本发明涉及与血脂水平和冠心病相关的单核苷酸多态性rs7901016检测系统及相关应用，具体而言本发明涉及检测来自待测个体的样品中cd16基因rs7901016位点的多态性的试剂材料和/或仪器设备在制备用于评估血脂水平、血脂异常和/或冠心病发病风险的检测系统中的应用，还涉及一种评估血脂水平、血脂异常和/或冠心病发病风险的检测系统。
背景技术：
大量研究资料表明，血脂异常是冠心病、心肌梗死、心脏性猝死和缺血性脑卒中的独立危险因素。它通过加速全身动脉粥样硬化，对身体造成隐匿、逐渐、进行性、全身性和器质性的损害。研究显示，人群血胆固醇水平每升高1％，冠心病(cad)发病增加2％～3％。我国血脂异常患者总数上升呈显著趋势，2007～2008年中国国家糖尿病和代谢紊乱研究结果提示，我国20岁以上人群胆固醇水平与2002年相比增加了23.9％，血脂异常已经成为我国居民的重要公共卫生问题。2011年度北京市卫生与人群健康状况报告数据显示，北京市常住居民中超半数市民血脂异常，其中18～30岁男性的血脂异常患病率已经达到58.5％。
血浆总胆固醇(tc)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)和甘油三酯(tg)浓度是心血管疾病最重要的危险因素和治疗干预的靶点和目标。世界卫生组织最新资料提示心血管疾病防控获益中，血脂异常危险因素控制所带来的贡献最大。美国1980～2000年期间冠心病死亡下降一半，完全归功于开展国民胆固醇教育所作出的贡献。
大多数血脂异常具有复杂的病因机制，是多个基因之间或多个基因与环境因长期相互作用的结果。全基因组关联研究成功地确定了多个与血脂相关的遗传位点。然而，几乎所有这些位点最初都是在欧洲血统的人群中确定的，缺乏亚洲人群特别是中国人群中的研究数据。中国人和欧洲人之间的环境暴露和遗传背景的差异巨大，因此亟需鉴定中国汉族人群特异血脂变异位点，将有助于对国人高脂血症预防、新药开发、诊断和个体化治疗。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于确定亚洲人群特别是东亚人群特异性的与血脂水平相关的遗传位点，提供通过检测相关遗传位点评估血脂水平、血脂异常和/或冠心病发病风险的方法，并提供评估血脂水平、血脂异常和/或冠心病发病风险的检测系统及相关应用。
本案发明人以东亚人群包括中国人、菲律宾人、美籍华人、新加坡籍华裔、新加坡籍马来西亚人等为研究对象，分析研究了11万多个单核苷酸多态性(snp)与tc、ldl-c、hdl-c、tg的关联关系，确定了单核苷酸多态性位点rs7901016与血脂水平相关。rs7901016位点为东亚人群特异性的与血脂水平相关的遗传位点。本发明的初筛实验阶段研究数据表明，mcu基因区域的rs7901016与ldl-c显著相关，达全基因组显著性水平(p＝5.12×10-9)；在重复验证阶段中，该位点p值依然显著(p＝0.015)，说明该关联可靠性强。将两个阶段样本合并分析，p值达到2.99×10-10，显著性水平更强。本发明进一步发现rs7901016的t等位基因与cad的关联分析显示，与ldl-c的关系一样，t等位基因能够增加东亚人群发生cad的风险(or＝1.06,95％ci＝1.02-1.11,p＝2.8×10-3)。t等位基因可以引起低密度脂蛋白胆固醇水平升高。每增加一个t等位基因可以引起冠心病风险提高6％。
从而，通过检测来自待测个体的样品中rs7901016位点的多态性，可以用于评估待测个体血脂水平特别是低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平，也可以用来评估待测个体血脂异常和/或冠心病发病风险。
一方面，本发明提供了检测来自待测个体的样品中rs7901016位点的多态性的试剂材料和/或仪器设备在制备用于评估血脂水平、血脂异常和/或冠心病发病风险的检测系统中的应用。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，血脂水平包括低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，rs7901016的风险等位基因为t。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，rs7901016位点t等位基因携带者比非携带者具有较高的低密度脂蛋白胆固醇水平、较高的血脂异常发病风险和/或较高的冠心病发病风险。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述待测个体为东亚人群，包括中国人、菲律宾人、美籍华人、新加坡籍华裔、新加坡籍马来西亚人等。具体检测时，所述样品可来自待测个体的血液、尿、唾液、胃液、头发或活组织检查等，优选为血液。
