检测百合斑驳病毒的引物组合物及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种可以简便检测百合斑驳病毒的引物组合物及其应用。

背景技术：

百合(liliumspp.)属于百合科(liliaceae)百合属(lilium),是多年生草本球根植物，是世界著名的观赏花卉。我国是百合切花生产大国，2012年我国百合切花种植面积为9104.6公顷，销售量19.3亿支，销售总额达到52.2亿元。

百合斑驳病毒(lilymottlevirus，lmov)，又名郁金香碎色病毒百合株系(tulipbreakingviruslilystrain，tbv)，属于马铃薯y病毒属(potyvirus)，是危害百合较为严重的病害之一。该病毒分布范围较广，在国内外均有发现。lmov自然寄主主要是百合属和郁金香属植物，一般与百合无症病毒复合感染百合较为常见，病症明显，表现为叶片出现斑驳、分叉扭曲，花变形、蕾不开放，植株矮小等症状，给百合种球和鲜切花生产造成严重的经济损失。目前，检测lmov的方法主要采用进口抗血清检测试剂盒进行酶联免疫吸附测定(elisa)以及rt-pcr方法。这些方法存在非特异性高、准确性和均质性差、价格昂贵等缺点。因而迫切需要建立快速、准确、简便的检测方法，为该病毒病的诊断、抗病育种和脱毒种球种苗生产提供技术支持。

lamp(loop-mediatedisothermalamplification)法是2000年由notomi等发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该方法采用特异地识别靶序列上六个区域的四条引物(两条外引物，两条内引物)及具有链置换活性的bstdna聚合酶，在65℃左右进行核酸的指数级扩增，其扩增效率可达到10⁹-10¹⁰个拷贝数量级。整个反应仅需1小时，在扩增反应中副产物焦磷酸镁沉淀与钙黄绿素结合，产生黄绿色荧光，不需要借助其他仪器便可辨别实验结果。lamp技术具有简便、快速、准确、廉价、易检测等特点。目前，国内外尚未见lamp方法检测lmov基因的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种可以简便检测百合斑驳病毒(lilymottlevirus，lmov)的引物组合物及其应用。

本发明提供的检测百合斑驳病毒(lilymottlevirus，lmov)的引物组合物，由序列表的序列1所示dna、序列表的序列2所示dna、序列表的序列3所示dna和序列表的序列4所示dna组成。

本发明还保护一种检测百合斑驳病毒(lilymottlevirus，lmov)的试剂盒，包括所述的检测百合斑驳病毒(lilymottlevirus，lmov)的引物组合物。

所述引物组合物可用于制备检测百合斑驳病毒(lilymottlevirus，lmov)侵染的试剂盒。

所述引物组合物或所述试剂盒可用于检测百合斑驳病毒(lilymottlevirus，lmov)侵染。

本发明还保护一种检测待检测百合斑驳病毒(lilymottlevirus，lmov)的方法，包括如下步骤：

(1)提取所述待测生物样本的rna；

(2)以步骤(1)的rna为模板，用所述的专用引物进行反转录环介导恒温扩增；

(3)根据步骤(2)的扩增产物鉴定所述待测生物样本是否含有lmov。

所述环介导恒温扩增的反应程序可为：60℃1小时，80℃5分钟。

所述环介导恒温扩增的反应体系中，序列表的序列1所示dna和序列表的序列2所示dna的浓度均可为0.2μmol/l，序列表的序列3所示dna和序列表的序列4所示dna的浓度均可为1.6μmol/l。

所述待测生物样本为lmov侵染的百合植株。

所述环介导恒温扩增的反应体系中含有sybrgreeni时，可通直接用肉眼进行结果判读，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测生物样本中含有所述lmov基因，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测生物样本中不含有所述lmov基因。

还可通过琼脂糖凝胶电泳进行结果判读，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测生物样本中含有所述lmov的编码基因，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测生物样本中不含有所述lmov的编码基因。

应用所述专用引物可以通过rt-lamp(环介导恒温扩增)技术从分子水平上直接快速、准确检测lmov侵染，具有如下优点：(1)在恒温条件下即可发生反应，摆脱了了对于仪器的依赖；(2)反应时间短；在2h内即可完成；(3)灵敏度高；比传统rt-pcr扩增技术提高了2个数量级；(4)特异性强；应用6个靶基因位点，内引物及外引物在6个区域特异性结合方可进行扩增；(5)鉴定简便；在核酸大量合成时，如果在反应体系中加入sybrgreeni，不需要借助其他仪器便可肉眼观察实验结果，实现了结果可视化。

