一种多粘类芽孢杆菌抑菌制剂及其制备方法与流程

本发明涉及植物病害的生物防治，属于植物保护学科中的生物防治研究与应用领域。

背景技术：

目前生产上对植物病害的防治多使用化学药剂进行防治。但是化学药剂的滥用引起了一系列的生态安全与食品安全问题，因此利用有益微生物来控制病害发生发展相较之下更具潜力。

已报道的生防菌种类繁多，其中多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)，对植物具有非致病性，不仅能够产生生长素、细胞分裂素等植物激素促进植物生长，还可以产生多粘菌素(polymyxin)、粘菌素(colistin)、paenibacillin、gavaserin和saltavidin、乔利肽菌素(jolipeptin)、谷缬菌素(gatavalin)、多肽菌素(polypeptins)、杀镰孢菌素(fusaricidins)等抑菌物质抑制病害的发展。

中国专利申请201610422377.5(公开日2016年11月16日)公开了一株多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)cgmccno.12410，具有抑菌广谱性，田间防治番茄灰霉病的效果明显，比速克灵的防效提高57.3％。但实践中发现，在制备生物防治菌剂时，不同制备方法得到的产品差异显著，因此，针对该菌剂的制备方法有待进一步研究。

技术实现要素：

为了提高多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)cgmccno.12410的抑菌物质的提取量和抑菌的能力，本发明提供了一种专门针对该菌的抑菌物质的提取方法，有效地解决了上述问题。

一种多粘类芽孢杆菌抑菌制剂的制备方法，是将多粘类芽孢杆菌cgmccno.12410在kl培养基中发酵36h，取其发酵上清或菌体甲醇提取物作为抑菌制剂。

本发明还公开了由上述方法制得的多粘类芽孢杆菌抑菌制剂。

本发明进一步公开了所述的多粘类芽孢杆菌抑菌制剂在拮抗多种植物病原真菌的抑菌物质的应用。特别是在防治番茄灰霉病中的应用。

本发明为了提高多粘类芽孢杆菌的抑菌物质的提取量和抑菌的能力，对它的培养基和培养时间进行选择。结果证明菌株cgmccno.12410在所选培养基中培养3d后，培养基kl、pdb、landy的发酵上清抑菌效果较好，抑菌率均在85％以上；培养基tsb、lb的发酵上清没有抑菌活性；培养基kl、pdb、nb的菌体甲醇萃取物抑菌效果较好，抑菌率均在80％以上；培养基tsb与lb的菌体甲醇萃取物没有显著抑菌活性，抑菌率均在15％以下。在kl培养基中，培养36h后，菌株cgmccno.12410的菌浓度、发酵液上清与菌体甲醇萃取物的抑菌能力均达到最高，是最佳培养时间。

多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)cgmccno.12410菌体甲醇萃取物能够抑制番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)生长，对其它病菌如黄瓜枯萎病菌(fusariumoxysporum)、桃褐腐病菌(moniliafructicola)、水稻稻瘟病菌(pyriculariaoryzae)等也有较好的拮抗作用。

同时，将菌株cgmccno.12410菌体甲醇萃取物在番茄果实上进行灰霉防病接种实验，抑菌效果明显，抑菌率达到88％以上。

附图说明

图1为不同培养基对菌株cgmccno.12410的菌体浓度及抑菌能力的影响。

图2为培养时间对菌株cgmccno.12410菌浓度及抑菌能力的影响。

图3为菌株cgmccno.12410的菌体甲醇萃取物抑菌谱。(显著性差异的5％显著水平用a、b、c、cd、d来表示，不同字母表示差异显著。其中a和d差异最为显著，cd和d有较显著的差异)

图4为菌株cgmccno.12410菌体的甲醇萃取物对番茄灰霉病防效测定。图中：上一行为处理组，下一行为对照组

具体实施方案

实施例1：菌株cgmccno.12410培养基的选择

(1)将菌株cgmccno.12410以5％的接菌量分别接入nb、lb、kb、landy、pdb、tsb、gsc培养基中，每处理设3个重复，在28℃、180r/min条件下培养3d。

