本发明属于分子生物学和免疫学
技术领域：
，具体涉及噬菌体展示抗体文库和纳米抗体重组表达技术，特别是涉及一种针对cd147蛋白分子的噬菌体纳米抗体库筛选，纳米抗体的结构、生产方法及应用。
背景技术：
：cd147是一种广泛表达于造血及非造血细胞系，分子量约43-66kda的跨膜糖蛋白，基因定位于19p13.3，其编码区编码269个氨基酸残基，包括细胞外n端2个c2型免疫球蛋区、24个氨基酸残基组成的跨膜区和c端39个氨基酸残基的胞内区。cd147广泛表达以及与其他蛋白的相互作用使之能够参与多种不同的生理病理过程，并与某些重要疾病如肿瘤、炎症等的发生发展密切相关cd147在多种肿瘤细胞、组织高表达。功能研究发现，其通过诱导周围成纤维细胞及肿瘤细胞自身产生多种基质金属蛋白酶(mmps，包括mmp-1,mmp-2,mmp-9)降解细胞外基质，促进肿瘤细胞的浸润和转移。cd147胞外区还含有3个asn糖基化位点，表明cd147分子n端高度糖基化，提示cd147分子的n端高度糖基化，但糖基化的程度具有组织特异性，在不同组织不同种属中，由于蛋白分布同，其糖基化方式也有所不同，不同的糖基化方式又使得蛋白发挥不同的功能。同时，cd147分子糖基化的程度决定了其激活mmp的能力，纯化的去糖基化的cd147分子不能诱导mmp分泌。大量究结果表明，各种癌组织、细胞中，cd147分子普遍高表达，并伴随高度的糖基化。cd147分子的糖基化修饰非常丰富，糖链约占总分子量的一半。目前的研究表明，肿瘤细胞中cd147的糖基化修饰对其诱导基质金属蛋白酶的分泌可能有重要意义，从而影响肿瘤的发生发展。cd147是多种肿瘤表面的靶标分子，应用相关技术制备cd147的抗体，做成诊断试剂盒或抗体药物，从而用于癌症的诊断和治疗。纳米抗体是在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术研发得到的，其分子量约为15kd，是目前已知最小的可结合抗原的抗体分子。最初有比利时科学家hamers.r在骆驼血液中发现，普通的抗体蛋白由两条重链和两条轻链组成，而从骆驼血液中发现的新型抗体只有两条重链，没有轻链，这些新型抗体能像正常抗体一样于抗原紧密结合，但不像单链抗体那样相互粘连聚集成块。与传统抗体相比，纳米抗体具有相对分子质量小、亲和力高、稳定性高、溶解性好、免疫原性低、穿透力强、人源化简单等优势。因此，因此应用纳米抗体技术研发cd147。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供一种抗cd147抗体、其编码序列、制备方法、以及应用。具体而言，一方面，本发明提供一种抗cd147抗体，其含有由seqidno:3所示的cdr1、由seqidno:4示的cdr2、以及由seqidno:5所示的cdr3。本发明所述抗cd147抗体，其是单克隆抗体、fab、f(ab)2、fv、scfv、单域抗体、纳米抗体等。本发明所述抗cd147抗体，其氨基酸序列如seqidno:1所示。本发明所述抗cd147抗体，其进一步带有标记，所述标记包括酶标记(如辣根过氧化物酶标记、碱性磷酸酶标记)、光学标记(化学发光标记)、荧光标记、同位素标记等。第二方面，本发明提供一种基因，其编码本发明所述抗体。本发明所述基因，其含有seqidno:4所示的核苷酸序列。本发明所述基因可以是dna、cdna、mrna，除了编码序列以外，还包括非编码区序列，例如5’utr和3’utr等。第三方面，本发明提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包含本发明所述的基因。本发明所述核酸构建体，可以为阅读框、表达盒、操纵子、质粒、粘粒、病毒载体、噬菌体载体等。第四方面，本发明提供一种宿主，所述宿主包含本发明所述的基因或核酸构建体。本发明所述宿主，可以为基因工程领域常用的宿主，包括原核宿主、真核宿主。所述原核宿主包括但不限于大肠杆菌，所述真核宿主包括但不限于酵母(毕赤酵母、酿酒酵母)、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等。第五方面，本发明提供一种生产抗cd147抗体的方法，其包括：(1)培养本发明的宿主细胞，(2)使所述宿主表达抗体，(3)从含有抗体的组分中分离和纯化抗体。本发明所述生产抗cd147抗体的方法，通过诱导使大肠杆菌宿主细胞表达重组抗cd147抗体，从菌体破碎的上清中分离和纯化cd147。第六方面，本发明提供一种制备抗cd147抗体的方法，其包括：(1)用cd147蛋白筛选噬菌体展示抗体库；(2)阳性克隆的鉴定和测序；(3)cd147重组抗体的表达和纯化；(4)抗cd147重组抗体功能的鉴定。本发明所述制备抗cd147抗体的方法，用纯化的cd147包被elisa板/条，筛选噬菌体表面展示的单域抗体库，经过三至四轮淘筛，从洗脱下的噬菌体中挑取噬菌体克隆，与辅助噬菌体m13k07共感染宿主菌得到噬菌粒，用phage-elisa鉴定阳性克隆并测序。第七方面，本发明提供所述抗cd147抗体的用途。所述抗cd147抗体用于制备检测样品中cd147的检测试剂盒或诊断试剂盒；所述抗cd147抗体还可用于治疗与cd147高表达相关疾病，例如肿瘤。