本发明涉及微生物制品技术领域，特别是涉及一种发酵普洱茶用的黑曲霉菌剂及其制备方法。
背景技术：
普洱茶的发酵过程关键在于渥堆，渥堆过程中需要控制温度和氧气浓度以适宜微生物发酵，为了使茶堆上、中、下层发酵均匀，每隔7天会进行一次翻堆，一般会经过4-6次翻堆、补水后，才能发酵均匀。在渥堆发酵的前两次翻堆过程中，茶叶表层旺盛生长着可分泌大量酶类的黑曲霉，是渥堆发酵的先锋菌。
黑曲霉(aspergillusniger)：半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种，广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的发酵工业菌种。黑曲霉可产生淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等，有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯，因此在食品工业上常用作发酵菌种，如用于食醋生产中的制曲、麸曲法白酒生产中的制曲和柠檬酸发酵等。黑曲霉的生长适温37℃，最低相对湿度为88％，因能分泌淀粉酶、纤维素酶、果胶酶等，是普洱茶渥堆发酵过程的关键微生物，并以孢子形式大量存在于一翻和二翻时期(即前两次翻堆)的茶叶表层，对普洱熟茶的品质起关键作用。
传统渥堆发酵普洱茶的工艺中，接种的微生物主要来源于自然环境，如空气、土壤、雨水等；发酵场地也需要一个养地过程，即需要用发酵好的熟茶汤洒于地面，以便于富集发酵过程中所需要的微生物菌株，微生物的富集需要时间的积累，因此新发酵场地的起初几批茶很难发酵出较好的效果，造成巨大的浪费。
传统渥堆发酵受气温、天气、降雨量等因素的影响较大，因此生产效率低下，得到的普洱熟茶质量也不易控制。随着人们对普洱茶需求量的增加及对普洱茶质量要求的提高，传统渥堆发酵中的自然接种已不能满足上述需求。于是，罐式离地发酵模式正在产业化研究中，这种新的发酵模式对发酵过程中的每一步工艺条件都可以进行严格控制，接种这一步也不再采用传统的自然接种，而是直接投入用于发酵普洱茶的菌种。将微生物制备成菌粉，既便于投料、运输和储存，又可以避免外源添加物的干扰，还能够避免发酵过程中菌种的退化等限制因素的发生，成为罐式离地发酵模式中接种的新选择。
现有的黑曲霉菌粉制作工艺为:1、公开号为cn103436453a的专利申请(申请号为201310395339.1，发明名称为《黑曲霉菌c2及其菌剂》)中采用由三角瓶到发酵罐逐级放大的液体发酵分离得到黑曲霉菌c2，然后在特定培养基中添加保护剂及吸附剂后，接种黑曲霉菌c2，最后添加一定量的稻壳粉、秸秆粉和膨润土粘结造粒得到微生物菌剂。2、公开号为cn103555593a的专利申请(申请号为201310548819.7，发明名称为《黑曲霉菌株及其孢子粉的制备方法》)中采用麸皮、秸秆、无机盐等固体发酵、产孢、低温干燥、粉碎、收集孢子，得到黑曲霉菌株孢子粉。3、公开号为cn101427717专利申请(申请号200810233700.x为，发明名称为《一种普洱茶发酵种曲的制备方法》)中将黑曲霉与灰绿曲霉、常见青霉以孢子形式添加至pda培养基中，再与茶叶按一定比例混合，诱导产孢，冷冻干燥制得普洱茶发酵种曲。
前两篇专利申请得到的黑曲霉菌粉由于在制作过程中引入了外源添加物质，一般用于工业柠檬酸的发酵，若用于普洱茶的发酵，会使发酵得到的茶叶产生异杂味，无法达到普洱茶罐式发酵生产对菌种的要求。而第三篇专利申请制备得到的菌粉为复合菌粉，不适用于单菌接种和分段接种发酵普洱茶。
