PCR‑ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及pcr-elisa法检测家蚕微孢子虫的试剂盒，还涉及检测方法。

背景技术：

家蚕微孢子虫(nosemabombycis)是一种家蚕常见的致病真菌，其引发的家蚕微粒子病是蚕桑产业中毁灭性的病害，因此家蚕微孢子虫一直被各养蚕国家和地区列为法定的蚕业生产检疫对象。为有效控制蚕业生产家蚕微粒子病，以免其引发家蚕灾难性死亡，如何在成品卵阶段完成家蚕微孢子虫的检测成为蚕业科学研究中的重要工作之一。

19世纪60年代，巴斯德(louispasteur)发现并利用家蚕微粒子病胚种传染特点，建立了通过检验母蛾的微粒子病感染情况，淘汰感染母蛾产下的卵，确保子代蚕卵无病的防控技术，并成为家蚕微粒子病防控的关键性技术。随着养蚕或蚕种生产规模、方式和技术等的变迁，该技术也随之得到很大的改进，这种改进主要表现为：单蛾全检发展为集团母蛾抽样检验而使检验效率更高，对一代杂交种采用允许一定病蛾率的判断标准而使检验制度下的蚕种生产更为经济，检测相关设施设备条件的改善使检验结果更加准确等。母蛾镜检法属于间接检查，根据微孢子虫的形态、折光性等特征用显微镜鉴别母蛾体内微孢子虫有无，进而判断蚕卵中是否有存在微孢子虫。其操作简单方便、结果直观易懂，但由于其对检测人员要求很高，母蛾样品准备繁琐，同时在镜检工作中容易将家蚕微孢子虫与真菌孢子、寄主组织碎片等混淆，降低了检测工作的速度和准确度，因此建立直接检测成品卵中家蚕微孢子虫的方法已成为蚕业科学研究的重点。

随着技术的进步以及仪器设备的更新，已经有越来越多的新型检测方法应用于家蚕微孢子虫的检测，大多基于核酸检测，例如pcr法、lamp法、荧光定pcr等，这些检测方法相对于传统的母蛾镜检来说灵敏度与准确度都更高，但是有些方法操作上对于检验人员的要求较高，需要受过专业的训练，且对仪器设备的依赖较高、成本较高，使得这些方法目前都还停留在实验室研究阶段。因此，研发一种高效、便捷、灵敏、准确、成本较低、通量高的直接检测成品卵中微孢子虫检测方法，对家蚕微粒子病的防控具有重大意义。

1997年，niemeyer等人创建的pcr-elisa技术。即将上下游引物进行标记，借助生物素-链酶亲和素系统，pcr产物与预先包被的链霉亲和素的酶标板进行孵育，再加入酶标抗体反应，最后加入底物显色，测定od值，以此方法检测某种特定基因的存在。此方法弥补了核酸检测的不足，国内外实验均表明pcr-elisa较琼脂糖电泳灵敏度高出10～100倍；另外酶标仪读出结果客观，主观干扰小；从dna提取、pcr扩增、再到微孔板孵育显色、判断结果，最快可在一个工作日完成，所用时间短；一块微孔板上可以同时检测多份样品，实现高通量快速检测；所用试剂为常用的缓冲液，配置简便，所用仪器如：酶标仪、pcr仪、温箱，是大多数实验室所具备的，有利于基层推广应用。

综上所述，在本检测方法中，于其核酸扩增过程中加入特殊的标记物，将pcr产物作为抗原进行elisa检测，可以对样品进行高通量检测且其结果判读客观。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种pcr-elisa法检测家蚕微孢子虫的试剂盒；本发明的目的之二在于提供pcr-elisa法检测家蚕微孢子虫的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

pcr-elisa法检测家蚕微孢子虫的试剂盒，所述试剂盒包含核酸分子标记物标记的检测家蚕微孢子虫的引物对和检测所述核酸分子标记物的elisa试剂；所述引物对的序列如seqidno.1与seqidno.2，seqidno.43与seqidno.44，seqidno.49与seqidno.50，seqidno.75与seqidno.76或seqidno.77与seqidno.78所示。