与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：(1)分子较小，药物递送。本发明所述抗cd147纳米抗体相对于普通抗体或抗体片段，分子较小。当作为靶向分子时，本发明所述抗cd147纳米抗体对活性部位(效应分子)的构象影响和空间位阻都更小，效应分子活性更高，并且采用本发明抗cd147纳米抗体作为靶向分子时单位重量的药物中具有更高的效应分子的摩尔数。(2)免疫原性低，代谢特征好。本发明所述抗体即保留了所述序列形成vvh抗体的能力，又尽可能避免了非人外源蛋白的引入，兼顾了有效结合cd147的功能和尽可能低的异源性。另外，异源性的降低除了减少超敏反应以外还能延长了其在体内的半衰期，改善代谢特征。(3)亲和力高，靶向性强。scfv或抗体的片段等小分子抗原结合蛋白由于缺乏抗体分子的完整结构，通常对抗原的亲和力远远达不到完整抗体的水平。本发明经过长期试验，采用了高库容的噬菌体展示单域抗体文库，经过条件优化和反复筛选，最终获得的cd147纳米抗体对cd147的平衡解离常数为7.46×10-9m，达到甚至超过了完整抗体的亲和力量级。并且，本发明所述cd147纳米抗体特异性结合cd147而不结合其c端结构域c87，特异性好。(4)性能稳定，可塑性好。相对于普通抗体或抗体片段，本发明所述抗cd147单域抗体仅有一条链因此能够更方便的与效应分子偶联，并且保持稳定的对cd147的结合能力。本发明说明书中具体验证了两种方式，通过融合表达与6×histag共价(肽键)偶联，通过商品化链接试剂与酶标记偶联，两种方式生产的抗体连接产物都具有结合cd147的能力。附图说明通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：图1：本发明所述纳米抗体的氨基酸序列。fr1、fr2、fr3、fr4为四个框架区；cdr1、cdr2、cdr3为三个互补决定区。图2：phage-elisa实验结果图。横坐标1为阳性对照组,直接包被phage；横坐标2为阴性对照组，包被cd147、结合步骤使用随机噬菌粒；横坐标3为空白对照组，包被pbs、结合步骤使用空噬菌粒；横坐标4为无关对照，包被his标签、结合步骤使用12-3噬菌粒；横坐标5为实验组，包被cd147、结合步骤使用12-3噬菌粒。纵坐标为450nm吸光度值。图3：纳米抗体纯化图。泳道1为蛋白分子量marker；泳道2为菌体总蛋白；泳道3为菌体超声破碎沉淀；泳道4为菌体超声破碎上清；泳道5为his亲和层析后的12-3纳米抗体。图4：蛋白印迹western-blot图谱阴性对照：以ferritin上样进行sds-page电泳、转膜，以hrp标记的重组纳米抗体12-3结合、显色；阳性对照：两个泳道分别以重组表达的cd147和c87上样进行sds-page电泳、转膜，以商购的抗cd147抗体hab18结合、显色；其中c87即cd147c端结构域蛋白；实验组：两个泳道分别以重组表达的cd147和c87上样进行sds-page电泳、转膜，以hrp标记的重组纳米抗体12-3结合、显色。图5：纳米抗体12-3与cd147的结合力测定，平衡解离常数kd＝7.46×10-9m。具体实施方式下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。实施例一、抗cd147蛋白纳米抗体的淘选、阳性克隆的鉴定和测序采用固相淘选的方法，将cd147蛋白用1xpbs稀释到30-100ug/ul，包被到elisa板条上，每空加入100ul，4℃过夜包被。pbs洗三遍，每孔加入300ul4％的脱脂牛奶，37℃封闭2小时。pbs洗三遍后加入噬菌体展示库(约有1x1012cfu)，37℃1小时。吸出未结合的噬菌体，加入pbs洗5-10遍(逐轮增加洗涤次数)，再pbst洗三遍后加入100ul的ph＝2.2的甘氨酸-盐酸溶液，37℃7分钟。轻轻吹打板孔将吸附的噬菌体洗下来，然后加入tris-hcl溶液(ph＝8.8)15ul，取10ul测定滴度，其余的扩增后用于下一轮淘选。经过三轮淘选后，随机从测滴度的平板上挑取克隆用辅助噬菌体m13k07进行救援，得到展示目的蛋白的噬菌粒，用phage-elisa实验进行验证，加样表如下：表1：phage-elisa实验设计和步骤phage-elisa的实验结果如图2所示。将编号为12-3的阳性噬菌粒克隆送去测序，得到插入的纳米抗体基因碱基序列如下：5’-caggtgcagctgcaggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggatacaccttcagtagcagcaattgcatgggctggttccgccaggctccagggaaggagcgcgaggatgtcgcaattatttctgttcgtggtggcatcacatattatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccgtgacagcgccaagaacacgctgtcgctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccgtgtactactgtgcggcagataatcccaagtatagggcattgtccgatgctcactgcaattggagttatcgatactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3’根据上述基因碱基序列，按照大肠杆菌密码子确定阳性噬菌粒12-3中纳米抗体的氨基酸序列为：nh2-qvqlqesgggsvqaggslrlscaasgytfsssncmgwfrqapgkeredvaiisvrggityyadsvkgrftisrdsakntlslqmnslkpedtavyycaadnpkyralsdahcnwsyrywgqgtnvtvss-cooh通过结构分析和序列比对，确定纳米抗体12-3的fr1-4、cdr1-3，结果如图1所示。