于是，一种适合普洱茶发酵用的黑曲霉菌剂成为本领域急需的产品。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种发酵普洱茶性能优良的黑曲霉菌剂，将黑曲霉菌株制成黑曲霉孢子悬液后接种至产孢培养基中培养得到；所述产孢培养基包括茶叶80重量份和水22-66重量份；所述黑曲霉孢子悬液的使用量为每80g茶叶中添加10μl-1000μl(优选100μl-600μl)黑曲霉菌株的活菌数为103-107个的黑曲霉孢子悬液。
其可以是黑曲霉孢子悬液接种至产孢培养基中培养得到的黑曲霉菌泥，或将所述黑曲霉菌泥冷冻干燥后得到的黑曲霉菌粉。
所述茶叶可以是云南大叶种晒青毛茶、红茶、绿茶等。
所述黑曲霉菌株分离自普洱茶渥堆茶样；分离过程包括普洱茶渥堆样品的采集、配制分离培养基、稀释涂布平板、恒温培养、菌株纯化；优选的，所述普洱茶渥堆样品的采集具体为：采集普洱茶渥堆发酵过程中的表层茶叶作为普洱茶渥堆样品；更优选的，所述配制分离培养基具体为：取马铃薯200g，葡萄糖5-20g，琼脂15g和水1000ml配制成pda培养基，115-121℃灭菌15-30min后冷却得到分离培养基平板。
所述稀释涂布平板具体为：将普洱茶渥堆样品5g置于45ml无菌水中混合后梯度稀释至10-4，取每个梯度样品100μl分别涂布于分离培养基平板上，置于37℃恒温培养；
优选的，所述菌株纯化具体为：挑取产孢菌落且孢子为黑色的单菌落，于分离培养基平板上纯化后，得到黑曲霉(aspergillusniger)。
第二方面，本发明提供了一种制备上述黑曲霉菌剂的方法，包括黑曲霉孢子悬液的配制、产孢培养基的配制、以及将黑曲霉孢子悬液在产孢培养基中接种并培养的过程；所述产孢培养基的配制具体为：将茶叶和水混合后115-121℃灭菌10-30min，冷却得到产孢培养基。
所述黑曲霉孢子悬液的配制具体为：将黑曲霉菌株接种到固体pda培养基平板上37℃活化培养至黑曲霉孢子长满培养基平板的三分之二，将长在pda培养基平板上的黑曲霉孢子刮下，加入无菌水制备成孢子浓度不小于1×103cfu/ml的黑曲霉孢子悬液；优选的，所述固体pda培养基包括去皮洗净的马铃薯200g，葡萄糖5-20g，琼脂15g和水1000ml。
所述接种并培养具体为：按体积质量比(ml/g)1:300将黑曲霉孢子悬液接种到产孢培养基中，产孢培养基的厚度为0.1-5cm，25-40℃恒温培养诱导产孢7-20d。
所述接种并培养后，还包括：将产孢培养基连同产生的黑曲霉孢子粉碎至1-60目得到黑曲霉菌泥，即为发酵普洱茶用的黑曲霉菌剂的一种形式；或，优选的，可将所述黑曲霉菌泥再冷冻至-20℃，真空干燥至含水量为8-10％，得到黑曲霉菌粉，即为发酵普洱茶用的黑曲霉菌剂的另一种形式。
第三方面，本发明提供了一种由上述方法制备得到的黑曲霉菌剂，为黑曲霉菌泥或黑曲霉菌粉，其中活孢子数为不少于109/克。
本发明的黑曲霉菌剂适用于普洱茶的发酵，菌剂中活孢子数量多，接种复苏快，保质期长，外源添加物质少，使用量少，用该黑曲霉菌剂发酵普洱茶时，一天内菌丝体就能够长满茶叶，发酵出的普洱茶质量稳定，无异味，汤色红浓明亮，杯底糖香显著。制备本发明黑曲霉菌剂的方法简单易行，可操作性强，适合工业化生产。
具体实施方式
