检测MTB喹诺酮类药物耐药基因gyrA突变的试剂盒及其方法和用途与流程

本发明涉及一种检测mtb喹诺酮类药物耐药基因gyra突变的试剂盒及其方法和用途。
背景技术：
：结核病(tb)是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。结核病是青年人容易发生的一种慢性和缓发的传染病。潜伏期4～8周。其中80％发生在肺部，其他部位(颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼)也可继发感染。据世界卫生组织发表的《2014全球结核病报告》中显示，2013年全球有900万人感染结核病，150万人因结核病而死亡，其中包括36万艾滋病毒感染者。除少数发病急促外，临床上多呈慢性过程。常有低热、乏力等全身症状和咳嗽、咯血等呼吸系统表现。导致结核病爆发流行的主要原因包括人口流动的加速、人类免疫缺陷病毒感染的流行、无规律化疗和治疗药物的中断及质量不佳导致耐药菌株的出现。结核分枝杆菌的基因突变是引起耐药的主要分子基础，对结核分枝杆菌耐药基因的检测及研究对防治结核病具有重要的意义。我国是22个结核病高负担国家之一，虽然制定了一系列有关于tb防治的政策法规，但伴随着耐药结核分枝杆菌(mtb)的不断传播，tb的流行趋势不容乐观。mtb耐药突变株的自然变异率很低，但随着耐药菌株的传播，原发性耐药会逐渐增多，在许多tb控制较好的地区原发耐药tb患者占全部耐药患者的多数。耐药结核的出现给tb的控制和治疗带来了很大困难，患者必须使用二线甚至三线药物治疗。对至少2种药物产生耐药(mdr)的结核病患者，必须要有结核菌药敏试验结果才能确诊。世界卫生组织(who)推荐一线和二线抗结核药物可以混合用于治疗mdr-tb。二线抗结核药物是mdr-tb治疗的主药，其中包括喹诺酮类。喹诺酮类药物的作用靶位是细菌的dna旋转酶，阻抑dna的复制，最终导致菌体死亡。federicogiannoni等认为mtb耐喹诺酮类主要是dna旋转酶的亚单位编码基因a(gyra：90和94为位密码子突变)突变所致；吴雪琼在其文章中指出gyra突变导致喹诺酮类高度耐药，突变率为75％～94％，gyra第67～106位密码子为氨基酸被认为是喹诺酮类耐药决定区，目前已发现90、94和88位密码子突变与耐药相关。本发明主要针对gyra基因第88、90和94位密码子的突变进行设计。现阶段主要的几种耐药检测方法：(1)聚合酶链反应(pcr)-单链构象多态性分析(sscp)：该方法依据dna的空间构象变化，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率不同，通过与野生型标准株对比，即可确定野生型和突变型基因。该方法简便、快速、价廉，但只能判断基因有无突变，不能确定突变的部位和性质，可能导致假阳性。(2)基因芯片：其原理是采用固相原位合成或显微打印技术，将寡核苷酸固化于支持物表面上，与带标记的样品进行杂交形成稳定的双链结构，通过检测目的单链上的荧光信号，对生物样品进行快速、灵敏、高效地检测，但操作技术有要求，相对成本也较高，对未知的突变不能检测。(3)测序法：该方法能够确定突变的部位与性质，是检测基因突变的决定性方法，自动化dna测序仪的应用使测序效率大大提高。该方法具有准确度高，特异性和重复性好等特点，可对基因型进行直观的判断，是分析基因突变的金标准。技术实现要素：鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测mtb喹诺酮类药物耐药基因gyra突变的试剂盒及其检测方法，该试剂盒可用于检测gyra基因第88、90和94位密码子的基因型，准确度高，特异性好。为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种检测mtb喹诺酮类药物耐药基因gyra突变的试剂盒，所述试剂盒包括gyra基因检测引物，所述gyra基因检测引物至少有3种，其序列分别如seqidno.1、seqidno.2以及seqidno.3所示。本发明的试剂盒采用pcr检测技术进行gyra基因检测，根据扩增及检测情况可分析判断检测对象第88、90和94位密码子的基因型。因此，引物的设计是本发明试剂盒的关键。gyra基因在ncbi中的登录号为nc_000962.3。基于本发明所述试剂盒是采用pcr技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些pcr所需要的常规试剂，如：无菌水(ddh2o)、dntp、pcrbuffer、rtaq酶、样品基因组dna提取试剂等常用pcr反应试剂中的一种或多种。由于此类pcr常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。