本发明优选的，所述引物对的序列如seqidno.49与seqidno.50所示。

本发明优选的，检测所述核酸分子标记物的elisa试剂包括浓度如下的组分：1μg/ml链霉亲和素、含体积分数为2％胎牛血清的pbs溶液、酶标dig抗体、pbst溶液、体积分数30％的h2o2、500mm草酸。

本发明优选的，所述核酸分子标记物为生物素和地高辛。

本发明更优选的，所述试剂盒还包括样品处理试剂，所述样品处理试剂包括质量分数10％的koh，stp裂解液，直径425-600μm的玻璃珠，20mg/ml蛋白酶k，质量分数10％的sds，酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1的混合液，和无水乙醇；所述stp裂解液各组分浓度如下：质量分数1％sds，质量分数1％的tritonx-100和质量分数1％的nonidetp40。

2、pcr-elisa法检测家蚕微孢子虫的方法，包括如下步骤：

(1)样品处理：

a.取蚕卵，加入质量分数为10％的koh处理使卵壳充分软化；

b.加入stp裂解液，并加入直径425-600μm的玻璃珠，放入孢子破碎仪中，破碎三次，每次5min；

c.1000rpm离心2min，将上清转移至离心管中；

d.加入浓度为20mg/ml的蛋白酶k和质量分数10％的sds，55℃处理30min；

e.加入酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1的混合液充分混匀后，于12000rpm离心5min，吸取上清置于离心管中，并重复此步骤；

f.向上清液中加入无水乙醇，上下颠倒两次后12000rpm离心5min；

g.充分倒掉液体，倒置于吸水纸上，静置5min，加入双蒸水使dna溶解制得待检测样品模板；

(2)将经步骤(1)处理的获得待检测模板用核酸分子标记物标记的检测家蚕微孢子虫的引物对进行pcr扩增，所述引物对的序列如seqidno.1与seqidno.2，seqidno.43与seqidno.44，seqidno.49与seqidno.50，seqidno.75与seqidno.76或seqidno.77与seqidno.78所示；

(3)将步骤(2)扩增后的产物进行elisa，检测在405nm处od值，检测健康蚕卵基因组为模板的扩增产物为阴性样本，od值大于阴性对照od值2.1倍的样本即为阳性样本；od值小于阴性对照od值2.1倍的样本即为阴性样本。

本发明中，步骤(2)中，所述pcr扩增条件为98℃预变性2min，98℃变性10sec，64℃退火15sec，68℃延伸35sec，扩增30个循环；最后68℃延伸3min。

本发明中，步骤(3)中，所述elisa检测具体步骤如下：

a)酶标板每孔加入1μg/ml的链霉亲和素溶液，4℃过夜或18～25℃处理3h；

b)甩干板内液体，每孔加入pbst，震荡5min，甩干板内液体，重复四次；

c)将pcr产物用含体积分数为2％胎牛血清的pbs溶液稀释50倍后加入酶标板，每个样品三个重复，18～25℃孵育2h；

d)甩干板内液体，每孔加入pbst，震荡5min，甩干板内液体，重复四次；

e)加入用含体积分数为2％胎牛血清的pbs溶液按1:1000稀释的酶标dig抗体稀释液，18～25℃孵育45min；

f)甩干板内液体，每孔加入pbst，震荡5min，甩干板内液体，重复四次；

g)加入体积比为1:1000的体积分数30％的h2o2和pbst溶液，避光孵育15min；

h)加入浓度500mm的草酸溶液进行终止，并在405nm测定od值。

本发明的有益效果在于：本发明公开了pcr-elisa法检测家蚕微孢子虫的试剂盒，通过以标记的特异性引物对扩增合适的基因片段，能保证扩增结果的特异性，从而保证了检测结果的准确性；再将扩增产物进行elisa，使得整个检测过程在保持检测结果客观性的基础还检查多个样本实现高通量；且筛选到种特异性引物，对于鉴别微孢子虫感染以及其病原流行病学有重要意义。因此本发明是一种理想的家蚕成品卵中家蚕微孢子虫的检测手段。

