一种检测鸡WNT9A基因表达量的试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种检测鸡wnt9a基因表达量的试剂盒及检测方法。

背景技术：

基因表达是指细胞在生命过程中，把储存在dna序列中遗传信息经过转录和翻译，转变成有生物活性的蛋白质分子的过程。基因表达规律的研究，可以了解到目的基因在不同组织器官中的表达情况，为进一步分析该基因的功能提供帮助。虽然在基因表达过程中还有翻译和翻译后的加工过程，但是mrna是转录起始在基因表达的基本控制点，因此基因mrna表达水平的测定能够较好的反应基因表达水平和生物学功能的强弱。本课题组前期转录组研究发现，在生长速度快慢的两种不同京海黄鸡个体中，wnt9a基因为腿肌组织中的差异表达基因。wnt9a基因为wnt家族成员之一，wnt家族通过分泌性蛋白wnts作用于多种不同受体从而转导不同的细胞内信号通路，wnts可通过激活多种细胞内信号通路来调控多种细胞功能，包括细胞的增殖、分化、凋亡、存活、迁移能力和细胞极性等，因此该家族每一个成员缺一不可。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种检测鸡wnt9a基因表达量的试剂盒，该试剂盒可对鸡wnt9a基因表达量进行测定，研究wnt9a基因在鸡各种组织中的表达规律。

本发明的原理是：提取京海黄鸡组织总rna进行反转录，得到cdna。利用设计的扩增目的基因和内参基因的特异引物进行荧光定量pcr。结果表明目的基因和内参基因的溶解曲线上只有单峰的存在，说明引物的特异性良好，三对引物都没有非特异性扩增和引物二聚体的形成，可用于荧光定量pcr。绘制的标准曲线表明，目的基因和内参基因标准曲线的斜率基本一致，即扩增效率基本一致，可运用2^-△△ct方法对相对表达量进行分析。

本发明公开了用于上述方法的试剂盒，该试剂盒由特异性引物、2×浓度的premix试剂、50×浓度的roxreferencedyeii和灭菌水组成，其中所述的特异性引物的序列如seqidno.1和seqidno.2，seqidno.3和seqidno.4，seqidno.5和seqidno.6所示。

提取待测样本的组织总rna进行反转录后，利用该试剂盒进行荧光定量pcr，运用2^-△△ct方法对相对表达量进行分析,具体计算公式:△△ct＝(待测组目的基因平均ct值－待测组看家基因平均ct值)-(对照组目的基因平均ct值－对照组看家基因平均ct值)。其中，ct值(初始循环数)为荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的闽值所对应的循环次数。

一种检测鸡wnt9a基因表达量的方法，是提取待测样本的组织总rna进行反转录后，利用本发明试剂盒进行荧光定量pcr，运用2^-△△ct方法对相对表达量进行分析。

用本发明的试剂盒选择的检测方法简单快捷，可对鸡wnt9a基因表达量进行测定，研究wnt9a基因在鸡各种组织中的表达规律。

附图说明

图1组织总rna的提取结果。图中m指的是markerdl2000；1、2、3和4分别是心、肝、脾和肺组织rna；bp表示碱基对数。

图2是wnt9a基因的溶解曲线。

图3是β-actin基因的溶解曲线。

图4是gapdh基因的溶解曲线。

图5是wnt9a基因的标准曲线。

图6是β-actin基因的标准曲线。

图7是gapdh基因的标准曲线。

具体实施方式

实施例1

1.待测组织rna的提取和反转录

实验采用来自京海禽业集团有限公司的饲养管理水平一致的京海黄鸡。选取3只12周龄体重相近的母鸡进行屠宰，采集心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌、卵巢组织样，rnawait样品保存液浸润后-70℃保存备用。

2.反转录

反转录体系为40ul(冰上配制)，具体操作为，在0.2m1的pcr管中加入5×primescriptrtmastermix(perfectrealtime)8u1，加入约2000ng量的rna模板(根据已经提取的各组织rna浓度计算)，加入rnasefreedh20补全至40u1.