本发明的试剂盒，可以是含有独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的pcr检测液。优选地，所述试剂盒中包含两种独立包装的引物对，其中一个包装含有的引物如seqidno.1和seqidno.2所示，另外一个包装含有的引物对如seqidno.1和seqidno.3所示。pcr检测液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用pcr检测液加入引物获得。例如，所述试剂盒中还可以含有无菌水(ddh2o)、dntp、pcrbuffer、rtaq酶。加入本发明的引物、待检样本dna提取物或者样本菌液即可获得pcr反应体系。优选地，所述试剂盒中还含有阳性对照，所述阳性对照为含有第88、90和94位密码子突变的结核分枝杆菌gyra基因dna样本。本发明的第二方面提供了一种检测mtb喹诺酮类药物耐药基因gyra突变的检测方法，包括如下步骤：(1)提取样品基因组dna；(2)将样品基因组dna加入装有pcr反应体系的pcr管中，获得样品反应管，所述pcr反应体系中含有gyra基因检测引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示；(3)第一轮pcr反应：反应管置于pcr仪上，设置循环参数，进行pcr反应，获得第一轮pcr反应产物；(4)取第一轮pcr反应产物作为第二轮pcr的模板，加入到pcr反应管中，同时加入引物，引物序列如seqidno.1和seqidno.3所示；(5)第二轮pcr反应：反应管置于pcr仪上，设置循环参数，进行pcr反应，获得第二轮pcr反应产物；(6)pcr反应结束后，分析结果。优选地，所述步骤(3)中的反应条件设置为(a)95.0℃5min；(b)95℃30s；62℃30s；72℃40s，步骤(b)循环15次，每次循环的中间步骤比上次循环降低0.5°最终使得62°降落至55°，(c)95℃30s；55℃30s；72℃40s；步骤(c)循环25次；(d)72°10min。优选地，所述步骤(5)中的反应条件与步骤(3)相同。本发明的另一方面公开了上述试剂盒在制备gyra基因检测产品中的用途。进一步地，所述检测产品用于检测和筛选耐喹诺酮类药物的结核分枝杆菌如上所述，本发明的检测mtb喹诺酮类药物耐药基因gyra突变的试剂盒及其方法和用途，具有以下有益效果：采用本发明的检测试剂盒和方法，能够达到对结核分枝杆菌的gyra基因的特异性扩增，有利于耐喹诺酮药物的结核分枝杆菌的快速鉴别，用以指导临床用药。附图说明图1为步骤二(1)中未加入和加入gyra-r1特异性引物后扩增条带电泳对比图；m(marker)自上而下由1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp7条带组成，1和2仅使用一轮pcr引物gyra-f/r扩增后的条带；3和4是以第一轮pcr引物gyra-f/r扩增的产物为模板，使用引物gyra-f/r1进行第二轮pcr扩增的条带。图2为步骤二(2)中1～5号样品以及对照品扩增带电泳对比图；m(marker)自上而下由1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp7条带组成。图3是图1中1号条带pcr产物的测序结果图。图4是图1中2号条带pcr产物的测序结果图。图5是图1中3号条带pcr产物的测序结果图。图6是图1中4号条带pcr产物的测序结果图。图7是图1中3和4号pcr产物的测序结果，图中标识出了88、90和94位密码子的基因型(为了更好的显示结果，图7中显示的片段为含有对比序列的片段，与图5和图6中选取的片段不同)。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。实施例1试剂盒的制备引物设计与合成：以gyra基因为模板，设计并分析引物，并根据基因组dna序列情况，从中选择最佳检测用引物对，为更好显示gyra基因第88、90和94位密码子的基因型，选择以上位点附近的序列进行引物设计，其核苷酸序列如下表1所示：表1上述引物对可单独包装，也可以配成pcr检测液。所述pcr检测液中，上述引物对的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的引物对；也可以是含有配制好的含有引物对的pcr检测液，例如将第一轮pcr两种引物包装在一起，第二轮的两种pcr引物包装在一起。进一步地，所述试剂盒还可以含有无菌水(ddh2o)、dntp、pcrbuffer、rtaq酶、样品基因组dna提取试剂等等。进一步的所述试剂盒中还可以含有第88、90和94位密码子为突变的gyra基因。