本专利提供的检测家蚕成品卵中家蚕微孢子虫的试剂盒，还具有如下优点：

高通量：一次实验可检测多个样本，且elisa可进行流水操作；

灵敏度：比琼脂糖凝胶电泳灵敏10倍，可检出光学显微镜中无法检出的家蚕微孢子虫；

特异性高：进行了大量的引物筛选，得到了种特异性的引物，可单一的检测家蚕微孢子虫；且与前期得到的属特异性相结合，可区别鉴定感染微孢子虫种属特征。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为不同引物扩增家蚕微孢子虫基因组dna电泳图(a：其中15对引物扩增结果图；b：14对引物扩增结果图；c：15对引物扩增结果图)。

图2为6对引物特异性检测(a：op1-748、j-183、k-245、m-247四对引物特异性检测结果；b：u-245和u-256两对引物特异性检测结果；n.b表示家蚕微孢子虫；v.n表示纳卡变形微孢子虫；n.p表示蜜蜂微孢子虫；n.a表示柞蚕微孢子虫)。

图3为修饰引物假阳性检测。

图4为灵敏度测试(a：引物lus323灵敏度；b：m247灵敏度；p.阳性对照；n.阴性对照从左往右依次为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10个家蚕微孢子虫，分别与50粒健康蚕卵混合)。

图5为带毒蚕卵检测(a：lsu323；b：m247；p.阳性对照，n.阴性对照，1.带毒蚕卵)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、引物筛选

采用ctab法，提取家蚕微孢子虫基因组dna。

同时提取柞蚕微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、纳卡变形微孢子虫基因组作对照。

然后根据家蚕微孢子虫基因组与其他几种微孢子虫基因组相比对，筛选出相似性低于30％的序列进行引物设计。

具体引物如下表1所示。

表1.微孢子虫检测引物对

以家蚕微孢子虫基因组dna为模板，表1所示的序列为引物进行pcr扩增，pcr扩增体系如表2下所示：

表2、pcr扩增体系

按如下条件扩增，98℃预变性2min；98℃变性10sec，64℃退火15sec，68℃延伸35sec，30个循环，最后68℃后延伸3min。扩增产物取10μl用于琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳条件为：1×tae缓冲液，电压180v，电泳时间30min，结果如图1所示。结果显示，设计的44对引物中，引物对0p1-748、j183、k245、m247、u245、u256、v220、v231八对引物无二聚体产生且条带明亮。之后用梯度稀释的家蚕微孢子虫基因组进行pcr，结果显示op1-748、j183、k245、m247、u245、u246灵敏度较高，所以选择了这六对引物进行下一步实验。

实施例2、特异性实验

按照实施例1的方法用筛选到的六对引物分别检测如下模板：①家蚕微孢子虫dna；②纳卡变形微孢子虫dna；③柞蚕微孢子虫dna；④蜜蜂微孢子虫dna；采用takara公司的mightyampdnapolymerasever.3，总反应体系为25μl。用appliedbiosystemspcr仪进行扩增，反应参数为：98℃预变性2min；98℃变性10sec，64℃退火15sec，68℃延伸35sec，30个循环；最后68℃延伸3min，12℃保存。取10μl扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，然后通过溴化乙锭染色，在紫外灯下观察判断是否有特异性条带产生，结果如图2中所示。结果显示其中op1-748、k245、m247、u245、u246五对引物能够特异性的扩增出家蚕微孢子虫dna，所以选择这五对引物进行修饰标记，所述核酸分子标记物为上有引物生物素(biotin)和下游引物地高辛(dig)。

实施例3、假阳性检测

为检测标记引物是否存在假阳性，阳性以家蚕微孢子虫dna作为模板，阴性以ddh2o做模板，并按已建立的pcr体系进行扩增。扩增完成后取10μl用于琼脂糖凝胶电泳。凝胶电泳条件为：1×tae缓冲液，电压180v，电泳时间30min。同时用elisa检测，结果如图3所示。结果显示，其中除u245无法的到阳性结果外，op1-748、k245、m247、u246、lsu323皆能得到阳性结果，且阴性对照与空白对照od接近，可进行下一步实验。其中lsu323具体序列参见文献(倪琪，家蚕微粒子虫核酸侧向层析试纸条检测方法的建立[d]，重庆，西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室，2016.)。

