本发明属于胚胎工程领域，尤其涉及一种提高羔羊体外胚胎发育能力的方法。
背景技术：
羔羊胚胎体外生产技术(juvenileinvitroembryotransfer，jivet)是集超数排卵、活体采卵、卵子体外成熟、体外受精、胚胎体外培养和胚胎移植等技术为一体的综合技术，其最大特点是以性成熟前幼羔为卵子供体来生产体外胚胎。研究表明，利用相同的激素处理方案，幼羔(4-8周龄)的卵泡发育数是成年羊的10倍以上。因此，幼羔是生产体外胚胎的有效卵子供源。而且，以幼羔为卵子供体，还可以将羊的繁殖年龄提前一年以上。因此，jivet技术是一项极具应用价值的快速繁育技术。
然而，尽管利用激素诱导可以获得大量羔羊卵子，但这些卵子的质量层次不齐，导致羔羊体外胚胎的发育能力远低于成年羊胚胎。羔羊体外胚胎发育能力低的主要原因是卵子成熟度不够，导致受精后发育潜力不足。在体内，卵泡是卵子发育和成熟的重要场所，卵泡液是卵泡的主要成份，为卵子的发育成熟提供了重要微环境。
这是目前jivet技术的主要缺陷。如果能够提高羔羊胚胎的发育能力，就会进一步提升jivet技术的总体效率，提高这一技术的生产应用水平。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种促进羔羊卵子体外成熟的方法.
本发明提供的方法，为将离体羔羊的卵母卵丘细胞复合体在添加成年羊卵泡液的促卵子成熟培养液中进行体外成熟培养，实现促进羔羊卵子体外成熟。
上述方法中，所述添加成年羊卵泡液的促卵子成熟培养液中，所述成年羊卵泡液的体积百分浓度为10％-50％(体积比体积)。
上述方法中，所述添加成年羊卵泡液的促卵子成熟培养液中，所述成年羊卵泡液的体积百分浓度为20％。
上述方法中，
所述成年羊卵泡液为离体成年羊卵泡液；
所述离体成年羊卵泡液来源于激素诱导成年羊(可以屠宰死亡后取或活体取)或非激素诱导成年羊(屠宰死亡后摘取卵巢然后吸取卵泡液)。
上述方法中，所述添加成年羊卵泡液的促卵子成熟培养液由tcm199溶液、发情羊血清、fsh(促卵泡素)、lh(促黄体素)、17β-estradiol(17β-雌二醇)、streptomycin(链霉素)、penicillin(青霉素)和所述成年羊卵泡液组成；
或，所述发情羊血清、所述fsh、所述lh、所述17β-estradiol、所述streptomycin、所述penicillin和所述成年羊卵泡液的配比200μl：10μg：10μg：1μg：100μg：100iu和所述成年羊卵泡液的配比为100-500μl。
上述方法中，所述发情羊血清在所述促卵子成熟培养液中的体积百分含量为10-50％；
或，所述发情羊血清在所述促卵子成熟培养液中的体积百分含量为20％；
所述fsh在所述促卵子成熟培养液中的浓度为10μg/ml；
所述lh在所述促卵子成熟培养液中的浓度为10μg/ml；
所述β-estradiol在所述促卵子成熟培养液中的浓度为1μg/ml；
所述streptomycin在所述促卵子成熟培养液中的浓度为100μg/ml；
所述penicillin在所述促卵子成熟培养液中的浓度为100iu/ml；
所述成年羊卵泡液在所述促卵子成熟培养液中的体积百分含量为10％-50％；
或所述成年羊卵泡液在所述促卵子成熟培养液中的体积百分含量为20％。
上述方法中，所述体外成熟培养的条件为38.5℃，5％co2，95％空气饱和湿度、时间为24h；
或所述羊为绵羊或山羊。
上述促进羔羊卵子体外成熟体现在添加成年羊卵泡液处理后的羔羊体外胚胎的发育能力高于未添加成年羊卵泡液处理后的羔羊体外胚胎的发育能力。
本发明另一个目的是提供一种促进羔羊卵子体外成熟的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述方法中的所述添加成年羊卵泡液的促卵子成熟培养液。
上述方法或上述试剂盒在提高羔羊体外胚胎的发育能力中的应用也是本发明保护的范围。
本发明第3个目的是提供一种提高羔羊体外胚胎的发育能力的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)上述方法步骤，得到成熟培养后卵母卵丘细胞复合体；
2)从所述成熟培养后卵母卵丘细胞复合体中分离得到待授精卵母细胞，再进行体外受精，生产体外胚胎，实现提高羔羊体外胚胎的发育能力。
