一株控制苹果采后青霉病的酵母菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种拟粉红锁掷孢酵母(sporidioboluspararoseus)16，该菌株可以控制苹果采后青霉病的发生，属于生物防治技术领域。

背景技术：

苹果(malusdomestica)是蔷薇科苹果属植物，果实含有丰富的营养物质，含有锌、铁等微量元素，有“水果之王”的美称，深受各国人民的喜爱。目前，我国是世界上最大的苹果种植国，然而我国苹果种植的区域相对分散，所以在苹果收购和运输环节中，由于其储藏能力较差，同时缺乏专业化的冷藏运输工具，因而对苹果产业造成的损失是巨大的。据不完全统计，发达国家每年果蔬贮藏的腐烂损失达10％-30％，而发展中国家由于冷藏或运输设备简陋，导致其损失更高，甚至超过50％。我国的果蔬采后损失也高达30％-40％。果蔬采后腐烂主要是由真菌引起的，严重缩减了苹果的贮藏期限。

苹果青霉病是苹果贮藏期间常见的采后病害，是由扩展青霉(penicilliimexpcmsum)引起的。由于苹果的果肉脆嫩多汁，在采摘或运输过程中极易引起损伤，致病菌便会从伤口处或皮孔处侵入苹果组织，扩展青霉能产生大量的分生孢子，病害可以迅速传播，产生巨大的经济损失。而扩展青霉的次生代谢产物展青霉素，对人类危害较大，在苹果和果汁中多次检测到展青霉素的存在，严重威胁着人类健康。当苹果果实被扩展青霉侵染时，会产生淡黄色或褐色的圆形病斑，腐烂组织松软多汁，有浓重的霉腐气味。

传统的控制苹果青霉病的方法是使用化学合成杀菌剂，然而，随着化学杀菌剂的持续和大量使用，病原体逐渐产生了抗药性，不仅防治效力降低，而且化学残留物也会对食物造成污染。因此，人们迫切寻求可替代化学杀菌剂的新方法。近年来，生物防治因其安全、绿色、高效等优点成为一种有发展前景的防治方法。可用于果蔬采后病害生物防治的微生物种类较多，主要包括细菌、霉菌和酵母菌等。迄今为止，研究人员已经从苹果、柑橘、桃等十余中水果上筛选出对主要采后病害具有明显拮抗效果的上百种拮抗菌。目前，文献报道可以用于控制苹果采后由扩展青霉引起青霉病的拮抗酵母菌主要有橄榄假丝酵母(candidaoleophila)、清酒假丝酵母(candidasake)、浅白隐球酵母(cryptococcusalbidus)、季也蒙毕赤酵母(pichiaguilliermondii)、粘红酵母(rhodotorulaglutinis)等。由于已报道的拮抗酵母菌对苹果采后青霉病的控制作用实验中所用酵母菌浓度及霉菌浓度有所不同，或者是培养时间不同，因此数据之间无法进行横向比较，同时，暂未有相关专利数据公开。

本发明中的拟粉红锁掷孢酵母16，经急性毒性试验证明是安全的酵母。研究结果表明，该酵母能显著控制苹果采后青霉病的发生，可以作为拮抗酵母菌用于控制苹果采后腐烂的商业化菌株。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株分离自葡萄园的能够高效控制苹果采后青霉病的发生的菌株——拟粉红锁掷孢酵母16。利用该菌株可实现对苹果采后青霉病害的控制。

从江苏省镇江市上党镇的葡萄园中取样分离纯化得到该酵母，在nyda固体培养基平板上和nydb液体培养基中28℃培养，进行形态学观察；对该菌株的5.8srdna-its区序列分析，进行分子生物学鉴定，并通过小白鼠急性毒性试验确定该酵母的安全性。拟粉红锁掷孢酵母16已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)。菌株名称为拟粉红锁掷孢酵母16，建议的分类命名为拟粉红锁掷孢酵母(sporidioboluspararoseus)。其保藏编号为cgmccno.2.5351，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏时间：2017年07月17日。

上述一株控制苹果采后青霉病的酵母菌的使用方法，按照下述步骤进行：

(1)将拟粉红锁掷孢酵母16在装有50mlnydb(酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水1000ml)的三角瓶中活化培养，28℃、180rpm摇床培养20h，取菌液8000rpm离心10min，弃上清，无菌水反复清洗3次，然后将菌体用无菌水稀释成1×10⁶至1×10⁹个/ml的菌悬液。

(2)在苹果果实表面赤道部位用灭菌的打孔器打3个分布均匀且大小、深度一致的伤口(5mm×3mm)。用移液器向伤口处加入等体积的拟粉红锁掷孢酵母16和扩展青霉孢子悬液(5×10⁴个/ml)共处理苹果，室温下放置1h左右，将苹果置于塑料筐中，用保鲜膜密封起来，置于恒温恒湿(20℃，95％rh)的培养箱内，6天后测定果实的腐烂率及伤口的腐烂直径，发现拟粉红锁掷孢酵母16能够显著抑制苹果伤口处青霉病的发生，且酵母浓度越高，腐烂率越低；当酵母浓度为1×10⁹个/ml时，苹果青霉病腐烂率为10.3％，对照为100％。

拟粉红锁掷孢酵母16菌株采用常规的斜面保藏。

本发明的优点：

(1)本发明所使用的拟粉红锁掷孢酵母16，系从生态果园的葡萄中筛选得到，其拮抗效力强，对人体无害，尤其对苹果的青霉病具有很强的抑制作用；

(2)本发明使用的拟粉红锁掷孢酵母16，经icr小鼠急性毒性试验，确定其具有高度安全性，对人体无害，可广泛的应用于水果上对扩展青霉的控制，并可保证水果的食用安全性；

