本发明属于胶原蛋白提取
技术领域：
，具体涉及一种日本黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白的提取方法及应用。
背景技术：
：胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，广泛存在于动物的结缔组织中，占动物体内蛋白质总量的25%～30%。胶原蛋白的结构特征是三螺旋结构，分子结构非常稳定，且具有低免疫原性和良好的可生物降解性等特征胶原蛋白作为天然的生物资源，具有独特的生物相容性和生物可降解性，作为生物材料，广泛应用在医药、食品、化妆品等领域。水产品加工过程中会产生出占鱼体总重约40%～50%的副产物（包括鱼头、鱼皮、鱼鳔、鱼骨及残留鱼肉），这些副产物的加工和利用程度很低。日本黄姑鱼是我国重要的新养殖品种之一，在加工的过程中产生大量的副产物，本发明以日本黄姑鱼鱼鳔为原料，发明了一种鱼鳔胶原蛋白的提取方法。现有技术如，中国发明专利授权文献，授权公告号为cn103451258b，该发明提供了一种具有高抗疲劳活性的梅鱼鱼鳔胶原蛋白的制备工艺，采用海产品加工废料—梅鱼鱼鳔作为提取原料，先将梅鱼鱼鳔除杂蛋白、脱脂，然后先用胃蛋白酶提取胶原蛋白，再将胃蛋白酶提取胶原蛋白后所得沉淀用复合酶提取胶原蛋白，合并提取到的胶原蛋白，离心干燥后得到具有高抗疲劳活性的梅鱼鱼鳔胶原蛋白。胶原蛋白提取率高，能够有效利用废弃的梅鱼鱼鳔，提高了经济效益，制得的胶原蛋白常温下可溶于蒸馏水，无异味，苦味，抗疲劳活性好，无明显毒副作用，但其所制备的胶原蛋白热变性温度低，在后期加工应用中结构及活性容易受影响。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种日本黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白的提取方法及应用，采用安全绿色的方法从日本黄姑鱼加工下脚料鱼鳔中提取胶原蛋白，提取率高，且提取的胶原蛋白不含雌激素，结构完整，纯度、生物活性高。本发明为解决上述技术问题所采取的方案为：一种日本黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白的提取方法，包括去杂蛋白、脱脂、酶解提取、纯化、去雌激素和冷冻干燥，本提取方法能高效利用日本黄姑鱼加工下脚料鱼鳔，不仅保护环境，还可有效提高黄姑鱼的经济价值，提取方法安全绿色，提取率高。作为优选，去杂蛋白操作为：取解冻鱼鳔剪碎，加入0.3~0.55mol/l的na2co3溶液，在温度4~8℃，超声波脉冲为下进行0.6~1h的去杂蛋白处理，该条件下鱼鳔中杂蛋白的去除率高，胶原蛋白流失量小，其中超声波辅助使得鱼鳔结构松散，鱼鳔胶原纤维伸展，部分断裂，进而提高杂蛋白的溶出量，提升去杂蛋白效果。作为优选，脱脂步骤为：取去杂蛋白后的鱼鳔，以料液比为1:3.6~4.5，加入0.3~0.55mol/l的naoh溶液浸泡5~7h，水洗至中性，加入无水乙醚与亚苄基丙酮的混合液浸泡2.4~4.5h，混合液中无水乙醚、亚苄基丙酮和水的依次重量比为1:0.12~0.18:3~6，水洗至中性，该步骤中naoh溶液浸泡后使鱼鳔中脂肪发生皂化反应，从而生成可溶于水的脂肪酸钠，加入的亚苄基丙酮可与乙醚发生络合反应，形成稳定的络合物作用于脂肪酸钠，提高其表面活性，使得未发生皂化反应的脂肪被乳化而分散在水中，提高鱼鳔的脱脂效果，提高蛋白提取纯度。作为优选，酶解提取操作为：取脱脂后的鱼鳔，以1:42~46加入蒸馏水，后加入1.4~1.7%的胃蛋白酶，在温度为33~37℃下酶解23~25h，加入终浓度为19mmol/l的edta灭酶，该条件下胶原蛋白的溶出率高，且可保持胶原蛋白的超螺旋结构，保持其生物活性，所得到的胶原蛋白为i型胶原蛋白，应用范围广，且酶解过程试剂用量少，可有效降低提取成本，为最佳酶解条件。