上述体外受精的条件为38.5℃，5％co2，95％空气饱和湿度、时间为20-24h；
上述生产体外胚胎的培养条件为5％o2+5％co2+90％n2，饱和湿度；
上述提高羔羊体外胚胎的发育能力为添加成年羊卵泡液处理后的羔羊体外胚胎的发育能力高于未添加成年羊卵泡液处理后的羔羊体外胚胎的发育能力。
上述卵泡液、上述卵母卵丘细胞复合体和上述受精所需要的精子的羊的品种一致。
本发明在羔羊卵母细胞体外成熟液中添加一定浓度的成年羊卵泡液，用这种促卵子成熟培养液来培养羔羊卵母细胞，卵子成熟后通过体外受精生产体外胚胎，可以显著提高羔羊胚胎的发育能力。该方法简单易行，材料来源方便。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例的羊均为绵羊，且品种均为杜泊羊。
体积百分含量为体积和体积的百分比。
实施例1、提高羔羊胚胎的发育能力的方法
一、促卵子成熟培养液的配置
1、成年羊卵泡液的收集
卵泡液可采自激素诱导或非激素诱导的成年绵羊。
1)激素诱导成年羊卵泡液的收集
激素诱导方案采用羊常规超数排卵程序，所用激素包括促卵泡素(fsh)或孕马促性腺激素(pmsg)。
激素诱导方案:对成年母绵羊连续2天4次或者3天6次注射促卵泡素fsh(宁波三生)，每次间隔12小时，总计480iufsh(宁波三生)。最后一次注射12h后，可活体取也可屠宰后离体卵巢中吸取，具体利用10g针头一次性注射器从卵巢卵泡内吸取卵泡液。
采集的卵泡液以3000rmp离心10min，收集上清液，得到来源于激素诱导成年羊卵泡液，然后过滤灭菌后保存于-20℃。
2)非激素诱导成年羊卵泡液的收集
对于非激素诱导的成年羊，可从屠宰后离体卵巢中采集卵泡液。
采集的卵泡液以3000rmp离心10min，收集上清液，得到来源于非激素诱导成年羊卵泡液，然后过滤灭菌后保存于-20℃。
2、促卵子成熟培养液
促卵子成熟培养液a配方：tcm199溶液(sigma-aldrich)+20％(体积百分含量)发情羊血清(发情羊母羊采血，4℃静置过夜，3000rmp离心30min,收集血清)+10μg/mlfsh(vetrepharm，ontario，canada)+10μg/mllh(bioniche，ontario，canada)+1μg/ml17β-estradiol(sigma-aldrich)+100μg/mlstreptomycin(gibco)+100iu/mlpenicillin(gibco)+20％(体积百分含量)来源于激素诱导成年羊卵泡液。
促卵子成熟培养液b配方：tcm199溶液(sigma-aldrich)+20％(体积百分含量)发情羊血清+10μg/mlfsh(vetrepharm，ontario，canada)+10μg/mllh(bioniche，ontario，canada)+1μg/ml17β-estradiol(sigma-aldrich)+100μg/mlstreptomycin(gibco)+100iu/mlpenicillin(gibco)+20％(体积百分含量)来源于非激素诱导成年羊卵泡液。
促卵子成熟培养液c配方：tcm199溶液(sigma-aldrich)+20％(体积百分含量)发情羊血清+10μg/mlfsh(vetrepharm，ontario，canada)+10μg/mllh(bioniche，ontario，canada)+1μg/ml17β-estradiol(sigma-aldrich)+100μg/mlstreptomycin(gibco)+100iu/mlpenicillin(gibco)。
二、促进羔羊卵子体外成熟
1、羔羊卵母细胞的收集
对4-8周龄母羔羊连续2天4次注射促卵泡素fsh(宁波三生)，每次注射45iu，每次间隔12小时；第一次注射fsh同时注射330iu孕马促性腺激素pmsg(宁波三生)；在最后一次注射fsh后12小时进行手术采卵。
用含有2ml吸卵液(配方：tcm199+10.412g/lhepes(sigma-aldrich)+10％(体积百分含量)发情羊血清)的20g针头一次性注射器活体吸取卵巢中的卵母卵丘细胞复合体(cocs)。
2、卵母细胞体外成熟
