拮抗根腐的芽孢杆菌的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株拮抗根腐的芽孢杆菌菌株。

背景技术：

根腐病是一种系统感染病害，是来蒙、大豆、小麦、番茄、棉花、草莓等植物的常见土传病害，在美国、加拿大、澳大利亚、中国等是一个日益突出的问题。植株由于根腐病，叶片变小，缺少光泽，枝条矮化，果实瘦小，或叶片变黄萎蔫，严重时植株逐渐枯死。根腐病的主要病原种群是尖孢镰刀菌fusariumoxysporum和腐皮镰刀菌fusariumsolani，防治的方法有化学试剂、真菌剂、生物防治、植物性治疗药物、优化施肥等，而采用生防菌控制根腐病是综合防治的一条重要措施。

多种真菌、细菌和一些放线菌都可应用于真菌病害的生物防治，拮抗性细菌有短短芽孢杆菌、绿叶假单胞菌、枯草芽孢杆菌等。细菌在植物生物防治中的应用研究已广泛开展，并取得良好的应用效果。但是，这些细菌对植物根腐病却没有很好的防治效果。

因此，筛选到防效好、适应性广的生防菌是植物根腐病生物防治工作面临的关键问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于寻找专治根腐病的细菌，解决根腐病的生物防治问题。

为了实现以上目的，本发明的技术方案如下：

拮抗根腐的芽孢杆菌，所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌fjat-20265(bacillussubtilisfjat-20265)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmccno.14430，保藏日期为2017年7月17日，保藏地址为中国北京市中国科学院微生物研究所。

芽孢杆菌fjat-20265的菌落形态为：菌落较小、圆形、乳白色、表面光滑且湿润、隆起、边缘整齐、不透明。

芽孢杆菌fjat-20265对镰刀菌有较强的拮抗作用，包括尖孢镰刀菌fjat-30512、腐皮镰刀菌fjat-176和串珠镰刀菌fjat-165。

本发明的有益效果是：

(1)从高海拔地区的土壤中筛选到的芽孢杆菌fjat-20265，对根腐病主要病原菌镰刀菌具有很强的抑制效果，可专门用于防治根腐病。

(2)芽孢杆菌fjat-20265是根腐病主要病原菌的拮抗菌，是一种对环境友好、经济有效的防治病害的生防菌。它能产生具有较强抗逆性的内生孢子(芽胞)，能耐盐、耐酸、耐高温且易于保存和运输，有利于快速实现商品化生产。

附图说明

图1芽孢杆菌fjat-20265的菌落形态

图2芽孢杆菌fjat-20265的16srrna序列鉴定结果的进化树

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明。

实施例1拮抗菌株的筛选

1.土样采集与芽孢杆菌分离纯化

从可可西里采集的草根土土壤样本风干，研磨后，制成土壤悬浊液，再经过无菌水适当稀释，涂布na平板；30℃培养72h，挑取单菌落，甘油保存，作为待测菌株。采用稀释涂板法分离纯化得到了63株菌株作为待测菌株。

2.尖孢镰刀菌生防菌株的筛选

(1)对峙法初筛

供试菌株番茄寄主尖孢镰刀菌fusariumoxysporumfjat-30512(保存在福建省农业科学院农业生物资源研究所)，于牛肉膏蛋白胨培养基(na：牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡糖糖10g，琼脂粉1.7％，ph7.2-7.4)平板上活化，30℃恒温培养48h。尖孢镰刀菌fjat-30512于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda：马铃薯200.0g·l^-1，蔗糖20.0g·l^-1，琼脂17.5g·l^-1)上活化，28℃恒温培养48h。将活化后的fjat-30512接种于pda平板上，28℃培养120h至菌丝长满整个平板，然后用直径7mm的打孔器在菌饼上打下小菌圈，置于pda平板的正中间，再在距离小菌圈外围22mm的地方划线接种供试菌株。28℃恒温培养120h，观察菌株对尖孢镰刀菌fjat-30512的抑制效果。

从可可西里土壤样品分离纯化得到的63株菌株，进行平板对峙法初筛获得了14株对尖孢镰刀真菌fjat-30512有拮抗作用的菌株，菌株编号为：fjat-19699、fjat-19700、fjat-19704、fjat-19708、fjat-19711、fjat-20239、fjat-20264、fjat-20265、fjat-20267、fjat-21720、fjat-21739、fjat-21888、fjat-21902、fjat-22554。

(2)抑菌圈法复筛

将初筛中对尖孢镰刀菌具有抑制作用的14株菌株进行抑菌圈法复筛。将供试菌株接种到na平板上，再把单菌落接到500μlna液体培养基中，170r·min^-130℃恒温培养48h。将5ml尖孢镰刀菌fjat-30512的菌悬液(菌落密度4.0×10⁸cfu·ml^-1)与200ml50℃的pda半固体培养基混合后，倒入已制备好的pda固体培养基，制成含病原菌的双层平板；待培养基凝固后，用直径7mm的打孔器在平板上打孔，在孔内加入100μl供试菌株培养液，阴性对照为100μl无菌水，阳性对照为100μl潮霉素(质量浓度为5μg·ml^-1)，每个供试菌株重复3次，28℃恒温培养5d，用直径交叉法测量抑菌圈直径。这14株菌株的抑菌效果如表1所示。

