一种环状RNA在结直肠癌生物标志物中的应用的制作方法

本发明属于天然核糖核苷酸的用途，涉及环状核糖核苷酸(gse1-circrna)的用途，尤其涉及gse1-circrna结直肠癌患者的新的生物标记中的用途，用于鉴别结直肠癌及更不良预后的对象。

背景技术：

结直肠癌又称大肠癌，是一种常见的恶性肿瘤。结肠癌在早期并无明显症状，直到发病中晚期发现。提高结直肠癌的早期诊断率对于及时治疗和改善预后至关重要。如通过在结直肠癌中出现的gse1-circrna所证明的，已知在结直肠癌组织中有异常的gse1-circrna表达。考虑到gse1-circrna表达量在结直肠癌中可升高或降低，因此提供了疾病进展的病理学指征。

circrna广泛存在于各种生物细胞中，具有结构稳定、丰度高和组织特异性表达等特征。是基因组dna转录表达过程中，环化成环形rna，的一类非编码rna。研究表明，一些circrna作为竞争性内源rna(cerna)来发挥基因表达调控的作用。circrna利用其microrna(mirna)应答元件结合mirna，以阻断mirna对其靶标基因表达的抑制作用，从而调控其他相关mrna的表达水平。circrna在基因表达调控中重要作用的发现提示circrna在药物开发和疾病诊治中具有良好的应用前景。

circrna作为一种调控性rna(regulatoryrna)近几年成为肿瘤研究的热点领域。circrnas其表达具备组织特异性。circrna中既有一部分作为竞争性内源rna(cerna)来发挥基因表达调控的作用。thomasb.hansen等人通过对人ago蛋白和mir-7的分析研究，证明了circrna作为高效的microrna海绵的作用。circrnas在肿瘤和正常组织中的表达水平差别十分显著，甚至能达到数百甚至数千倍，这种显著的差异使得其在成为候选标志物上具有明显优势。

技术实现要素：

本发明的目的是提供环状rna(circularrna\circrna)gse1-circrna在结直肠癌生物标志物中的应用，英文名gse1-circrna，gse1-circrna长219bp，位于人类的第16号染色体85633914到85634132之间，gse1-circrna的碱基序列结构，gse1是该circrna的覆盖基因。

本发明提供了鉴别可能患有结直肠癌的对象或结直肠癌的分期，再或者对先前经鉴别患有结直肠癌的对象的预后进行确定的方法及其引物序列结构、pcr产物识别序列。

所述方法包括检测来自所述对象的样品中的gse1-circrna量，其中较低量的gse1-circrna与所述对象患有结直肠癌的可能性增加或者结直肠癌预后不佳的可能性增加相关。

本发明的有益效果有：1)提出了gse1-circrna的用途；2)本发明的研究表明异常的量的gse1-circrna与所述对象患结直肠癌的可能性增加或者可能提示结直肠癌预后不佳。3)circrna具有结构稳定、丰度高和组织特异性表达等特征。且circrna在结直肠癌病人的癌组织和癌旁组织中表达量存在差异，因此gse1-circrna具有成为结直肠癌生物标志物的应用前景。

附图说明

图1为gse1-circrna的pcr识别序列与pcr产物测序结果的对比图。

图2为gse1-circrna的简易结构及引物位置图。

图3为使用gse1-circrna筛查引物对病人组织样品表达量筛查的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实验步骤对本发明进行进一步描述。

1.实验材料：

临床样品：29例结直肠癌病人的癌组织和癌旁组织样品由301医院所提供。

试剂：gse1-circrna筛查引物由生工生物工程(上海)股份有限公司北京引物合成部合成；trizol(货号15596-018)购自invitrogen；氯仿(货号20100927)购自北京化工，异丙醇(货号1205031)购自西陇化工，乙醇(货号101860)购自北化经销；randomprimers(货号c1181)，m-mlv(货号m1705)，ribonucleaseinhibitor(货号2511)，nuclease-freewater(货号2511)，dntpmix(货号p1195)均购自promega；premixextaqtmii(货号drr081a)购自takara；mineraloil(货号d7295)购自sigma。

2.实验方法：

1)结直肠癌癌变组织/癌旁组织rna提取

称取1克组织材料，液氮研磨后，转移至1.5毫升rnase-free的离心管中，混匀后室温静置5分钟左右。加入200微升的氯仿，混匀。11000转每分钟离心10分钟。取上清加入200ul的氯仿抽提，11000转每分钟离心10分钟。取上清加入500微升的异丙醇，-20℃沉淀10分钟。11000转每分钟离心15分钟，将沉淀转移至1.5毫升rnase-free离心管中，预冷的75％乙醇洗涤2遍，晾干，rnase-free水溶解(根据情况适当溶解，一般是20-35微升)。nanodrop测算所得粗提液的od值以及浓度。

2)表达量筛查

a.cdna合成

1-2微克rna到14微升rnase-free水中，再加1微升randomprimer轻柔混匀后加入0.2mlpcr管中。pcr仪70℃孵育5分钟。快速放在冰上2分钟。

配置反应混合物：

42℃孵育1小时，70℃孵育15分钟，4℃保温。

b.real-timepcr

cdna中加入50ul的ddh2o。

在冰上制备qpcr混合物：

每管中加入10微升矿物油。离心机1000转每分钟离心1分钟。将样品放置入abi7500荧光定量pcr仪中运行，程序如下：

3)实验数据分析：根据qrt-pcr扩增情况，得到的gse1-circrna的ct值，根据内参基因gapdh的扩增情况，计算出相对组织自身gapdh的相对表达，再根据2^-ddct法计算出肿瘤组织中gse1-circrna相对同一患者癌旁正常组织的表达水平差异。

3.实验结果：

参见图1和图3，图1为gse1-circrna的pcr识别序列与pcr产物测序结果的对比图。实验结果表明gse1-circrna的pcr识别序列与pcr产物测序结果比对成功，gse1-circrna在结直肠癌病人的癌组织和癌旁组织中表达。图3为使用gse1-circrna筛查引物对病人组织样品表达量筛查的结果图。以患者自身癌旁正常组织为对照，计算出gse1-circrna在肿瘤组织中的相对表达水平。将实验结果表明gse1-circrna在结直肠癌病人的癌组织和癌旁组织中的表达差异较大，24/29例病人癌组织相对于癌旁组织下调存在着从0.0386688倍到0.7918976倍的变化，其中22/29的病人下调倍数在0.5以下；上调存在1.35170863倍到9.122064711倍的表达量变化，其4/29的病人上调倍数在3倍以内，1/29的病人上调在3倍以上。如此大的表达差异给了gse1-circrna作为结直肠癌生物标志物的应用前景。