本发明提出的发酵普洱茶用黑曲霉菌剂，将黑曲霉菌株制成黑曲霉孢子悬液后接种至产孢培养基中培养得到；所述产孢培养基按重量份数计，包括茶叶80份和水22-66份。
其中，茶叶可以是云南大叶种晒青毛茶、红茶、绿茶等干茶叶(含水量≤10％)；黑曲霉菌孢子悬液与茶叶的使用关系为：每80g茶叶加入10μl-1000μl(优选100-600μl，最优选300μl)黑曲霉菌株的菌数在103-107/g(优选105/g)之间的黑曲霉菌孢子悬液；黑曲霉菌孢子悬液中的黑曲霉菌株分离自渥堆茶样，分离过程具体包括以下步骤：
1)、普洱茶渥堆样品的采集：采集普洱茶渥堆发酵过程中的表层茶叶，装入无菌自封袋，作为普洱茶渥堆样品，置于-80℃冰箱保存备用。
2)、配制分离培养基：配置pda培养基：去皮洗净的马铃薯200g，葡萄糖5-20g，琼脂15g和水1000ml配制得到，将pda培养基在115-121℃灭菌15-30min，倒平板，冷却凝固备用，得到pda分离培养基平板。
3)、稀释涂布平板：将步骤1)的普洱茶渥堆样品(渥堆过程中任何时期的样品均可)5g置于45ml无菌水中(浓度为10-1)，于30℃摇床上120-180rpm处理15-30min,按10倍梯度稀释法将普洱茶渥堆样品稀释至浓度为10-4，每个梯度分别取100μl涂布于pda分离培养基平板。
4)、恒温培养：将涂布好的pda分离培养基平板置于37℃恒温培养箱中培养。
5)、菌株纯化、测序与保藏：挑取菌落产孢且孢子为黑色的单菌落，于固体pda分离培养基平板上纯化后，挑取部分菌体提取dna，pcr扩增后送测，返回结果在ncbi数据库进行blast比对，确定菌株为黑曲霉(aspergillusniger)，编号tmcc-70012,于2016年7月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物物中心，其保藏号为cgmccno.12763。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
制备本发明黑曲霉菌剂的方法，包括黑曲霉的培养、产孢培养基的配制、接种培养、黑曲霉孢子的收集、真空包装等；具体为：
(1)、黑曲霉的培养：以点接法将黑曲霉菌株斜面接种到固体pda培养基平板上37℃活化培养至黑曲霉孢子长满培养基平板的三分之二。(pda培养基组成：去皮洗净的马铃薯200g，葡萄糖5-20g，琼脂15g和水1000ml)
(2)、产孢培养基的配制：将茶叶(干茶叶，含水量不大于10％)和水按重量比80:(20-66)(优选80:34.5)混匀，待茶叶充分吸收水分后，即水分占总重量的20-45％(优选30％)，分装于500ml三角瓶中，每瓶10-60克(优选15-45g)，每瓶装样高度在0.1-5cm(优选1-2.5cm)；将三角瓶置于高压蒸汽灭菌锅中，115-121℃灭菌10-30min，冷却，得到产孢培养基备用。
(3)、接种培养：将步骤(1)中长在培养基平板上的黑曲霉孢子用接种环刮下，加入无菌水制备成孢子悬浮液，黑曲霉孢子的浓度不小于1×103cfu/ml；把孢子悬浮液按体积质量比(ml/g)1:300接种到步骤(2)得到的产孢培养基中，产孢培养基的高度在0.1-5cm(优选1-3cm)，25-40℃(优选37℃)恒温培养诱导产孢7-20d(优选8-14d)。
(4)、黑曲霉孢子的收集：将步骤(3)中发酵好的黑曲霉孢子连同产孢培养基一起用无菌粉碎机粉碎至1-60目(优选20-40，最优选20)，得到发酵普洱茶用黑曲霉菌泥；再冷冻至-20℃，真空干燥至含水量为8-10％左右，即得到发酵普洱茶用黑曲霉菌粉；随后用真空包装，置于4℃保存。