表1芽孢杆菌对尖孢镰刀菌fjat-30512的抑菌作用

注：fjat-8784为对照菌株，保藏于瑞典哥德堡大学菌种保存中心(ccug)，编号ccug163。

3.腐皮镰刀菌生防菌的筛选

将对尖孢镰刀菌fjat-30512具有明显抑制效果的菌株进行腐皮镰刀菌fjat-176的抑菌实验。将供试菌株番茄寄主腐皮镰刀菌fusariumsolanifjat-176(保存在福建省农业科学院农业生物资源研究所)接种到na平板上，再把单菌落接入到500μlna液体培养基中，170r·min^-130℃恒温培养48h。将5ml腐皮镰刀菌fjat-176的菌悬液(菌落密度1.7×10⁸cfu·ml^-1)与200ml50℃的pda半固体培养基混合后，倒入已制备好的pda固体培养基，制成含病原菌的双层平板；待培养基凝固后，用直径7mm的打孔器在平板上打孔，在孔内加入100μl供试菌株培养液，阴性对照为100μl无菌水，阳性对照为100μl潮霉素(质量浓度为3μg·ml^-1)，每个供试菌株重复3次，28℃恒温培养5d，用直径交叉法测量抑菌圈直径。

选择对尖孢镰刀菌fjat-30512抑菌圈直径平均值>6mm的5株菌株进行腐皮镰刀菌fjat-176生防菌的筛选，结果见表2，其中fjat-19708和fjat-20265共2株菌株的抑菌效果较好，抑菌圈直径均大于9.9mm。

表2不同菌株对腐皮镰刀菌fjat-176的抑菌圈直径

4.串珠镰刀菌生防菌的筛选

将用腐皮镰刀菌筛选到的2株菌株接种到na平板上，再把单菌落接入到500μlna液体培养基(牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡糖糖10g，ph7.2-7.4)中，30℃170r·min^-1培养48h。

串珠镰刀菌fjat-165(保存在福建省农业科学院农业生物资源研究所)先在pda平板上活化，然后接入pda液体培养基中30℃170r·min^-1培养48h。

在200ml的pda半固体培养基中加入5ml的fjat-165发酵液(菌落数为1.35×10⁸cfu·ml^-1)。于平板中倒入pda固体培养基，待固体培养基凝固后，再注入加有串珠镰刀菌fjat-165的半固体培养基，待凝固，制备成双层培养基，用7mm打孔器在培养基上打孔。以无菌水为阴性对照，潮霉素(浓度为3μg·ml^-1)为阳性对照，分别取100μl滴入相应的孔中，置于30℃恒温培养箱中培养5d。用游标卡尺测量抑菌圈直径。

实验结果见表3，fjat-20265菌株的抑菌圈直径显著大于fjat-19708菌株的抑菌圈直径。说明fjat-20265菌株对串珠镰刀菌fjat-165具有较强的拮抗作用。

表3不同菌株对串珠镰刀菌fjat-165的抑菌圈直径

综上，以尖孢镰刀菌fjat-30512、腐皮镰刀菌fjat-176和串珠镰刀菌fjat-165作为致病菌，从可可西里土壤里筛选到了一株对镰刀菌具有较强抑制效果的菌株fjat-20265。

实施例2拮抗菌株的鉴定

1.形态特征

将芽孢杆菌fjat-20265于na平板上活化，48h后观察菌株的菌落形态、大小、颜色、透明度、突起和边缘情况。

菌株fjat-20265的菌落特征如图1所示，菌落较小、圆形、乳白色、表面光滑且湿润、隆起、边缘整齐、不透明。

2.16srrna基因序列分析

按细菌基因组提取试剂盒(generaybiotech#gk1071，上海捷瑞生物工程有限公司)操作步骤提取菌株fjat-20265的基因组dna，采用16srrna基因通用引物27f和1492r进行pcr扩增，pcr反应程序参照郑雪芳等的文献(郑雪芳,刘波,朱育菁,等.番茄青枯病生防芽孢杆菌的筛选与鉴定[j].中国生物防治学报,2016,32(5):657-665.)，pcr产物送至上海博尚测序，应用ezbiocloud完成序列同源性比对，通过mega4.0.2软件分析序列和构建系统发育树。

将菌株fjat-20265的16srrna基因序列与ezbiocloud基因数据库比对，菌株fjat-20265与bacillussubtilis亲缘关系最近，16srrna基因同源性为99.37％，所以菌株fjat-20265应属于bacillussubtilis枯草芽孢杆菌。将同源性较高菌株的16srrna基因序列下载进行对比分析，构建系统发育树，采用neighbour-joining方法，bootstrap值为1000次时，形成的发育树如图2所示。构建的系统发育树中，菌株fjat-20265与bacillussubtilis聚在同一个分支。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。