样品。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明基于基因文库筛选法并结合钠离子耐受性功能互补法，从安达喜盐芽孢杆菌的基因组中随机筛选有关na+输出的相关基因，并通过测序分析及生理生化实验来进一步确定有价值的基因，通过对其离子转运功能的鉴定和自身蛋白的定位和分析，初步验证该基因的离子转运机制，从而获得一个新型的na+/h+逆向转运蛋白。本发明的ha_rdd是新型的首次被挖掘和鉴定的新型na+/h+逆向转运蛋白。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。

本发明实施例提供的安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd，所述的基因rdd含一个537bp的完整开放阅读框orf，orf的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明实施例提供的安达喜盐芽孢杆菌rdd基因编码的蛋白，核苷酸序列如seqidno.2所示。

所述安达喜盐芽孢杆菌rdd基因编码的蛋白在荧光猝灭实验中该蛋白展现出明显的na⁺(li⁺、k⁺)/h⁺逆向转运蛋白活性，且以上活性具有ph依赖性。

所述的安达喜盐芽孢杆菌rdd编码的蛋白属于未知功能的rdd蛋白家族(thisfamilyofproteinscontainthreehighlyconservedaminoacids:onearginine(r)andtwoaspartates(d),hencethenameofrddfamily)，在ncbi蛋白数据库中其功能尚未被注释。rdd为安达喜盐芽孢杆菌rdd基因的原核表达蛋白。

本发明实施例提供的安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)通过基因文库与基因功能互补相结合的筛选技术，从安达喜盐芽孢杆菌中获得含有耐盐碱相关的基因片段，所述的耐盐碱相关的基因片段中含有一个长534bp的rdd基因的完整开放阅读框orf，orf的核苷酸序列如seqidno.1所示；

(2)构建含有rdd基因的原核表达载体；

(3)通过化转异源宿主escherichiacoliknabc，将rdd基因导入knabc宿主中，对其生理功能及蛋白活性进行鉴定。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

实施例1.在线生物软件分析ha_rdd蛋白的跨膜区及疏水性，如图1所示；

本发明利用在线预测网站http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm-2.0/和http://web.expasy.org/protscale/对rdd基因编码的蛋白序列进行生物信息学分析，发现该基因编码的蛋白rdd具有三个跨膜区，且蛋白呈现出高疏水性。

实施例2.ha_rdd基因原核表达载体pet28b-rdd，pet22b-rdd的构建流程，如图2所示；

根据rdd基因序列，首先利用primer5软件设计rdd-f/rdd-r特异引物(如表1所示)，seqidno.3：rdd-f：catatggatacagtagaacccac；

seqidno.4：rdd-r：ctcgagttaatctacagaagattcaa。

并在基因的5’和3’端分别引入ndei、xhoi两个酶切位点，然后进行rdd基因的扩增(如表2所示)，对rdd基因进行亚克隆。

表1rdd基因表达载体构建引物序列

表2pcr扩增反应

将pcr产物加a纯化后连接到克隆载体peasy-t3上，化转到trans1-t1感受态细胞中，将转化产物进行蓝白斑筛选。结果如图3可知，pcr产物:rdd(547bp)大小与dnamarker比对，应符合pcr产物的实际长度。为了进一步鉴定peasy–rdd重组质粒是否正确，用限制性内切酶进行酶切验证。如图3可知，双酶切产生的片段大小与pcr产物大小基本一致，为进一步确定序列的准确性，对插入片段进行测序，测序结果与原始序列一致。以上结果表明rdd基因成功插入peasyt3载体中。

rdd亚克隆(ndei-xhoi)建到pet28b(卡那抗性)(ndei-xhoi)，然后用bglii-xhoi，构建到pet22b(氨苄抗性)化转至大肠杆菌(e.coli)knabc中，获得重组质粒pet22b-rdd,对插入片段进行双酶切验证，酶切结果正确的质粒进行基因测序，测序结果与原始序列一致。表明重组质粒pet22b-rdd构建成功(图3)。

实施例3ha_rdd基因生理功能的鉴定：

为了鉴定ha_rdd基因的生理功能，本发明以knabc/puc18为负对照，将原始克隆knabc/puc-sl38的菌液按1％接种量转接到含有不同盐浓度(0-0.2mnacl或50mmlicl)的新鲜lbk培养基中培养24h。结果如图4a-d所示：在0.2mnacl或5mmlicl的胁迫下，与负对照相比，亚克隆knabc/pet22-rdd和原始克隆knabc/puc-sl38均能使盐敏感突变株knabc恢复生长，并且他们的生长趋势基本一致。在碱性环境中(如图4e-f)，原始克隆knabc/puc-sl38在加入50mmnaclph8时能使盐敏感突变株knabc恢复生长，而在不加nacl的ph8.5的环境中，恢复生长。这就说明rdd基因具有明显的耐盐碱能力。