将加好试剂的pcr管瞬时离心后放在pcr仪上进行反应。反转录条件如下：

37℃15min(反转录反应)

85℃5sec(反转录酶的失活反应)

4℃

所得产物即为cdna，-20℃保存备用

3.引物设计和pcr扩增

3.1引物的设计

本实验用于荧光定量的目的基因wnt9a引物根据genbank中的基因序列(登录号：nc_006809.4)和mrna序列(登录号：nm_204981.2)跨内含子设计，内参基因β-actin引物根据genbank中的基因序列(登录号：x00182)和mrna序列(登录号：l081565)跨内含子设计，内参基因gapdh引物根据genbank中的基因序列(登录号：nc_006088.4)和mrna序列(登录号：nm_204305.1)跨内含子设计。扩增产物大小分别为136bbp，169bp和85bp。引物序列如下：

wnt9a:f:5’-ggaagcccaacaaggacctg-3’(seqidno.1)

r:5’-accgtggcacttacaggttg-3’(seqidno.2)

β-actin:f:5’-cagccatctttcttgggtat-3’(seqidno.3)

r:5’-ctgtgatctccttctgcatcc-3’(seqidno.4)

gapdh:f:5’-aggcgagatggtgaaagtcg-3’(seqidno.5)

r:5’-gactttgccagagaggacgg-3’(seqidno.6)

3.2试剂盒的组成

序列如seqidno.1和seqidno.2，seqidno.3和seqidno.4以及seqidno.5和seqidno.6的特异性引物、2×浓度的premix试剂即2×浓度的sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)、50×浓度的roxreferencedyeii和灭菌水，各组分的份量如下：

seqidno.1：40μl

seqidno.2：40μl

seqidno.3：40μl

seqidno.4：40μl

seqidno.5：40μl

seqidno.6：40μl

2×浓度的sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)：3ml

50×浓度的roxreferencedyeii：120μl

灭菌水：3ml

3.3荧光定量pcr扩增

反应液的配制在冰上进行，每个样本设三个重复。

荧光定量pcr扩增程序：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环；为分析扩增产物的特异性，pcr扩增结束后采集多个信息点进行溶解曲线分析，程序为：95℃15s，60℃1min；95℃15s。结果表明目的基因和内参基因的溶解曲线上只有单峰的存在(图2，图3和图4)，说明引物的特异性良好，两对引物都没有非特异性扩增和引物二聚体的形成，可用于荧光定量pcr。

3.4目的基因和内参基因标准曲线的绘制

将目的基因和内参基因的cdna按照10倍梯度稀释，稀释成4个梯度，以稀释的cdna为模板进行荧光定量pcr制作标准曲线。目的基因wnt9a基因的标准曲线为：y＝-3.244x+24.555，拟合度r²＝0.998，扩增效率eff＝103.363％；内参基因β-actin基因的标准曲线为：y＝-3.303x+26.636，拟合度r²＝0.998，扩增效率eff＝100.804％；内参基因gapdh基因的标准曲线为：y＝-3.338x+24.328，拟合度r²＝0.999，扩增效率eff＝99.354％。目的基因和内参基因的标准曲线见图5，图6和图7。由上可知目的基因和内参基因标准曲线的斜率基本一致，扩增效率基本一致，可以运用2^-△△ct方法分析wnt9a基因的相对表达量。

3.5wnt9a基因在京海黄鸡母鸡各组织中的表达差异

以12周龄京海黄鸡母鸡为素材，选取心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌、卵巢的组织样，提取rna反转录后再进行荧光定量试验，各个组织中wnt9a基因相对表达量见表1。由表可知，wnt9a基因在肾脏中的表达丰度最高，其次为肝、肺、腿肌、心、胸肌、脾脏、卵巢。该试剂盒可用于检测鸡wnt9a基因在各种组织中的表达量，进而研究基因的功能。

表1京海黄各个组织中wnt9a基因的相对表达量

*表示以卵巢组织中wnt9a基因相对表达量为内对照。

sequencelisting

<110>扬州大学

<120>一种检测鸡wnt9a基因表达量的试剂盒及检测方法

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ggaagcccaacaaggacctg20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

accgtggcacttacaggttg20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cagccatctttcttgggtat20

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ctgtgatctccttctgcatcc21

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

aggcgagatggtgaaagtcg20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gactttgccagagaggacgg20