以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。
按上述方法制备得到一系列发酵普洱茶用的黑曲霉菌粉(实施例1-实施例6)，制备过程中的各参数如表1所示。
表1制备黑曲霉菌粉过程的各参数
比较例4-6分别为按专利申请号200810233700.x、201310395339.1和201310548819.7中方法制备得到的普洱茶发酵种曲、黑曲霉菌c2和黑曲霉菌株孢子粉。比较例7-8分别按实施例5的方法及参数进行，仅是产孢培养基的种类不同，比较例7中产孢培养基为茶叶和pda培养基混合比例是4：1；比较例8中产孢培养基为豆饼粉30-40％、花生秸秆粉20％-30％和麸皮40-50％与无机盐水溶液(每升水中加2gkh2po4、1.4gnh4(so4)2、0.3g尿素、0.3gmgso4.7h2o、0.3gcacl2、5mgfeso4.7h2o、1.56mgmnso4.h2o、1.4mgznso4.7h2o、2mgcocl2)混匀至含水量53-55％。
将实施例1-6和比较例1-7得到的黑曲霉菌粉分别与云南大叶种晒青毛茶按质量比1:500混合后，在相同条件下用罐式离地发酵模式进行普洱茶发酵，如潮水量40％，每3d翻一次茶叶，避免菌丝过于旺盛茶叶板结。发酵完成后，按《地理标志产品普洱茶》中的标准审评发酵得到的普洱茶的品质。
以实施例5为例，本发明的黑曲霉菌粉菌丝在发酵开始后1天内菌丝体即已长满茶叶，生长更为迅速；23天后发酵完成，得到的普洱茶汤色红浓明亮，杯底糖香显著，滋味丰富。
而比较例1的黑曲霉菌菌粉在发酵23天时尚未达到发酵的最佳阶段，在发酵结束后得到的普茶洱叶底略微偏绿，汤色红亮，稍带苦涩,略带酸气和培养基的味道。比较例2的菌株生长活力最弱，在发酵23天时尚未达到发酵的最佳阶段，在发酵结束后得到的普茶洱叶底偏绿，汤色仍黄亮，滋味苦涩明显，带异杂味。比较例3的菌株生长活力也相对较弱，在发酵结束后得到的普茶洱叶底偏绿，汤色仍黄亮，滋味苦涩明显，稍带酸气。比较例4-6制备的黑曲霉菌菌粉虽然产孢周期较短为范围为2-7天，但在发酵23天明显未达到发酵的最佳阶段，汤色棕黄，叶底泛绿带酸气，这是因为比较例4-6制备的黑曲霉菌粉中活菌数比本发明低了至少3个数量级。比较例7制备的黑曲霉菌菌粉在发酵23天未达到发酵的最佳阶段汤色棕黄，叶底泛绿带酸气且略带培养基的味道。比较例8因秸秆粉及麸皮等存在，在发酵完成后需再次筛选，增加了发酵茶叶的繁琐程度。
以上实验表明本发明的黑曲霉菌粉制作周期短，实施例5在7天即已达到良好的产孢状态，而比较例1在14天才达到，时间上缩短了一周；且产孢数量大于109cfu/ml，远大于比较例的107cfu/ml；此外制备过程也较比较例2简单，菌种活力强，易于储存，能存放一年以上，且发酵过程中不引入除茶叶和菌株以外的其它营养成分，较液体发酵的菌粉存放时间长，比较例2在8个月之后菌种的活力就开始大大降低。
另外，发明人在上述实验中发现先在产孢培养基上诱导产孢后粉碎，产生的孢子数量要远远大于先粉碎再诱导产孢(如比较例1)，这是因为先诱导产孢能够提供一个更良好的疏松有氧的产孢环境，也不会引入除茶叶和菌种以外的其他营养成分，发酵得到的普洱茶味道纯正，品质优良。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。