本发明属微生物及环境科学技术领域，更具体地说，本发明涉及一种高效的好氧反硝化细菌——假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01及其在水体脱氮中的应用。
背景技术：
随着工农业的快速发展和人类活动的加剧，氮素成为各种水体中的重要污染物，严重威胁生态安全、环境安全和人类健康。因此，如何解决水体中亚硝酸盐偏高的问题具有重要的现实意义。
好氧反硝化细菌是指在有氧气存在的条件下利用氮的氧化物作为电子受体，从而进行反硝化过程的菌。很多好氧反硝化细菌在去除亚硝酸盐方面具有独特的优势，能将亚硝酸盐最终还原为气体或者自身同化而脱离养殖水体，无残留，不造成二次污染、能改善和维持养殖生态平衡，减少疾病发生，在生物除氮中具有重要作用。
好氧反硝化菌在生理生化和系统发育上存在多样性。大量研究表明，好氧反硝化细菌主要分布于假单胞菌属(pseudomonaceae)、产碱杆菌属(alcaligenes)、副球菌属(paracoccus)、芽胞杆菌属(bacillus)等属中。专利201611257678.3(申请日2016.12.30)公布了一株铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)，在ph4.5以上时，培养70h以后，对硝酸盐的去除率在40-100％，但不能去除亚硝态氮no2--n。专利201510124201.7(申请日2015.03.20)公布了一株假单胞菌pseudomonasbrassicacearumsubsp.brassicacearum,培养8天时，对硝酸盐的降解率达到100％，但同样会积累亚硝酸盐。专利201310568985.3(申请日2013.11.15)公布了一株黄色海假单胞菌(pseudomonasxanthomarina)，孵育72h后，脱氮率90％。专利201010506931.0(申请日2010.10.14)公布了一株假单胞菌cctccm2010209，24h后对初浓度为100mg/l的亚硝酸盐去除率为17.35％。专利201410229739.x(申请日2014.05.28)公布了一株假单胞菌cgmccno.9089，能还原硝酸盐，同时基本不累积亚硝酸盐，培养48h后，总氮去除率98.94％。专利201511015597.8(申请日2015.12.31)公布了一株变形假单胞菌(pseudomonasplecoglossicida)，培养36h后，对亚硝态氮的去除率70-80％。
技术实现要素：
本发明的目的在于：根据目前缺乏新型高效的好氧反硝化菌，提供一种从自然界分离的、高效的好氧反硝化细菌——假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01及其在水体脱氮中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种从深海沉积物中经过二次驯化
1.9095t具有最高的16srrna基因相似性(99.29％)，但pseudomonasbauzanensis不能还原亚硝酸盐(doi:10.1099/ijs.0.026104-0，intjsystevolmicrobiol)。且假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01与专利201010506931.0中的假单胞菌cctccm2010209具有96.27％的16srrna基因相似性；与专利
201410229739.x中的假单胞菌cgmccno.9089具有93.75％的16srrna基因相似性；均小于细菌分类阈值(97％)，说明本发明假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01是一株新型的菌株。
本发明假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01的生物学特征为：革兰氏染色阴性、能在nano2为唯一氮源的固体培养基上生长，且培养时，其菌落为乳白色、半透明，圆形，菌落表面湿润光滑，细胞呈杆状，能利用亚硝酸盐为唯一氮源生长。
本发明假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01的16srrna的核苷酸序列如seqidno:1所示。将该序列在ncbi及ezbiocloud网站上进行同源性比对分析，结果表明其与pseudomonasbauzanensis的16srdna序列相似性较高，相似度为99.2％。
本发明假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01在以no2--n(14mg/l)为唯一氮源的培养基中培养12h后，对no2--n的去除率达100％。
相对于现有技术，本发明具有如下优点：
本发明发现了一种新型高效的好氧反硝化细菌——假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01，本发明假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01在亚硝态氮初始浓度为14mg/l时，培养12h后对亚硝态氮的去除率达100％，且在去除水体中亚硝态氮的同时，不累积硝态氮和氨氮，不能产生二次污染，因此本发明假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01及其脱氮功能对水体脱氮具有很好的应用前景。
保藏信息：假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：gdmccno.60228，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017年9月4日。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明以及有益效果进行详细说明。
图1为本发明假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01在固体平板上的菌落形态。
图2为本发明假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01在光学显微镜下(100×)的照片。
图3为本发明假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01生长趋势与脱除亚硝态氮的能力示意图，其中，方形代表亚硝态氮浓度，圆形代表菌株生长趋势。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。若无特别说明，实施例中所述方法均为常规方法，所用试剂均为常规试剂或按常规方式配制的试剂。
实施例1假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01的分离
1.富集培养：
配制富集所用培养基，配方如下：丁二酸钠2.5g，二水合柠檬酸钠2.5g，nano21g，k2hpo41g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.2g，l-天冬酰胺1g，ph7.4，定容至1000ml，分装至250ml三角瓶中，每瓶100ml。121℃，20min，高温高压灭菌。添加无菌过滤后的复合碳源1％，复合维生素0.2％，复合微量元素0.2％。
其中，复合碳源：d-葡萄糖6.9g，d-果糖6.9g，d-乳糖6.9，醋酸钠9.5g，90％乳酸6.4ml，甘露醇7g，无水乙醇7ml，甘油6.3ml，苯甲酸钠4.8g，水杨酸4.6g，溶于500ml水中，ph7.4，0.22μm滤膜过滤除菌。