实施例二、纳米抗体的表达和纯化将上述碱基序列插入到pet15b质粒上，构建表达载体。取2ul构建好的pet15b质粒加入到50ul的bl21感受态中，冰上放置30分钟然后放入到42℃水浴中热激90秒，冰上放置10分钟，向悬液中加入800μl无抗性lb液体培养基，混匀后37℃，150rpm摇床振荡孵育1h，3500rpm常温离心4min，小心吸弃700μl上清，留约200μl培养基，反复吹打悬浮菌体，涂布于lb-amp固体平板上；将平板置于37℃恒温培养箱，正放培养10min后倒置培养过夜。第二天从过夜培养的平板上挑取单克隆，置于10mllb-amp液体培养基中，37℃，200rpm摇床震荡孵育8h，将离心管菌液加入1llb-amp液体培养基，37℃，200rpm摇床振荡培养4h，至菌液od600≥0.6，加入1ml0.1miptg，16℃，150rpm/min诱导15h；第二天将菌液离心收集用80mlpbs重悬菌体后进行超声破碎，条件为200w，破碎3s，间歇3s。然后4℃，8000g离心收集上清，过镍柱，纳米抗体吸附到镍柱上，用洗涤液(10mm咪唑溶液)洗去杂蛋白，加入洗脱液(250mm咪唑溶液)洗脱纳米抗体，在得到的纳米抗体溶液中加入pbs进行超滤(3600rpm/min,12min，重复3次)，得到的纳米抗体是溶在pbs中，测定浓度后加入20％的甘油-80℃保存备用。取重组大肠杆菌菌体总蛋白、菌体超声沉淀、菌体超声上清、亲和层析纯化的纳米抗体进行sds-page，实验结果如图3所示。实施例三、纳米抗体的westernblot验证1.纳米抗体hrp的标记取40ug抗体溶液(体积根据浓度计算)，加入12ul(100μl＝1mg)reagentⅰa型活化辣根氧化物酶。以reagentⅱ调ph值至9.5左右(大约10ul，因抗体用的缓冲液的差别，量有所不同，但确保ph在9.0以上，可以多加reagentⅱ(10μl)，并准确记录reagentⅱ的使用量，以备下一步用)37℃，30min。加入微量硼氢化钠。(适合酶标物长期放置的，即时使用无需添加。取200ul的枪头，插入硼氢化钠粉末，在管尖处有看得见白色粉末，再转移到酶标物，吹打溶解混匀即可)。加入reagentⅲ(约3倍体积的reagentⅱ)。上一步用去reagentⅱ10ul，这一步加入reagentⅲ30μl。确保酶结合物ph在7.0左右，可以多加reagentⅲ调整)，混匀终止反应。加甘油至50％，-20℃保存。2.westernblot收集蛋白样品：纳米抗体12-3(1.07mg/ml)、c87(cd147c端结构域蛋白，0.65mg/ml)及cd147(0.6mg/ml)；sds-page凝胶电泳：配胶(15％的分离胶)，跑胶(低压80v，40min，高压120v，50min)；起胶：将凝胶从玻璃板中取出，切除积层胶及溴酚蓝下部的分离胶，剩下的含有目的蛋白的分离胶浸泡于转膜缓冲液中，防止胶凝固、变形；润湿：准备2张滤纸、1张pvdf膜，尺寸与凝胶大小相仿(滤纸与胶一样大，膜比胶大一些)，pvdf膜先放入甲醇中浸泡30s，再放入转膜缓冲液中10分钟；三明治的制作：按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、1层滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、1层滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。组装顺序：转膜夹黑色面(负极)－海绵垫－滤纸－胶－膜－滤纸－海绵垫－红色面(正极)；转膜(70v，70min)：将转移夹放入转移槽，加入4℃预冷的转膜缓冲液，将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连；封闭：转膜完后的膜用洗涤液洗10min，然后吸去洗涤液，然后加5％脱脂牛奶封闭1h。封闭后用tbst洗3遍，每次10min；加hrp标记的纳米抗体12-3，4℃孵育过夜；用tbst洗三次，每次10min；加发光液(a液和b液以1:1混合)显色，拍照。蛋白印迹western-blot图谱如图4所示。