实施例4、样品处理方法

家蚕成品卵中家蚕微孢子虫核酸扩增检测的样品处理方法，包括如下步骤：

a.取50粒蚕卵于2ml细胞冻存管中，加1ml质量分数为10％的koh处理6min(视卵壳厚度微调处理时间)，使卵壳充分软化。

b.加入200μlstp裂解液(1wt％sds，1wt％tritonx-100，1wt％nonidetp40)，加入3g425-600μm(30-40u.s.sieve)玻璃珠，放入孢子破碎仪中，破碎三次，每次5min。

c.1000rpm/min离心2min，将上清转移至新的1.5ml离心管中。

d.加入20μl20mg/ml蛋白酶k和30ml10％sds，55℃处理30min。

e.加入300μl酚氯仿(酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)充分混匀后12000rpm/min离心5min。吸取上清置于新1.5ml离心管中，重复步骤5。

f.吸取上清置于新1.5ml离心管中，加入300μl无水乙醇，上下颠倒两次后12000rpm/min离心5min。

g.充分倒掉液体，倒置于吸水纸上，静置5min，加入50μl双蒸水使dna溶解。

实施例5、灵敏性试验

在之前筛选到的引物中选择m247和lsu323进行下一步实验。为检测pcr-elisa的灵敏度，将家蚕微孢子虫计数后稀释为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10个家蚕微孢子虫，分别与50粒健康蚕卵混合，按照实施例4处理样品dna，并按已建立的pcr体系进行扩增，阳性对照以家蚕微孢子虫dna作为模板，阴性对照为健康蚕卵dna作为模板。扩增完成后取10μl用于琼脂糖凝胶电泳。凝胶电泳条件为：1×tae缓冲液，电压180v，电泳时间30min。同时用elisa检测，结果如图4所示。结果显示，两对引物的灵敏度皆能达到10³spose/50粒蚕卵，且elisa较传统的凝胶电泳的灵敏度增加了10～100倍。

实施例6、家蚕微孢子虫检测

快速检测家蚕微孢子虫的方法，包括如下步骤：

实施例5处理的待测样品dna，然后以核酸分子标记物标记的引物进行pcr扩增，阳性对照以家蚕微孢子虫dna作为模板，阴性对照为健康蚕卵dna作为模板，收集扩增产物；其中pcr扩增条件为98℃预变性2min，98℃变性10sec，64℃退火15sec，68℃延伸35sec，扩增30个循环；最后68℃延伸3min。

b.将步骤a扩增得到的产物进行elisa，od大于阴性对照od值2.1倍的样本即为阳性样本；od小于阴性对照od值2.1倍的样本即为阴性样本；

a)酶标板每孔加入100μl链霉亲和素溶液，4℃过夜或室温3h；

b)甩干板内液体，每孔加入200μlpbst，震荡5min，甩干板内液体，重复四次；

c)将pcr产物用含2％体积分数fcs(胎牛血清)/pbs稀释至50倍后加入酶标版，即2μlpcr产物加入98μl2％fcs/pbs，每个样品三个重复，室温孵育2h；

d)甩干板内液体，每孔加入200μlpbst，震荡5min，甩干板内液体，重复四次；

e)加入100μl酶标dig抗体(1:1000，2％fcs/pbs)，室温孵育45min；

f)甩干板内液体，每孔加入200μlpbst，震荡5min，甩干板内液体，重复四次；

g)加入30％h2o2和100μlabst溶液(1:1000)，避光孵育15min；

h)加入50μl草酸溶液进行终止，并在405nm测定吸光度，结果如图5所示。

同时以将实施例1的方法进行pcr扩增作为对照，扩增产物取10μl用于琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳条件为：1×tae缓冲液，电压180v，电泳时间30min。同时扩增产物用elisa检测，检测结果如图5所示。

结果显示，带毒母蛾所产蚕卵和阳性质粒结果呈阳性，而健康蚕卵结果呈阴性，且pcr-elisa灵敏度高于pcr法，表明本发明的pcr-elisa能够用于蚕卵中家蚕微孢子虫检测。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

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