实施例2试剂盒对样本的特异性检测一、样本抽提：痰液提取dna方法(1)液化：样本中加入等量的4％naoh溶液，至痰样完全液化；(2)离心：转移1.2～1.5ml液化的痰样1.5ml离心管中，13,000rpm离心5分钟；(3)洗涤：加入1mlmtb洗液，混匀；(4)离心：10,000rpm离心2分钟；(5)加液：加入50ulmtb裂解液，充分混匀；(6)裂解：恒温金属浴100℃加热10分钟；(7)离心：12,000转/分钟，离心2分钟；(8)保存：留上清液(即dna)，待用。二、对目标产物进行pcr扩增：(1)按样品数n(样品数＝待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个)取预混pcr反应液，每管18ul分装于反应管中。将上述处理好的待测样本各取5ul分别加入反应管中，标号为1、2、3和4号，采用实施例1制备的试剂盒，其中1和2号加入的第一轮pcr引物:gyra-f/r，3号和4号加入本发明所述引物(第一轮pcr引物:gyra-f/r,第二轮pcr引物:gyra-f/r1)，混匀，低速离心数秒，进行pcr扩增，具体反应体系如下：pcr反应体系：go-taqcolorlessmastermix10μlddh2o6μl引物工作液(上游)1μl引物工作液(下游)1μl样品dna5μlpcr程序：对其中1～4号样品进行第一轮pcr反应，具体条件为：(a)95.0℃5min；(b)95℃30s；62℃30s；72℃40s，步骤(b)循环15次，每次循环的中间步骤比上次循环降低0.5°最终使得62°降落至55°，(c)95℃30s；55℃30s；72℃40s；步骤(c)循环25次；(d)72°10min。将3号和4号样品的扩增产物5微升，分别加入第二轮pcr引物，进行第二轮pcr扩增，具体条件为：(a)95.0℃5min；(b)95℃30s；62℃30s；72℃40s，步骤(b)循环15次，每次循环的中间步骤比上次循环降低0.5°最终使得62°降落至55°，(c)95℃30s；55℃30s；72℃40s；步骤(c)循环25次；(d)72°10min。对pcr扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，180v，20min，凝胶成像系统观察目的条带，结果如图1所示。结果表明，用本发明所述的引物获得的pcr产物为泳道中3(261bp)和4(261bp)，而采用其他引物获得的扩增条带1(471bp)和2(471bp)。表明采用上述试剂盒中特定gyra扩增引物，可以获得特异性很好的单一目的条带。(2)取步骤一种制备的dna样品，将上述处理好的待测样本各取5ul分别加入反应管中，标号为1、2、3、4、5号以及对照品，对照品采用实施例1制备的试剂盒(第一轮pcr引物:gyra-f/r,第二轮pcr引物:gyra-f/r1)，其中1～5号加入的引物如下表，混匀，低速离心数秒，进行pcr扩增，采用的dna反应体系与(1)中相同，具体反应程序如下：pcr程序：对其中1～5号样品以及对照品进行第一轮pcr反应，具体条件为：(a)95.0℃5min；(b)95℃30s；62℃30s；72℃40s，步骤(b)循环15次，每次循环的中间步骤比上次循环降低0.5°最终使得62°降落至55°，(c)95℃30s；55℃30s；72℃40s；步骤(c)循环25次；(d)72°10min。取上述所有样品的第一轮扩增产物5微升，加入第二轮pcr引物，分别进行第二轮pcr扩增，具体条件为：(a)95.0℃5min；(b)95℃30s；62℃30s；72℃40s，步骤(b)循环15次，每次循环的中间步骤比上次循环降低0.5°最终使得62°降落至55°，(c)95℃30s；55℃30s；72℃40s；步骤(c)循环25次；(d)72°10min。对pcr扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，180v，20min，凝胶成像系统观察目的条带，结果如图2所示。结果表明，用本发明所述的引物获得pcr产物(对照)的泳道中标注为“对照”的条带(261bp)，而采用其他引物获得的扩增条带1～5号依次为306bp,281bp,271bp,408bp,397bp的条带，由此可见使用本试剂盒的引物(第一轮pcr引物:gyra-f/r,第二轮pcr引物:gyra-f/r1)扩增的条带单一。三、对步骤二(1)中的目标产物进行pcr纯化、测序1.试剂配制：按下表配制，冰上操作，分装后保存在-20℃冰箱。bigdye体系：酶纯化体系：原料1x需要体积量(ul/管)cip0.1ul-exoi0.5ul-去离子水1.4ul-2.pcr产物纯化2.1取出分装好的纯化反应液，在管壁上标好相应的编号。2.2取9ulpcr产物加入相应编号的管中，混匀(注意不能产生气泡)。2.3将混匀样品按照如下反应条件上pcr仪，进行酶纯化扩增。3.测序反应3.1每个样品做正反两个反应，在相应的薄壁管上写好标记。