可用本领域中任何的可行技术在dna水平、rna水平检测本发明所述的单核苷酸多态性位点。例如：可以采用直接测序的方法，通过dna直接测序可以直接揭示对照基因和携带突变基因之间的序列差异，具体可以是传统的使用商业测序试剂盒或自动测序仪对dna直接进行测序，或是近年来发展的焦磷酸测序(pyrosequencing)、微测序(snapshot)等。也可以采用基于杂交的方法，具体包括taqman探针法，dna芯片法等。还可以采用基于引物延伸的方法，如基质辅助激光解析离子飞行时间质谱(maldi-tof-ms)。还可以采用基于构象的方法，具体例如限制性片段长度多态性(rflp)分析、单链构象多态性(single-strandconformationalpolymorphism，sscp)分析、变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis，dgge)分析、变性高效液相色谱技术(denaturinghighperformanceliquidchromatography，dhplc)等分析技术。还可以采用高分辨率溶解曲线分析技术(hrm)。在具体实施时，本领域的技术人员可以根据实际情况选择上述的任一种技术体外检测本发明所述单核苷酸多态性位点，也可以采用多种技术的组合来体外检测所述单核苷酸多态性位点。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述检测rs7901016位点的多态性的试剂材料和/或仪器设备可以是任何可行的检测所述单核苷酸多态性位点的技术中所用到的试剂材料和/或仪器设备等。例如：用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片断长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于以下任一种snp分型方法的试剂：基于杂交的方法、基于引物延伸的方法、基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术等。
另一方面，本发明还提供了一种评估血脂水平、血脂异常和/或冠心病发病风险的检测系统，其包括：检测来自待测个体的样品中rs7901016位点的多态性的试剂材料和/或仪器设备。
根据本发明的具体实施方案，本发明的评估血脂水平、血脂异常和/或冠心病发病风险的检测系统，其包括检测单元和评估单元，其中：
所述检测单元包括检测来自待测个体的样品中rs7901016位点的多态性的试剂材料和/或仪器设备，用于获得待测个体携带rs7901016位点风险等位基因情况的检测结果；
所述评估单元包括用于根据检测单元的检测结果进行评估处理的处理单元；其中，rs7901016位点t等位基因携带者比非携带者具有较高的低密度脂蛋白胆固醇水平、较高的血脂异常发病风险和/或较高的冠心病发病风险。
本发明的评估血脂水平和/或血脂异常发病风险的检测系统，可以是虚拟装置，只要能实现所述检测单元以及评估单元的功能即可。所述的检测单元可以是包括各种检测试剂材料和/或检测仪器设备等；所述的数据分析单元可以是任何可以实现对检测单元的检测结果进行分析处理而得出血脂水平和/或血脂异常发病风险评估状况的运算仪器、模块或是虚拟设备，例如可以是预先将各种可能的检测结果与对应的血脂水平(包括ldl-c水平)、血脂异常发病风险和/或冠心病发病风险制定相应的数据图表，将检测单元的检测结果对照该数据图表即能得出血脂水平、血脂异常和/或冠心病发病风险评估结果。
应用本发明的技术，可以通过检测rs7901016位点多态性，评估东亚人群血脂水平、血脂异常和/或冠心病发病风险，制定出针对研究对象的个体化健康行动方案，并将有助于对国人高脂血症预防、新药开发、诊断和个体化治疗。
附图说明
图1显示rs7901016的meta分析结果。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。
实施例一
本发明分两个阶段(初筛阶段与验证阶段)分别检测和分析遗传变异与tc、ldl-c、hdl-c和tg相关的遗传变异。
研究人群为东亚人群，包括第一阶段44985例研究对象和验证阶段13408例研究对象。每个研究均获其研究机构及当地调查机构伦理委员会批准。所有参与者均书面签署知情同意书。
第一阶段，对东亚人群44985名调查对象进行外显子组关联研究meta分析。44985例研究对象，来自中国眼科研究(ches)、中国健康与营养调查(chns)、防城港男性健康检查调查(famhes)、贵州毕节2型糖尿病研究(gbtds)、香港大学专项研究计划(hku-trs)、湖北冠心病研究(hucad)和中国老龄人口营养和健康状况调查(nhapc)等23项研究。人群基本信息参见表1。23个独立血脂水平研究所使用的基因分型平台、基因型-表型分析软件等情况见表2。合并所有样本进行关联分析，排除单态位点后最终110986个遗传变异纳入关联分析，研究的统计学显著性设为p<4.5×10-7。选择与东亚人群血脂水平显著关联的位点在独立样本中进行重复验证。
