一种玉米耐低磷相关的Indel标记及应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种玉米耐低磷相关的indel标记及应用。

背景技术：

功能分子标记(functionalmarkers)是基于目的基因基序中功能性核酸多态性位点开发而成的一类新型分子标记。关联分析方法依赖于基因组中等位基因单倍型的非随机性为基础的连锁不平衡，该方法可用于鉴定表型相关的基因和基因内部的功能基序。以一些相互间无亲缘关系的种质资源，纯系品种或者自交系为材料，针对候选基因区段进行序列多样性分析，结合生物材料的表型数据，采用统计学的方法，从而检验表型变异与候选基因序列多样性之间的关联，也是一种检验候选基因表型功能的途径(whittsr,buckleres.usingnaturalallelicdiversitytoevaluategenefunction[j].plantfunctionalgenomics,2003:123-139；wilsonlm,whittsr,am,etal.dissectionofmaizekernelcompositionandstarchproductionbycandidategeneassociation[j].theplantcell,2004,16(10):2719-2733.)。若二者之间存在显著关联，则来源于该位点的可检验该序列的多样性的分子标记，即成为相应的功能标记。此方法可充分利用自然进化和人工进化过程中所积累的遗传重组，从而高分率地检验现存物种中候选基因的遗传多样性与表型变异之间的关系，最终识别功能性的多态性及互作(baojs,corkeh,sunm.nucleotidediversityinstarchsynthaseiiaandvalidationofsinglenucleotidepolymorphismsinrelationtostarchgelatinizationtemperatureandotherphysicochemicalpropertiesinrice(oryzasatival.)[j].theoreticalandappliedgenetics,2006,113(7):1171-1183.)，进而获得功能标记。关联分析提供了统计学上的间接证据，故被称为间接类型的功能标记。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种玉米耐低磷相关的indel标记及应用，利用ril(recombinantinbredlines,重组自交系)群体zmphr1基因的分离，和该ril群体的表型变异数据，推测一个indel标记(insertion-deletion插入缺失标记)的遗传效应。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种玉米耐低磷相关的indel标记，该indel标记位于玉米的第一条染色体zmphr1基因的1395bp位置，等位基因为tctgt的缺失。

本发明还公开了一种上述的indel标记在玉米育种中的应用。

本发明还公开了一种上述的indel标记在提高玉米根尖数中的应用。

本发明还公开了一种检测上述的indel标记的引物对，

上游引物：tgttgtgggaggcagtt，如seqidno.1所示；

下游引物：cctaagagccctacgaaat，如seqidno.2所示。

本发明还公开了一种上述的引物对在玉米种质改良中的应用。

本发明还公开了一种检测玉米耐低磷相关基因zmphr1的方法，用上述的引物对进行pcr扩增待检测玉米基因组dna，如果能够扩增出缺失tctgt片段，则说明该待检玉米存在耐低磷相关基因zmphr1基因。

本发明还公开了一种检测玉米耐低磷相关基因zmphr1的试剂盒，其含有seqidno.1和seqidno.2所示的引物对。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

本发明通过对ril群体亲本进行zmphr1比对发现在178材料序列1395bp位置处缺失tctgt，于是设计引物在ril群体材料中按此等位基因进行分型，并与两年该群体低磷下的相关根系表型做统计分析，结果推测得出在zmphr1序列1395bp位置处插入tctgt的等位基因型被视作优异/增效等位基因型，此基因型玉米材料在低磷胁迫下的根系表型相对更好。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明等位基因tctgt在3个玉米材料中的示意图；

图2是本发明聚丙烯酰胺凝胶电泳和测序结果示意图；其中，a代表聚丙烯凝胶电泳图，a中1-12分别代表ril群体的不同个体，b代表等位基因tctgt测序示意图；

图3是本发明zmphr1的等位基因与表型性状的分离验证(1)；注：*p<0.05；**p<0.02；***p<0.01；ck：正常磷对照；t：低磷处理；

图4是本发明zmphr1的等位基因与表型性状的分离验证(2)；注：*p<0.05；**p<0.02；***p<0.01；ck：正常磷对照；t：低磷处理；

图5是本发明zmphr1的等位基因与表型性状的分离验证(3)；注：*p<0.05；**p<0.02；***p<0.01；ck：正常磷对照；t：低磷处理。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1ril群体的等位基因分型

在对ril群体亲本1(玉米耐低磷自交系178)、亲本2(玉米低磷敏感自交系9782)和参照序列b73的zmphr1基因序列比对中，178材料在zmphr1基因序列第一个内含子内1395bp缺失tctgt的indel(图1)。

本发明依据这个indel将材料分成的两个等位基因型，在271份ril群体(178×9782)dna中设计引物(引物编号19w012，f：tgttgtgggaggcagtt(seqidno.1所示)；r：cctaagagccctacgaaat(seqidno.2所示))，pcp扩增包含这个indel的片段；pcr、电泳和测序方法如下：