3.2每反应体系5ul，bigdye混合液和5p引物固定加1ul，模板加2ul，最大量为3ul(根据pcr产物电泳结果调整)，用水补足5ul。3.3先加相应量的水，然后加入相应的1ul引物加到水里，再在管壁的不同地方加1ul的bigdye混合液，最后加入模板。3.4盖上管盖低速短暂离心，涡旋器混匀，再次低速短暂离心。3.5按照如下反应条件上pcr仪，进行测序反应。4.测序反应后乙醇纯化，上机。4.1将扩增完的pcr产物进行短暂离心。在每管一侧贴壁加入2ul的125mmedta，然后在管的另一侧贴壁加入15ul无水乙醇，涡旋混匀。4.2用板式离心机，4000rpm，离心30min，然后300rpm倒置瞬时离心，除掉上清。4.3加入50ul的20℃预冷75％乙醇，涡旋混匀，4000rpm、4℃离心15min。4.4300rpm倒置瞬时离心，除掉上清，然后放置于室温，15min，挥发完乙醇。4.5乙醇完全挥发后，每管加入水和hi-ditm各5ul，充分涡旋振荡1min.，短暂离心后静置15min.使测序产物完全溶解。4.6将hi-ditm溶解产物转移至96孔板的相应位置中。放至pcr扩增仪上，95℃预变性5min.，迅速转移至冰盒上4℃冷却5min。至3500测序仪上机测序并分析。结果如图3～6所示，可见，3号和4号的扩增产物特异性较高。数据分析：应用sequencinganalysis软件进行序列比对分析。将测序得到的序列与ncbi中检索到的标准序列进行比对，确认样本gyra基因第88、90和94位密码子的基因型，结果如图7所示。结果显示：表明采用上述试剂盒中特定gyra扩增引物，可以通过pcr方法快速鉴定未知mtb的gyra第88、90和94位密码子的基因型。以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。sequencelisting<110>上海新培晶医学检验所有限公司<120>检测mtb喹诺酮类药物耐药基因gyra突变的试剂盒及其方法和用途<130>173532<160>13<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>gyra-f<400>1gggtgctctatgcaatgttc20<210>2<211>17<212>dna<213>artificial<220><223>gyra-r<400>2cggcgtcgtgattctcc17<210>3<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>反相引物<400>3tctccatcgccaacggggt19<210>4<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>正向引物<400>4atgcaatgttcgattccggc20<210>5<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>反相引物<400>5ggccgtcgtagttagggatg20<210>6<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>正向引物<400>6gcaatgttcgattccggctt20<210>7<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>反相引物<400>7tcgactgtctcctcgtcgat20<210>8<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>正向引物<400>8tgcaatgttcgattccggct20<210>9<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>反向引物<400>9ctcgtcgatttccctcagca20<210>10<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>正向引物<400>10gggtgctctatgcaatgttcg21<210>11<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>反向引物<400>11ggatattggttgccatgccg20<210>12<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>正向引物<400>12aatgttcgattccggcttcc20<210>13<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>反向引物<400>13cgggatattggttgccatgc20当前第1页12