作为优选，纯化操作为：取酶解液，在3800~4000r/min下离心28~31min，过滤，持续搅拌下加入nacl固体至nacl浓度为0.57~0.68mol/l，静置，在3800~4100r/min下离心28~35min，弃上清液，重复操作1~2次，过滤取沉淀，加入7~10倍体积的0.3~0.53mol/l的醋酸溶液浸泡13~18h，在3800~4000r/min下离心28~31min，取沉淀，分别用0.08~0.12mol/l醋酸和蒸馏水透析1.5~2.3h，透析2~3次，该纯化步骤可有效去除胶原蛋白提取过程中残留的游离阴离子或阳离子或化合物，避免了杂质对胶原蛋白化学组分和物料性质的影响，溶液中的氯化钠可破坏胶原蛋白表面的水化层，使其在水中的溶解度大幅下降，胶原蛋白以沉淀形式从溶液中析出，生物活性未被破坏，该条件下纯化效果好，纯化成本低。作为优选，去雌激素操作为：利用以磁性沸石咪唑酯骨架结构材料为基底，结合纳米级硅酸锆合成的一种高效的zimsi涂层进行自动化固相微萃取微量的激素，将胶原蛋白用超声波处理8~15min，在8~14℃下利用zimsi涂层洗脱24~35min，zimsi涂层的比表面积大，具有多孔立体网状空间结构，吸附性能优异，添加纳米级硅酸锆可提升zimsi涂层结构的稳定性和多样性，使得zimsi涂层呈现出对雌激素的特异性吸附性能，可有效去除胶原蛋白中的雌激素，故该涂层为吸附雌激素的功能吸附涂层，其吸附机理尚不明确，有待进一步研究。作为优选，冷冻干燥条件为：冷冻干燥温度-35~-20℃，压强1~9pa，冷冻干燥时间6~13h，该冷冻干燥条件对胶原蛋白的干燥效果好，且可保持胶原蛋白一级结构完整性，保持其生物活性。作为优选，提取得到的胶原蛋白为ｉ型胶原蛋白，本胶原蛋白含有多种氨基酸，因其三股超螺旋结构，故其性质稳定，具有优良的低免疫原性、相容性、可降解性以及凝血性，其应用范围广。作为优选，日本黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白用于食品或保健品或生物材料或化妆品的用途，本发明提取所得的日本黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白结构完整，生物活性高，具有优良的粘着力和热稳定性，且其抗拉伸强度高，在食品或保健品或生物材料或化妆品方面均具有较大的使用前景。与现有技术相比，本发明的有益效果为:1）本提取方法能高效利用日本黄姑鱼加工下脚料鱼鳔，不仅保护环境，还可有效提高黄姑鱼的经济价值，提取方法安全绿色，提取率高；2）本发明提取所得的日本黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白结构完整，生物活性高，具有优良的粘着力和热稳定性，且其抗拉伸强度和抗降解能力高，在食品或保健品或生物材料或化妆品方面均具有较大的使用前景；3）脱脂中加入的亚苄基丙酮可与乙醚发生络合反应，形成稳定的络合物作用于脂肪酸钠，提高其表面活性，使得未发生皂化反应的脂肪被乳化而分散在水中，提高鱼鳔的脱脂效果；4）zimsi涂层的比表面积大，具有多孔立体网状空间结构，吸附性能优异，添加纳米级硅酸锆可提升zimsi涂层结构的稳定性和多样性，使得zimsi涂层呈现出对雌激素的特异性吸附性能，可有效去除胶原蛋白中的雌激素。