(1)pcr扩增

在200份ril群体基因组dna中pcr扩增zmphr1基因indel标记。扩增采用taqmix酶。taqmix酶的pcr扩增体系如下:

pcr反应程序：

(3)扩增产物送测序

根据测序结果，统计分离的两种基因型材料的编号和各组数目。

(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳

将扩增产物上样于6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，75w电泳1.5h，银染显色直观地看扩增产物大小区别。具体实验操作步骤如下：

a)准备亲水板和疏水板：在做胶前，先将亲水板和疏水板刷洗干净，并放置通风橱中晾干。用75％酒精清洁2遍板面，切勿在版面上留下纸屑。用适量剥离硅烷溶液均匀且快速地涂抹疏水板，1ml亲水硅烷溶液均匀且快速地涂抹亲水板。

b)装板：将亲水板在下疏水板在上的方式放置，两板之间边缘处放置两根压条形成板间空隙，再使用钢夹将亲水板和疏水板固定，钢架力道均匀保证两板间缝隙大小一致。试插梳子至整个灌胶口均匀合适并用水平仪调试电泳玻璃板至水平。

c)6％聚丙烯酰胺凝胶配制：使用预先配制6％聚丙烯酰胺凝胶60ml，加入交联剂10％过硫酸铵(aps)300μl和催化剂四甲基乙二胺(temed)35μl，轻轻混匀。

d)灌胶：将制好的胶沿亲水板和疏水板间缝隙处缓缓灌入，轻轻敲击电泳组合板上部，保持凝胶液均匀地充满至整个玻璃间隙。然后轻轻将梳子整齐边缘插入亲水板和疏水板之间，待凝胶完全聚合。

e)电泳槽的组装：取下梳子，用水将组合板间的剩余残胶冲洗干净。然后把组合板组装在电泳槽上，并向上下缓冲液槽中加入1×tbe缓冲液。用移液枪向板间间隙吸打缓冲液来除去板间间隙的气泡，将梳子梳齿插入胶面下1.5mm形成间隔的点样孔。

f)预电泳：75w恒定功率预电泳15～30min。

g)电泳：每孔中加入6μl样品，75w恒定功率电泳1.5h。

h)分板：放掉缓冲液，取出插条，轻轻将亲水板和疏水板分离。

银染显色的具体操作步骤：

a.固定：准备大小适中的塑料箱，加入2700ml蒸馏水、270ml无水乙醇和30ml冰乙酸摇匀。将亲水板放入塑料箱浸泡20min，固定期间并不断摇晃塑料箱。

b.漂洗：将亲水板取出并放入盛有3000ml蒸馏水的塑料箱中振荡洗涤，时间不超过10s。

c.染色：将亲水板转移至银染液中(2000ml蒸馏水+5g硝酸银,少量冰乙酸)，充分染色15-20min。

d.漂洗：将亲水板放入2000ml蒸馏水中冲洗硝酸银溶液，时间不超过10s。

e.显影：将亲水板立即放入显影(1500ml蒸馏水+40g氢氧化钠+10ml甲醛溶液)中，轻轻振荡至dna条带清晰显出。

f.成像：取出亲水板后用水缓慢冲洗凝胶3-5min，彻底洗去显影液。晾干后进行成像。

根据电泳和测序结果分组统计各基因型的ril群体材料。将所统计到的两个基因型分组，和2010年和2012年ril群体(实施例2和实施例3)在两种水平磷处理(ck与t)的沙培根系表型数据结合起来，独立样本t-test检验在两种水平磷处理下，两组数据的均数显著性。

实施例2.利用2012年相关根系表型性状的验证

在2012年的数据分组中，ril群体中271个家系中204个家系被成功分型，其中缺失基因型共有74份，插入基因型共有130份。对两个基因型在两种磷水平下各相关根系表型数据的均值做独立样本t-test检验(图3-4)。表型包括：总根长、最长根长、根尖数、根分支数、0～0.05um根长、0～0.05um根面积、0～0.05um根尖数和地上部分干重。其中0～0.05um根长、0～0.05um根面积、0～0.05um根尖数三个表型用于描述根毛性状。

结果表明：无论在任何磷水平下，每个性状里的缺失基因型的平均值都极显著得低于插入基因型，除了在根分支数和地上部分干重两个性状在低磷处理下，缺失基因型的平均值是显著低于插入基因型组的。结果可以间接预测出等位基因5bp的缺失被视作优异/增效等位基因型，具有在低磷胁迫下间接选出根系表型相对更好的材料的功能。但是，这个indel在亲本178中是缺失的。178材料是低磷耐受的玉米自交系材料。通过分析2012年的根系数据，低磷胁迫下，耐低磷自交系178只在根干重、根冠比、根直径等性状的下降幅度明显小于低磷敏感亲本9782，而在总根长、最长根长、根尖数、根分支数等图中各项性状数据，均低于材料9782。因此，推测这个indel的功能是间接选出在低磷胁迫下根系表型相对更好的玉米材料。

实施例3利用2010年相关根系表型性状数据的验证

为了验证上述推测，本发明还利用2010年在两种磷水平下ril群体的沙培根系数据进行分析。在这一年的数据中，ril群体中271个家系中163个家系被成功分型，其中缺失基因型共有68份，插入基因型共有95份。对两个基因型在两种磷水平下各根系表型数据均值做t-test检验(图5)。

结果表明：在这2010年的根系相关性状里，低磷处理条件下，除了根分支数的平均值差异不显著之外，其余插入组均值都极显著或者显著大于缺失组。同时，各组在正常磷水平下的的差异都不显著。除了根分支数这个性状在低磷处理下重复性有差异外，其余五个性状都与2012年的表型分离统计数据相符。

根据两次性状分离统计结果，推测出在zmphr1序列1395bp位置处插入tctgt的等位基因型被视作优异/增效等位基因型，此基因型玉米材料在低磷胁迫下的根系表型相对更好。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110>四川农业大学

<120>一种玉米耐低磷相关的indel标记及应用

<130>2017

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgttgtgggaggcagtt17

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cctaagagccctacgaaat19