实施例4rdd基因表达蛋白的生物信息学分析

一、ha_rdd基因编码蛋白理化性质：

采用expasyprotparam对rdd基因编码蛋白进行基本的理化性质的预测和分析。结果表明：耐盐碱基因rdd编码178个氨基酸，相对分子量为20.42306kd，等电点9.26，为碱性蛋白；组成的原子是c(948)h(1493)n(243)o(248)s(5)，一共2937个原子，理论半衰期30h，不稳定参数25.08，是稳定蛋白，氨基酸中带正电荷氨基酸(arg、lys)18个，带负电荷氨基酸(asp、glu)15个。asp蛋白的氨基酸组成(表3)，结果显示其中包含的中性疏水性氨基酸、亲水性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸分别为58.9％、36.5％、8.4％、13.5％。说明耐盐碱基因rdd编码蛋白具有一定疏水能力且稳定的碱性蛋白。

表3ha_rdd基因编码蛋白氨基酸组成

二、ha_rdd系统发育进化树

利用neighbor-joining算法，对rdd家族蛋白、已知的钠/氢逆向转运蛋白或具有钠/氢逆向转运活性的蛋白进行系统进化距离分析。结果表明(图5)：rdd与同家族的其他蛋白聚集在一簇阙值(bootstrapvalues)为96％的分支上，此分支与已知的钠/氢逆向转运蛋白或具有钠/氢逆向转运活性的蛋白系统进化距离很远。所以，本发明认为rdd应该是一类新型的钠/氢逆向转运蛋白。

三、ha_rdd与同系物的同源性比对

本发明选择了blast数据库中与它同源性40％-60％最近的24个同源蛋白进行多序列比对(图6)，结果发现：ha_rdd与这些同系物r35、d42、r124、r129、d154、d158氨基酸高度保守。

实施例5ha_rdd蛋白功能的鉴定

一、ha_rdd蛋白活性的鉴定

本发明将含有pet-rdd和pet22b的knabc细胞，用法式细胞破碎机制备成反转膜，以吖啶橙作为荧光指示剂，检测其na⁺(li⁺，k⁺)/h⁺逆向转运蛋白活性(图7)。结果发现：在荧光猝灭的最低平衡点加入单一的单价阳离子溶液，反转膜knabc/pet-rdd的荧光值升高(图7-a&b&c左侧)，而负对照knabc/pet22b在加入单价阳离子溶液后荧光值没有变化(图7-a&b&c右侧)。所以，我们认为ha_rdd是具有转运na⁺(li⁺、k⁺)/h⁺逆向转运蛋白活性的。

二、ha_rdd蛋白活性的ph轮廓

钠/氢逆向转运蛋白对ph是具有一定的依赖性的，即它的转运活性会随环境中ph的变化而改变。因此，本发明在不同ph(6.5-9.5)的反应体系中，检测ha_rdd的蛋白活性。结果发现：在ph7.0-9.0的范围内，ha_rdd对na⁺、li⁺、k⁺的转运活性会随ph的变化而改变(其趋势见图8)，而且当反应体系中的ph为9.0时，rdd的离子转运活性最高，并且对三种不同离子的转运活性也存在一定的差距。

三、ha_rdd对na⁺、li⁺、k⁺的亲和能力

由于ha_rdd对na⁺、li⁺、k⁺三种离子转运能力是有差别的，即对底物偏好性不同。当k0.5值越小时，就表示对某一底物的转运偏好性越好。所以，本发明通过originpro8.6数据分析软件计算k0.5值(图9)。发现，当转运活性达到最大反应活性的一半时，na⁺、li⁺、k⁺的k0.5值分别是1.29±0.14mm、1.89±0.20mm、1.37±0.21mm，换而言之，ha_rdd对na⁺的偏好性最好，对三种离子的偏好由强到弱依次：na⁺>k⁺>li⁺。

实施例六ha_rdd蛋白kcl活性的鉴定

本发明利用puc18和puc-nhad作为负对照，puc-ump-ab作为正对照来鉴定ha_rdd蛋白的kcl活性。当od＝0.1时接种，按1％的接种量分别接到不含kcl和正常的0mlbk不同ph培养基中，puc-ump-ab和puc-sl38在不含kcl培养基ph8.0时微弱生长，在0mlbkph8.0时生长良好，而负对照生长受到抑制(图10a&b)，本发明发现图10cpuc-sl38能在1.0m1.2mkcl里恢复生长，而其他均受到抑制，因此本发明证明了ha_rdd蛋白具有k⁺活性。

实施例七ha_rdd蛋白的细胞定位

本发明利用超离法将knabc/pet22-rdd细胞的胞浆蛋白与膜蛋白分离开，再通过蛋白印迹杂交(westernblot，简称wb)的技术手段，分别对提取的细胞全蛋白(超声破碎上清液)、胞浆蛋白(超离上清液)和膜蛋白(超离沉淀)进行检测。理论上，wb实验只能在制备的细胞全蛋白(超声破碎上清液)和膜蛋白(超离沉淀)样品中检测出目的条带(即ha_rdd所携有的标签抗体信号)，而胞浆蛋白样品(超离上清液)则检测不出目的条带。

发现(图10)：第一，与负对照相比(b-2、4、6)，ha_rdd蛋白只在细胞的全蛋白和膜蛋白样品中被检测出条带(b-1、5)，而胞浆蛋白样品中没有(b-3)，综上所述，ha_rdd的确是位于在内膜上的膜蛋白，这与之前对它的分析是相互印证的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。