具体实施方式以下结合实施例作进一步详细描述：实施例1：一种日本黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白的提取方法，其提取步骤为：1）去杂蛋白：取解冻鱼鳔20g，剪碎，加入0.37mol/l的na2co3溶液，在温度5℃，超声波脉冲为下进行0.7h的去杂蛋白处理，该条件下鱼鳔中杂蛋白的去除率高，胶原蛋白流失量小，其中超声波辅助使得鱼鳔结构松散，鱼鳔胶原纤维伸展，部分断裂，进而提高杂蛋白的溶出量，提升去杂蛋白效果；2）脱脂：取去杂蛋白后的鱼鳔，以料液比为1:3.8，加入0.37mol/l的naoh溶液浸泡5.7h，水洗至中性，加入无水乙醚与亚苄基丙酮的混合液浸泡2.8h，混合液中无水乙醚、亚苄基丙酮和水的依次重量比为1:0.13:5，水洗至中性，得脱脂鱼鳔，该步骤中naoh溶液浸泡后使鱼鳔中脂肪发生皂化反应，从而生成可溶于水的脂肪酸钠，加入的亚苄基丙酮可与乙醚发生络合反应，形成稳定的络合物作用于脂肪酸钠，提高其表面活性，使得未发生皂化反应的脂肪被乳化而分散在水中，提高鱼鳔的脱脂效果，亚苄基丙酮与乙醚的络合反应及其作用机理尚不明确，有待进一步研究；3）酶解提取：取脱脂后的鱼鳔，以1:45加入蒸馏水，后加入1.5%的胃蛋白酶，在温度为37℃下酶解24h，加入终浓度为19mmol/l的edta灭酶，得酶解液，该条件下胶原蛋白的溶出率高，且可保持胶原蛋白的超螺旋结构，保持其生物活性，所得到的胶原蛋白为i型胶原蛋白，应用范围广，且酶解过程试剂用量少，可有效降低提取成本，为最佳酶解条件；4）纯化：取酶解液，在3900r/min下离心31min，过滤，持续搅拌下加入nacl固体至nacl浓度为0.58mol/l，静置，在4000r/min下离心29min，弃上清液，重复操作1次，过滤取沉淀，加入8倍体积的0.39mol/l的醋酸溶液浸泡17h，在3950r/min下离心30min，取沉淀，分别用0.09mol/l醋酸和蒸馏水透析1.9h，透析2次，得纯化胶原蛋白；5）去雌激素：利用以磁性沸石咪唑酯骨架结构材料为基底，结合纳米级硅酸锆合成的一种高效的zimsi涂层进行自动化固相微萃取微量的激素，将胶原蛋白用超声波处理11min，在12℃下利用zimsi涂层洗脱30min，得去雌激素胶原蛋白；6）冷冻干燥：取去雌激素胶原蛋白，在冷冻干燥温度-30℃，压强3pa，冷冻干燥时间8h，得胶原蛋白，提取所得的日本黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白结构完整，生物活性高，具有优良的粘着力和热稳定性，且其抗拉伸强度和抗降解能力高，在食品或保健品或生物材料或化妆品方面均具有较大的使用前景。本实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，在此不作详细叙述。实施例2：一种日本黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白的提取方法，其提取步骤为：取解冻鱼鳔20g，剪碎，加入0.42mol/l的na2co3溶液，在温度6℃，超声波脉冲为下进行0.9h的去杂蛋白处理；取去杂蛋白后的鱼鳔，以料液比为1:4.2，加入0.51mol/l的naoh溶液浸泡6h，水洗至中性，加入无水乙醚与亚苄基丙酮的混合液浸泡3.6h，混合液中无水乙醚、亚苄基丙酮和水的依次重量比为1:0.15:5.8，水洗至中性，得脱脂鱼鳔；取脱脂后的鱼鳔，以1:45加入蒸馏水，后加入1.65%的胃蛋白酶，在温度为36℃下酶解24h，加入终浓度为18mmol/l的edta灭酶，得酶解液；取酶解液，在3850r/min下离心30min，过滤，持续搅拌下加入nacl固体至nacl浓度为0.61mol/l，静置，在3900r/min下离心31min，弃上清液，重复操作2次，过滤取沉淀，加入8倍体积的0.41mol/l的醋酸溶液浸泡16h，在4000r/min下离心28min，取沉淀，分别用0.1mol/l醋酸和蒸馏水透析2.1h，透析2次，得纯化胶原蛋白；利用以磁性沸石咪唑酯骨架结构材料为基底，结合纳米级硅酸锆合成的一种高效的zimsi涂层进行自动化固相微萃取微量的激素，将胶原蛋白用超声波处理13min，在11℃下利用zimsi涂层洗脱33min，得去雌激素胶原蛋白；取去雌激素胶原蛋白，在冷冻干燥温度-28℃，压强8pa，冷冻干燥时间11h，得胶原蛋白。