卵泡液组1：将上述1挑选出的cocs在吸卵液中清洗三次，再用上述一的2制备的促卵子成熟培养液a清洗两次，然后放入预先在co2培养箱中平衡2h以上的上述一的2制备的促卵子成熟培养液a中(四孔板成熟培养，600μl上述一的2制备的促卵子成熟培养液a，覆盖300μl液体矿物油)，每孔中30-40枚cocs；成熟培养条件为38.5℃，5％co2，95％空气，饱和湿度，成熟培养时间为24h，得到成熟培养后cocs。
卵泡液组2：将上述1挑选出的cocs在吸卵液中清洗三次，再用上述一的2制备的促卵子成熟培养液b清洗两次，然后放入预先在co2培养箱中平衡2h以上的上述一的2制备的促卵子成熟培养液b中(四孔板成熟培养，600μl上述一的2制备的促卵子成熟培养液b，覆盖300μl液体矿物油)，每孔中30-40枚cocs；成熟培养条件为38.5℃，5％co2，95％空气，饱和湿度，成熟培养时间为24h，得到成熟培养后cocs。
对照组：将上述1挑选出的cocs在吸卵液中清洗三次，再用上述一的2制备的促卵子成熟培养液c清洗两次，然后放入预先在co2培养箱中平衡2h以上的上述一的2制备的促卵子成熟培养液c中(四孔板成熟培养，600μl上述一的2制备的促卵子成熟培养液c，覆盖300μl液体矿物油)，每孔中30-40枚cocs；成熟培养条件为38.5℃，5％co2，95％空气，饱和湿度，成熟培养时间为24h，得到成熟培养后cocs。
三、提高羔羊胚胎的发育能力
1、卵母细胞的体外受精
1)、卵母细胞的分离
将上述二的2各组成熟培养后24h的cocs移入含质量百分含量0.2％透明质酸酶的h199溶液(h199+10％(体积百分含量)胎牛血清+质量百分含量0.2％透明质酸酶)中，轻轻吹打以除去大部分卵丘细胞，仅保留1-3层，用受精液清洗三次后，得到待授精卵母细胞，移入预先在co2培养箱中平衡2h以上的受精液中(四孔板，每孔30-40枚成熟的卵母细胞，450μl受精液，覆盖300μl液体矿物油)，准备用于体外受精。
2)、受精
将成年绵羊冻精从液氮中取出，在38℃水浴中快速解冻。然后将解冻的精液加入装有预先平衡2h以上的800μl受精液的圆底玻璃试管底部，置于培养箱中孵育20-30min，使精子充分上游。吸取少量上层液体，在显微镜下观察精子活力及密度。
取上层的精子加入上述1)的放有待授精卵母细胞的四孔板中，每孔加入100μl左右精子，卵母细胞与精子受精孵育。
受精条件为38.5℃，5％co2，95％空气，饱和湿度，受精时间为20-24h。
上述受精液：sof+体积百分含量2％发情绵羊血清+100μg/mlstreptomycin(gibco)+100iu/mlpenicillin(gibco)；
sof配方：每1l中含6.29gnacl，0.534gkcl，0.19gcacl2·
2h2o，0.01gmgso4·7h2o，0.162gkh2po4，0.2106gnahco3，0.27gglucose，0.036gsodiumpyruvate和5.6mlsodiumlactate，试剂全部购于sigma-aldrich。
2、胚胎的体外培养
将上述1的2)卵母细胞与精子受精孵育20-24h后，取出卵子，轻轻吹打去除卵子表面的卵丘细胞和精子。用胚胎培养液(sofaabsa)洗三次后，移入预先在co2培养箱中平衡2h以上的胚胎培养液中(四孔板培养，600μl胚胎培养液，覆盖300μl液体矿物油)，体外培养胚胎。
上述体外胚胎培养条件为38.5℃，5％o2+5％co2+90％n2，饱和湿度。
上述胚胎培养液(sofaabsa)：sof+体积百分含量2％必需氨基酸(sigma-aldrich)+体积百分含量1％非必需氨基酸(sigma-aldrich)+8mg/ml牛血清白蛋白(sigma-aldrich)。
分别在受精后48h和体外培养第7-9天分别观察并统计胚胎的卵裂率及囊胚率。卵裂率(卵裂胚胎数/待授精卵母细胞数)*％
囊胚率(囊胚数/卵裂胚胎数)*％
结果如表1所示，与对照组相比，在卵母细胞成熟液中添加20％的成年羊卵泡液显著地提高了羔羊胚胎的发育能力；体外发育能力通过囊胚率体现，从体外囊胚发育率可以看出本发明的方法是有效的，因为它比对照组发育率显著高。
表1成熟液中添加成年羊卵泡液对羔羊卵母细胞体外受精及发育能力的影响