(2)用紫外可见分光光度计分别检测其odat600值检测其菌浓度。

(3)将培养3d后的培养基分别取40ml以12000rpm/min转速离心，取上清，菌体留用。将上清用0.22μm细菌滤器过滤。将滤后上清以20％的量加入pda中混匀倒置平板，对应无菌培养基以等量配比混合pda倒置平板作为对照，平板的中央接种直径为9mm的番茄灰霉菌饼，每组设3个重复。待对照平板灰霉菌长满，调查对照及相应处理平板菌落直径。

(4)将留用菌体用4ml甲醇溶液混匀，4℃条件下过夜萃取，以12000rpm/min转速离心，取上清，用0.22μm尼龙膜滤小器过滤。将有机滤液以1％的量加入pda中混匀倒置平板，均以无菌甲醇以等量配比混合pda倒置平板作为对照，平板的中央接种直径为9mm的番茄灰霉菌饼，每组设3个重复。待对照平板灰霉菌长满，调查所有平板菌落直径。

结果证明菌株cgmccno.12410在nb培养基中菌浓度最高，odat600nm的值为1.66；其次为gsc、landy、kl、pdb培养基，odat600nm的值均在1.00以上；在tsb和lb培养基中增长缓慢，odat600nm的值均在0.35以下。培养基kl、landy、pdb发酵上清显示有较高的抑菌活性，抑菌率分别为85.9％、81.9％、88.6％。其它培养基显示较弱的抑菌活性甚至没有抑菌活性。培养基nb、pdb、kl菌体甲醇提取物显示有较高的抑菌活性，抑菌率分别为84.7％、85.2％、80.5％。综合抑菌效果来看，pdb与kl培养基有益于菌株cgmccno.12410抑菌物质的产生(图1)。本发明选择kl培养基做进一步培养时段的选择。

实施例2：培养时间的选择

(1)将菌株cgmccno.12410以5％的接菌量接入100ml的kl培养基中(500ml锥形瓶)，在28℃、180r/min条件下培养，每12h取一次样，每次取2ml，48h后结束取样。

(2)将取得样品用紫外可见分光光度计检测其odat600值检测其菌浓度。

(3)将取1ml样品以12000rpm/min转速离心，取上清，菌体留用。将上清用0.22μm细菌滤器过滤。

(4)将留用菌体用1ml甲醇溶液混匀，4℃条件下过夜萃取，以12000rpm/min转速离心，取上清，用0.22μm尼龙膜滤小器过滤。

(5)将直径为9mm的番茄灰霉菌饼接种到pda平板的中央，培养1～2天后，在pda平板四周距菌落边缘12mm处打4个直径9mm孔，分别加入50μl上述(3)、(4)处理液，每处理设3个重复。3天后测量其抑菌带宽，每处理设3个重复。测量其抑菌物质存在胞内还是胞外。

结果表明菌株cgmccno.12410接种在kl培养基中后，菌浓度迅速增长，在36h时达到最高，odat600值为1.32，随着时间的推移菌浓度降低。上清的抑菌带宽伴随着菌浓度的增长也有所上升在36h时达到最高为4mm，随后迅速下降。菌体甲醇萃取物抑菌带宽在36h时达到最高为6.2mm，之后抑菌带宽趋于稳定。所以最终结果表明菌株cgmccno.12410在kl培养基中的最佳培养时间为36h(图2)。

实施例3：菌体甲醇萃取物

将在kl培养基中提取的菌体甲醇萃取物以1％的量加入pda中混匀倒置平板，分别接种水稻纹枯病菌、桃褐腐病菌、黄瓜枯萎病菌、稻瘟病菌、小麦全蚀病菌、油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌等8种植物病原真菌，以甲醇作为对照，调查菌落直径。结果显示甲醇萃取物对桃褐腐病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌的抑制效果最好，抑制率分别为97.7％、84.2％、88.2％。同时它对其它病原真菌均有一定的抑菌效果(图3)。

实施例4：室内灰霉防病接种实验

选取大小成熟度一致的番茄，做直径9mm的圆形伤口，注入20μ甲醇萃取物质作为处理，以甲醇作为对照。后在伤口处接直径9mm灰霉病菌菌饼，25℃条件下加水保湿，4天后调查病菌扩展直径大小。

结果显示对照组番茄果实上病菌扩展均有4cm左右，而处理组灰霉病菌基本不扩展。甲醇萃取物质的抑制效果明显，抑制率均在88.6％以上(图4)。