实施例四、抗cd147纳米抗体结合力的测定把cd147蛋白稀释到10ug/ml(每孔200μl)，将实施例二中得到的纯化纳米抗体稀释到80μg/ml、40μg/ml及20μg/ml(每孔200μl)稀释液为pbs+0.1％的吐温-20+0.1％的bsa，按下表加样至octetred/qk：表2：纳米抗体12-3与cd147的结合力测定结合力测定实验组对照组平衡液pbst+bsapbst+bsa传感器包被液cd147+pbst+bsacd147+pbst+bsa平衡液pbst+bsapbst+bsa反应液pbst+bsa+纳米抗体pbst+bsa解离液pbst+bsapbst+bsa检测步骤时间设定如下(1)pbst平衡阶段，sa传感器在200μl平衡液中反应60s；(2)loading阶段，sa传感器在200μl蛋白稀释液中反应200s；(3)association阶段，sa传感器在200μl纳米抗体梯度稀释液中反应200s；(4)dissociation阶段，sa传感器在200μl解离液中反应200s。以上操作均在30℃，1000rpm条件下进行。检测结果如图5所示，其中ka＝1.71×105ms-1kd＝1.28×10-3s-1kd＝kd/ka＝7.46×10-9m以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。序列表<110>申请人名称:北京大学<120>一种抗cd147纳米抗体、其生产方法及应用<130>无<160>9<170>patentinversion3.5<210>1<211>129<212>prt<213>抗cd147纳米抗体<400>1glnvalglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglygly151015serleuargleusercysalaalaserglytyrthrpheserserser202530asncysmetglytrppheargglnalaproglylysgluarggluasp354045valalaileileservalargglyglyilethrtyrtyralaaspser505560vallysglyargphethrileserargaspseralalysasnthrleu65707580serleuglnmetasnserleulysprogluaspthralavaltyrtyr859095cysalaalaaspasnprolystyrargalaleuseraspalahiscys100105110asntrpsertyrargtyrtrpglyglnglythrglnvalthrvalser115120125ser<210>2<211>387<212>dna<213>抗cd147纳米抗体编码基因<400>2caggtgcagctgcaggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactc60tcctgtgcagcctctggatacaccttcagtagcagcaattgcatgggctggttccgccag120gctccagggaaggagcgcgaggatgtcgcaattatttctgttcgtggtggcatcacatat180tatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccgtgacagcgccaagaacacgctg240tcgctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccgtgtactactgtgcggcagat300aatcccaagtatagggcattgtccgatgctcactgcaattggagttatcgatactggggc360caggggacccaggtcaccgtctcctca387<210>3<211>10<212>prt<213>cdr1<400>3glytyrthrpheserserserasncysmet1510<210>4<211>7<212>prt<213>cdr2<400>4servalargglyglyilethr15<210>5<211>21<212>prt<213>cdr3<400>5alaalaaspasnprolystyrargalaleuseraspalahiscysasn151015trpsertyrargtyr20<210>6<211>25<212>prt<213>fr1<400>6glnvalglnleuglngluserglyglyglyservalglnalaglygly151015serleuargleusercysalaalaser2025<210>7<211>17<212>prt<213>fr2<400>7glytrppheargglnalaproglylysgluarggluaspvalalaile151015ile<210>8<211>38<212>prt<213>fr3<400>8tyrtyralaaspservallysglyargphethrileserargaspser151015alalysasnthrleuserleuglnmetasnserleulysprogluasp202530thralavaltyrtyrcys35<210>9<211>11<212>prt<213>fr4<400>9trpglyglnglythrglnvalthrvalserser1510当前第1页12