应用本发明提供的专用引物检测lmovcp蛋白的编码基因，解决了其他检测技术对于实际应用需求的针对性不强的技术弊端，并且解决了其他检测技术耗时长、操作复杂、检测仪器昂贵、灵敏度及特异性差等技术问题，具有灵敏度高、速度快、特异性强、简便、安全等特点，为快速、准确的检测lmov打下坚实的基础，其广泛应用将大大提高百合生产中对lmov的防治能力。

附图说明

图1为实施例2中通过检测颜色变化判读结果。

图2为实施例2中通过琼脂糖凝胶电泳判读结果。

图3为实施例3中rt-lamp灵敏度的电泳检测。

图4为对比例中的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、检测百合斑驳病毒(lilymottlevirus，lmov)的lamp引物组的设计和制备

根据百合斑驳病毒(lilymottlevirus，lmov)rna的cdna序列，通过软件dnaman7.0进行同源性分析后，找出百合斑驳病毒(lilymottlevirus，lmov)cp蛋白保守序列基因作为模板，使用在线软件primer3input(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)设计rt-lamp引物，并对设计的引物进行筛选，序列调整，验证，最终获得一组敏感性和特异性很高的lamp引物。lmovcp蛋白的氨基酸序列如序列表的序列5所示，其编码基因如序列表的序列6所示，开放阅读框为序列表的序列6自5’末端第1至822位核苷酸。

引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列如下表1(f3、b3、fip和bip)：

表1所示的4条引物组成lamp引物组，用于实施例2。

表1lamp引物组的核苷酸序列

实施例2、应用检测百合斑驳病毒(lilymottlevirus，lmov)的lamp引物组检测lmov

一、rna模板准备

选取有症状的百合叶片，应用transzolplant(全式金生物技术有限公司)提取总rna。应用nanodrop2000超微量分光光度计(thermofisherscientific,waltham,ma,usa)检测所提取的rna的浓度。

二、应用专用rt-lamp引物检测样品中lmov侵染

1、通过观察荧光颜色变化判读结果(荧光显色法)

采用步骤一提取的lmov侵染的百合叶片总rna为模板(浓度为100ng/μl)进行rt-lamp，反应体系见表2。

表2rt-lamp反应体系(10μl)

以0.5μllmov未侵染的百合叶片总rna作为空白对照。

按表2配置完整的rt-lamp反应体系。

rt-lamp反应程序：60℃1小时，80℃5分钟，4℃保存。

反应完成后在每个反应体系中加入0.1μlsybrgreeni，观察反应溶液的颜色变化。结果表明：以lmov侵染的百合叶片总rna为模板，染色后反应液显示绿色荧光；空白对照反应液染色后显示浅橙色荧光(图1，图1中2为以lmov侵染的百合叶片总rna为模板染色反应，显示绿色荧光，图1中1为空白对照，染色反应显示橙色)。

进行三次重复实验，结果一致。

2、通过琼脂糖凝胶电泳判读结果

采用步骤一提取lmov侵染的百合叶片总rna为模板(浓度为100ng/μl)进行rt-lamp，反应体系见表2。以0.5ullmov未侵染的百合叶片总rna作为空白对照。

按表2配置完整的rt-lamp反应体系。

rt-lamp反应程序：60℃1小时，80℃5分钟，4℃保存。

反应完成后，将反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，每加样孔4ul反应产物。结果表明：以lmov侵染的百合叶片总rna为模板，反应后反应液电泳显示lamp扩增特异带型(连续的梯状条带，图2中泳道2)；空白对照中，反应后反应液未显示有扩增条带(图2中泳道1)。

进行三次重复实验，结果一致。

实施例3、检测百合斑驳病毒(lilymottlevirus，lmov)的lamp引物的灵敏性测定

一、制备模板

应用实施例2步骤一中提取的lmov侵染的百合叶片总rna(浓度为100ng/μl)，进行梯度稀释后作为模板。模板的终浓度分别如下：5ng/μl、0.5ng/μl、0.05ng/μl、0.005ng/μl、0.0005ng/μl、0.00005ng/μl、0.000005ng/μl、0.0000005ng/μl。

二、灵敏度的电泳检测

采用步骤一稀释的模板进行rt-lamp，其他试剂按表2配置完整的rt-lamp反应体系。rt-lamp反应程序：60℃1小时，80℃5分钟，4℃保存。

反应结束后取2μl反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果见图3a(泳道1为浓度为5ng/μl的模板，泳道2为浓度为0.5ng/μl的模板，泳道3为浓度为0.05ng/μl的模板，泳道4为浓度为0.005ng/μl的模板，泳道5为浓度为0.0005ng/μl的模板，泳道6为浓度为0.00005ng/μl的模板，泳道7为浓度为0.000005ng/μl的模板，泳道8为浓度为0.0000005ng/μl的模板)。lmov侵染的百合叶片总rna作为模板反应后的反应液均显示rt-lamp扩增特异带型(连续的梯状条带)，rt-lamp检测lmov的下限为0.00005ng/μllmov侵染的百合叶片总rna。