在第一阶段，对每个队列中所测得的hdl-c、ldl-c、tg和tc指标都经过年龄、年龄平方和各研究特定的协变量进行调整并转化为均值为0标准差为1的标准正态分布以提高不同变量间的可比性。使用raremetalworker或者rvtests软件分别对分析各个研究样本中遗传变异与hdl-c、ldl-c、tc和tg关联关系，进而使用raremetals软件进行meta分析合并各个研究的结果。在验证阶段各个研究的血脂水平分析方案与第一阶段一致。最后应用metal的固定效应倒数加权meta分析合并两阶段结果。
表1、第一阶段外显子芯片检测人群基本信息
缩写：ches，中国眼科研究；chns，中国健康与营养调查；clhns，cebu纵向健康与营养调查；famhes，防城港男性健康检查调查；gbtds，贵州毕节2型糖尿病研究；hku-trs，香港大学专项研究计划；hucad，湖北冠心病研究；nhapc，中国老龄人口营养和健康状况调查；puuma，北京大学健康科学中心和密歇根大学医学院心肌梗死的研究；sbcs，上海乳腺癌研究；sces，新加坡中国人眼科研究；simes，新加坡马来人眼科研究；smhs，上海男性健康研究；sp2，新加坡前瞻性研究项目；swhs，上海女性健康研究；tudr，美国中国台湾人糖尿病视网膜病研究；tc，总胆固醇；ldl-c，低密度脂蛋白胆固醇；hdl-c，高密度脂蛋白胆固醇；tg，甘油三脂；bmi，体重指数。
表2、第一阶段研究样本外显子芯片检测技术平台和分析软件
本发明中，第一阶段在来自东亚人群的44985名调查对象中评价了11万多个snps与tc、ldl-c、hdl-c和tg的关联关系。
第一阶段的分析结果表明mcu基因区域的rs7901016与ldl-c显著相关，达全基因组显著性水平(p＝5.12×10-9)，meta分析结果见图1。
第二阶段，验证阶段。选择我国动脉粥样硬化研究ⅰ和ⅱ(cas、cas-ⅱ)、北京动脉粥样硬化研究(bas)、盐敏感性遗传流行病学网络(gensalt)人群中进行重复验证，总共包括样本13408例。人群基本信息见表3。从这些gwas研究中选择第一阶段与血脂水平显著关联的位点查看其分型结果并验证其与血脂水平的相关性。五个独立血脂水平研究所使用的基因分型平台以及基因型-表型分析软件等情况见表4。
为了进一步评估显著的血脂位点否也影响了cad患病风险，本发明还应用东亚人群cad数据进行了病例对照研究，该数据包括北京大学健康科学中心和密歇根大学医学院心肌梗死的研究(puuma-mi)、香港大学专项研究计划(hku-trs)、湖北冠心病研究(hucad)、北京动脉粥样硬化研究(bas)和中国动脉粥样硬化研究(cas)，其中有9661例cad患者和18558例对照，共计28899例。
表3、重复验证阶段人群基本信息
缩写：cas，中国动脉粥样硬化研究；bas，北京动脉粥样硬化研究；gensalt，盐敏感性遗传流行病学网络研究；tc，总胆固醇；ldl-c，低密度脂蛋白胆固醇；hdl-c，高密度脂蛋白胆固醇；tg，甘油三脂；bmi，体重指数。
表4、第二阶段研究样本gwas研究基因分型技术平台、分析软件
重复验证中，对所有样本真空采血针静脉穿刺采集隔夜静脉血，测定包含总胆固醇、hdl-c、tg水平。血液样本测定在北京中国医学科学院阜外医院群体遗传研究室的临床检验中心实验完成。该实验室参与美国疾病控制和预防中心的脂质标准化计划。日立7060全自动生化分析仪测定总胆固hdl-c和甘油三酯。应用friedewald方程计算ldl-c浓度。
在验证阶段，与第一阶段一致将血脂水平标准正态转换，应用线性回归模型，加性模型分析血脂水平(连续变量)和选定位点分型的相关性，并校正年龄、年龄平方、性别和体重指数变量。
在重复验证阶段中，rs7901016位点p值依然显著(p＝0.015)，说明该关联可靠性强。
应用metal的固定效应倒数加权meta分析合并两阶段结果。
表5列出了本发明研究的rs7901016与血脂关联性结果数据。
表5、rs7901016与血脂关联结果
初筛阶段研究数据表明，mcu基因区域的rs7901016与ldl-c显著相关，达全基因组显著性水平(p＝5.12×10-9)meta分析结果见图1；在重复验证阶段中，该位点p值依然显著(p＝0.015)，说明该关联可靠性强。将两个阶段样本合并分析，p值达到2.99×10-10，显著性水平更强，见表5。
表6列出了本发明研究的rs7901016与cad关联性结果数据。
rs7901016与cad的关联分析显示，与ldl-c的关系一样，c等位基因能够降低中国人群发生cad的风险(or＝1.06,95％ci＝1.02-1.11,p＝2.8×10-3)，见表6。