(3)本发明使用的拟粉红锁掷孢酵母16，可替代化学杀菌剂应用于水果采后病害防治，避免使用化学杀菌剂对人和环境的危害，并且易获得，操作简单，具有显著的经济效益和社会效益。

通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。

附图说明

图1为本发明拟粉红锁掷孢酵母16的5.8srdna-its区序列进化关系图。

图2为本发明中拟粉红锁掷孢酵母对苹果采后青霉病腐烂率的影响。注：ck为对照，a,b,c,d分别代表不同的s.pararoseus菌悬液浓度(个/ml),a:1×10⁶,b:1×10⁷,c:1×10⁸,d:1×10⁹,不同的小写字母代表差异显著性(p<0.05)。

图3为本发明中拟粉红锁掷孢酵母对苹果采后青霉病腐烂直径的抑制效果。注：ck为对照，a,b,c,d分别代表不同的s.pararoseus菌悬液浓度(个/ml),a:1×10⁶,b:1×10⁷,c:1×10⁸,d:1×10⁹,不同的小写字母代表差异显著性(p<0.05)。

具体实施方式

实施例1：拟粉红锁掷孢酵母的微生物学特性：

1、形态学特征

(1)在nyda固体培养基平板(酵母菌膏5g，牛肉菌膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水1000ml，琼脂20g，121℃湿热灭菌20min)上28℃培养48h，菌落呈圆形、形成粉红色的菌落、较湿润、易挑起。细胞形态呈长椭圆形，单个分散。

(2)在nydb液体培养基中培养24h后，不形成醭，菌液浑浊，有沉淀，镜检酵母细胞呈椭圆形，芽殖。

2.分子生物学鉴定

对筛选菌株拟粉红锁掷孢酵母16的5.8srdna-its区序列分析，在genbank上检索，确定为拟粉红锁掷孢酵母(sporidioboluspararoseus)。根据检索到的同源菌株，应用dnastar软件的mege5.1程序，构建生物进化关系树如图1。

本发明所提供的防治苹果采后青霉病酵母菌株16，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)。菌株名称为拟粉红锁掷孢酵母16，建议的分类命名为拟粉红锁掷孢酵母(sporidioboluspararoseus)。其保藏编号为cgmccno.2.5351，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏时间：2017年7月17日。

实施例2：拟粉红锁掷孢酵母16的安全性研究

所用动物为icr小鼠，由江苏大学实验动物中心提供，清洁级。每个实验组20只小白鼠，雌雄各半。采用灌胃方式，按0.1ml/l0g体重(10000mg/kg剂量组按0.2ml/10g体重)给受试物，酵母配成浓度为1×10⁹个/ml的菌悬液，对照组(ck)灌入同量的无菌水。连续实验15d，灌入酵母的小白鼠15d内未出现死亡，且整个实验过程中小白鼠未出现中毒现象，根据急性毒性试验国标可以判定，实验酵母安全无毒。实验结果见表1。

表1拟粉红锁掷孢酵母16的小白鼠毒性实验

实施例3：拟粉红锁掷孢酵母对苹果采后青霉病的控制效果

将活化后酵母接种在装有50mlnydb(酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水1000ml)的三角瓶中，28℃、180rpm摇床培养20h。取菌液8000rpm离心10min，弃上清，无菌水反复清洗3次，血球计数板计数配成浓度为1×10⁶个/ml至1×10⁹个/ml的菌悬液，在苹果果实表面赤道部位用灭菌的打孔器打3个分布均匀且大小、深度一致的伤口(5mm×3mm)。用移液器向伤口处注入30μl(1)s.pararoseus酵母菌悬液(浓度为1×10⁶-10⁹个/ml四个梯度)；(2)无菌蒸馏水(对照)。放置2h后，再在每个伤口处注入30μlp.expansum孢子悬浮液(5×10⁴个/ml)。室温下放置1h左右，将苹果置于塑料筐中，用保鲜膜密封起来，置于恒温恒湿(20℃，95％rh)的培养箱内，6天后测定果实的腐烂率及伤口的腐烂直径。每个处理12个果实，整个试验重复3次。

按照上述步骤试验，6天后统计的苹果腐烂率和腐烂直径如图2和图3所示。

从图2可以看出，与对照组相比，不同浓度的s.pararoseus酵母菌悬液均能显著抑制苹果青霉病的发病率，且酵母的浓度越高腐烂率越低。当s.pararoseus的浓度为1×10⁸和1×10⁹个/ml时，青霉病的腐烂率分别为21.5％和10.3％，而此时对照组的腐烂率为100％。实验结果表明s.pararoseus可以显著抑制苹果采后青霉病的发生。由图3可知，苹果接种不同浓度的s.pararoseus后，其腐烂直径分别为15.11mm，12.45mm，9.51mm和8.03mm，均显著低于对照(18.35mm)，且s.pararoseus浓度越高，苹果伤口处腐烂直径越小。当s.pararoseus浓度为1×10⁸个/ml和1×10⁹个/ml时，苹果的腐烂直径最小。

实施例4：拟粉红锁掷孢酵母16的保藏

保藏采用的培养基首选nyda培养基(酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，琼脂15-20g，蒸馏水1000ml)，也可以使用马铃薯琼脂培养基(pda)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，自来水1000ml，ph自然，26℃-28℃，培养36h。