进行三次重复实验，结果一致。

实施例4、检测百合斑驳病毒(lilymottlevirus，lmov)的lamp引物组的特异性测定

分别将如下材料作为模板进行进行rt-lamp，反应体系见表2：黄瓜花叶病毒(cucumbermosaicvirus，cmv)侵染的百合叶片总rna(浓度为100ng/μl)、百合无症病毒(lilysymptomlessvirus,lsv)侵染的百合叶片总rna(浓度为100ng/μl)、百合斑驳病毒(lilymottlevirus,lmov)侵染的百合叶片总rna(浓度为100ng/μl)、百合x病毒(lilyvirusx，lvx)侵染的百合叶片总rna(浓度为100ng/μl)、烟草花叶病病毒(tobaccomosaicvirus,tmv)侵染的百合叶片总rna(浓度为100ng/μl)。以2μl双蒸水或健康百合叶片总rna作为模板的对照。

将表2中除模板以外的试剂混匀备用，然后将模板与混匀好的其它试剂混合，即为完整的rt-lamp反应体系。

rt-lamp反应程序：60℃1小时，80℃5分钟，4℃保存。

反应结束后取反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果见图4(泳道1为无菌水对照，泳道2为健康百合rna模板，泳道3为黄瓜花叶病毒(cucumbermosaicvirus，cmv)侵染的百合叶片总rna(浓度为100ng/μl)模板，泳道4为百合无症病毒(lilysymptomlessvirus,lsv)侵染的百合叶片总rna(浓度为100ng/μl)模板，泳道5为百合x病毒(lilyvirusx，lvx)侵染的百合叶片总rna(浓度为100ng/μl)模板，泳道6为烟草花叶病病毒(tobaccomosaicvirus,tmv)侵染的百合叶片总rna(浓度为100ng/μl)模板，泳道7为百合斑驳病毒(lilymottlevirus，lmov)侵染的百合叶片总rna(浓度为100ng/μl)模板)。结果表明，只有lmov侵染的百合叶片总rna为模板的电泳显示连续梯状条带，为阳性结果，其它模板均显示阴性结果(图4)。

进行三次重复实验，结果一致。

对比例、

一、rt-pcr检测lmov侵染

应用rt-pcr扩增样品中lmov外壳蛋白基因，所用引物为lmov-f5’-cacctcaccaaatgtaaatgg-3’和lmov-r5’-tagaaattccaagtaaggagtgc-3’。反应体系见表3

表3.rt-pcr反应体系(20μl)

以0.5μllmov未侵染的百合叶片总rna作为空白对照。

按表3配置完整的rt-pcr反应体系。

rt-pcr反应程序：45℃30min，94℃5min，94℃30sec50℃30sec72℃30sec循环35次，72℃5min，4℃保存。

反应完成后，将反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，每加样孔4μl反应产物。结果表明：以lmov侵染的百合叶片总rna为模板，反应后反应液电泳显示410bprt-pcr扩增特异带型；空白对照中，反应后反应液未显示有扩增条带。

二、rt-pcr灵敏性检测

应用实施例3步骤一中稀释后的lmov侵染的百合叶片总rna(浓度为100ng/μl)作为模板。

采用实施例3步骤一稀释的模板进行rt-pcr，其他试剂按表3配置完整的rt-pcr反应体系。rt-pcr反应程序：45℃30min，94℃5min，94℃30sec50℃30sec72℃30sec循环35次，72℃5min,4℃保存。

结果见图3b(泳道1为浓度为5ng/μl的模板，泳道2为浓度为0.5ng/μl的模板，泳道3为浓度为0.05ng/μl的模板，泳道4为浓度为0.005ng/μl的模板，泳道5为浓度为0.0005ng/μl的模板，泳道6为浓度为0.00005ng/μl的模板，泳道7为浓度为0.000005ng/μl的模板，泳道8为浓度为0.0000005ng/μl的模板)。靶序列为410bp。rt-pcr方法的检测灵敏度检测的下限是0.005ng/μl，灵敏度比实施例3的方法低2个数量级。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>北京农学院

<120>检测百合斑驳病毒的引物组合物及其应用

<130>whoi170063

<141>2017-08-28

<160>6

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<212>dna

<213>人工序列(lilymottlevirus)

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