本实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，在此不作详细叙述。实施例3：一种日本黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白的提取方法，其提取步骤为：取解冻鱼鳔20g，剪碎，加入0.46mol/l的na2co3溶液，在温度7℃，超声波脉冲为下进行0.88h的去杂蛋白处理；取去杂蛋白后的鱼鳔，以料液比为1:4.2，加入0.41mol/l的naoh溶液浸泡6.5h，水洗至中性，加入无水乙醚与亚苄基丙酮的混合液浸泡3.9h，混合液中无水乙醚、亚苄基丙酮和水的依次重量比为1:0.17:5.5，水洗至中性，得脱脂鱼鳔；取脱脂后的鱼鳔，以1:45加入蒸馏水，后加入1.6%的胃蛋白酶，在温度为35℃下酶解24.7h，加入终浓度为20mmol/l的edta灭酶，得酶解液；取酶解液，在3880r/min下离心29.5min，过滤，持续搅拌下加入nacl固体至nacl浓度为0.63mol/l，静置，在4010r/min下离心31min，弃上清液，重复操作1次，过滤取沉淀，加入8.4倍体积的0.44mol/l的醋酸溶液浸泡17h，在3960r/min下离心30min，取沉淀，分别用0.11mol/l醋酸和蒸馏水透析2.1h，透析3次，得纯化胶原蛋白；利用以磁性沸石咪唑酯骨架结构材料为基底，结合纳米级硅酸锆合成的一种高效的zimsi涂层进行自动化固相微萃取微量的激素，将胶原蛋白用超声波处理13min，在13℃下利用zimsi涂层洗脱34min，得去雌激素胶原蛋白；取去雌激素胶原蛋白，在冷冻干燥温度-23℃，压强7.6pa，冷冻干燥时间12h，得胶原蛋白。实验部分：1.绘制标准曲线：准确吸取羟脯氨酸标准工作液，分别加入柠檬酸缓冲液和氯胺t溶液，室温氧化后，加入高氯酸，最后加入对二甲基氨基苯甲醛显色试剂，在65℃水浴显色，冷却后在560nm波长处测吸光度(蒸馏水为空白对照)，以羟脯氨酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，拟合回归方程，实验所用分光光度计购于上海精密科学仪器有限公司。2.样品中羟脯氨酸含量测定：取2g实施例所用的解冻鱼鳔，按上诉方法处理后，测定吸光度并计算羟脯氨酸的含量，鱼鳔样品中羟脯氨酸含量可由以下公式计算：式中，为样品中羟脯氨酸含量（%），h为标准曲线上对应的羟脯氨酸质量浓度（μg/ml），m为测定羟脯氨酸含量时鱼鳔样品质量（g）3.取实施例1~3所提取的胶原蛋白与现有提取技术（中国发明授权专利文献：“具有高抗疲劳活性的梅鱼鱼鳔胶原蛋白的制备工艺”）进行提取率比较，胶原蛋白提取率计算公式如下：式中，w2为胶原蛋白提取率（%），为提取得到胶原蛋白干燥成品质量（g），为提取时鱼鳔样品质量（g），为样品中羟脯氨酸含量（%），11.1为羟脯氨酸与胶原蛋白含量系数所得胶原蛋白提取率如下表：实验组别实施例1实施例2实施例3现有提取技术提取率（%）80.3669.5474.8163.96由上述表格所得，本发明的胶原蛋白提取率优于现有技术的提取率，故本发明提取方法具有较大的应用前景。本实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，在此不作详细叙述。本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明作举例说明。本发明所属
技术领域：
的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的或者超越所附权利要求书所定义的范围。当前第1页12