复合维生素：生物素/vh10mg，叶酸/vb9100mg，吡哆醇/vb6100mg，硫胺素/vb1200mg，烟酸200mg，泛酸钙100mg，vb122mg，核黄素/vb220mg，硫辛酸20mg，edta-na400mg，调ph至7.5，0.22μm滤膜过滤除菌。
复合微量元素：znso4·7h2o0.1g，mncl2·4h2o0.4g，h3bo31.24g，cocl2·2h2o0.5g，cucl2·2h2o0.5g，niso4·6h2o0.02g，namoo4·2h2o0.4g，ki0.2g，cacl25g，feso4·7h2o1.1g，edta-na10g，溶于1000mlh2o，ph7.4，0.22μm滤膜过滤。
取海洋沉积物样品2g，放入装有上述培养基的锥形瓶中，28℃，180rpm，培养7d，进行脱氮细菌的富集。对以上孵育一周以后的培养物，转接5ml至新的装有培养基的锥形瓶中，28℃，180rpm，培养7d，进行二次富集。
2.分离纯化
对于上述二次富集培养物，采用稀释涂布法涂布固体平板(所用固体培养基是在富集培养基配方的基础上添加1.7％的琼脂)；肉眼观察菌落形态(图1)，并划线纯化，挑取已纯化的菌落至5ml含杜氏管的液体培养基(富集培养基，但nano2浓度为10mm，即n浓度为140mg/l)，28℃孵育观察产气情况，发现菌株能将亚硝酸盐转化为气体产物。对纯化后的菌株，扩大培养并保种甘油管和冻干管，其光学显微镜下(100×)的照片如图2所示。
3.16srdna鉴定
提取菌株的基因组dna，用细菌16srrna基因扩增通用引物27f/1492r扩增得到pcr产物，并送至上海美吉生物医药科技有限公司(广州分公司)进行序列测序，测序结果与ezbiocloud网站数据库中的16srdna序列进行同源性比对分析，结果分析表明其与菌株pseudomonasbauzanensis的16srrna基因序列相似性最高(99.2％)。基于以上结果分析，初步鉴定本发明菌株为pseudomonassp.，分类学命名为：假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01。
4.定量检测假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01的脱氮性能
接种假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01至液体培养基中(富集培养基，但其中nano2浓度为10mm，即no2--n浓度为14mg/l)，28℃，180rpm摇床培养，分别在培养0、4、8、12、16、24、32、40h后，取样，一部分样品用于检测od600值，另一部分培养液离心取上清，定量检测n浓度(格里斯试剂法)。如图3所示，假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01对水体中no2--n有很好的降解效果，在该菌长到od600为0.4左右(约12h)时，能将水体中初始浓度为14mg/l的no2--n降解完全；同时用二苯胺显色法检测水体中硝酸根，用纳氏试剂检测水体中铵根，结果表明假单胞菌属(pseudomonassp.)dn13-01在降解亚硝酸根的过程中不积累硝态氮和氨氮，无二次污染。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
序列表
<110>广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
广东博沃特生物科技有限公司
<120>一种好氧反硝化细菌及其在水体脱氮中的应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1402
<212>dna/rna
<213>假单胞菌属(pseudomonassp.dn13-01的16srrna16srrna)
<400>1
tgcagtcgagcggaagaagggagcttgctcccggatttagcggcggacgggtgagtaaca60
cctgggaatctgcctgatagtgggggataacgtccggaaacgggcgctaataccgcgtac120
gtcctacgggagaaagcaggggatcttcggaccttgcgctatcagatgagcccaggtcgg180
attagcttgttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagagg240
atgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtgggg300
aatattggacaatgggggcaaccctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttc360
ggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggctttaggctaataccctgaagttttga420
cgttaccgacagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagaggg480
tgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttcagtaagatggg540
tgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccataactgctgggctagagtacggt600
agagggtagtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccag660
tggcgaaggcgactacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaa720
caggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttgggaacct780
tgagttcttagtggcgcagctaacgcactaagttgaccgcctggggagtacggtcgcaag840
attaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattc900
gaagcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatgcagagaactttccagagatggatt960
ggtgccttcgggaactctgacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgaga1020
tgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgttatggt1080
gggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtca1140
tcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatgggggatacaaagggttgcca1200
agccgcgaggtggagctaatcccataaagtctctcgtagtccggattggagtctgcaact1260
cgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgtt1320
cccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagcta1380
gtctaaccttcggaggacggta1402