一种用于制备内胚层细胞系的培养体系以及制备内胚层细胞系的方法与流程
本发明涉及一种通过化学小分子和生长因子诱导改变细胞命运的重编程制备内胚层细胞系的培养体系以及利用该培养体系制备内胚层细胞系的方法、试剂盒和用途。
背景技术：
所有生物体都依靠转录机制表达基因组的特定部分来应对环境或发育信号的改变，以此执行生命周期中的关键生物功能。因此，转录过程构成了一个调节生物过程的关键步骤，而且转录因子被认为是决定细胞命运的主开关。近十年来，干细胞生物学的迅速发展主要得益于若干转录因子功能的阐明，转录因子是诱导多功能干细胞(ipsc，inducedpluripotentstemcell)多能性的主要调节者。2006年，日本京都大学教授山中伸弥实验室首次宣布在小鼠的成纤维细胞中导入4个转录因子(oct4、sox2、c-myc和klf4)成功地将小鼠的成纤维细胞诱导重编程为全能性干细胞，得到的干细胞的性质和胚胎干细胞类似。2007年山中伸弥和俞君英两个研究小组分别成功地将人的体细胞重编程为ipsc，前者应用逆转录病毒将oct3/4,sox2,c-myc,klf4转导入人的表皮成纤维细胞，后者则是应用慢病毒将oct3/4,sox2,nanog,lin28导入包皮细胞。此外，众多研究机构利用不同的转录因子将成纤维细胞成功的直接转化为神经细胞(ambasudhanetal.,2011,directreprogrammingofadulthumanfibroblaststofunctionalneuronsunderdefinedconditions.cellstemcell9,113-118；caiazzoetal.,2011,directgenerationoffunctionaldopaminergicneuronsfrommouseandhumanfibroblasts.nature476,224-227；pangetal.,2011,inductionofhumanneuronalcellsbydefinedtranscriptionfactors.nature476,220-223；vierbuchenetal.,2010,directconversionoffibroblaststofunctionalneuronsbydefinedfactors.nature463,1035-1041)、肝细胞(duetal.,2014,humanhepatocyteswithdrugmetabolicfunctioninducedfromfibroblastsbylineagereprogramming.cellstemcell14,394-403；huangetal.,2011,inductionoffunctionalhepatocyte-likecellsfrommousefibroblastsbydefinedfactors.nature475,386-389；sekiyaandsuzuki,2011,directconversionofmousefibroblaststohepatocyte-likecellsbydefinedfactors.nature475,390-393)、心肌细胞(iedaetal.,2010,directreprogrammingoffibroblastsintofunctionalcardiomyocytesbydefinedfactors.cell142,375-386)和造血细胞(szaboetal.,2010,directconversionofhumanfibroblaststomultilineagebloodprogenitors.nature468,521-526)。
然而，虽然以转录因子为基础的改变细胞命运的重编程的研究进展对再生医学和生命科学的研究有着重要的意义，但是通过逆转录病毒整合到体细胞的基因组中从而过表达外源转录因子存在潜在的安全问题，例如原癌基因c-myc的使用导致肿瘤的形成(nakagawaetal.,2007)，阻碍了该技术在临床上的应用(hawley,2008,doesretroviralinsertionalmutagenesisplayaroleinthegenerationofinducedpluripotentstemcells？moleculartherapy:thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy16,1354-1355；listeretal.,2011,hotspotsofaberrantepigenomicreprogramminginhumaninducedpluripotentstemcells.nature471,68-73；mikkelsenetal.,2008,dissectingdirectreprogrammingthroughintegrativegenomicanalysis.nature454,49-55；ohietal.,2011,incompletednamethylationunderliesatranscriptionalmemoryofsomaticcellsinhumanipscells.naturecellbiology13,541-549；okitaetal.,2007,generationofgermline-competentinducedpluripotentstemcells.nature448,313-317)。因此，众研究组致力于开发替代方法其提高其安全性，其中包括利用游离基因为传递系统，并不引入外源因子的重编程细胞的方法(chengetal.,2012,lowincidenceofdnasequencevariationinhumaninducedpluripotentstemcellsgeneratedbynonintegratingplasmidexpression.cellstemcell10,337-344；okitaetal.,2011,amoreefficientmethodtogenerateintegration-freehumanipscells.naturemethods8,409-412；yuetal.,2009,humaninducedpluripotentstemcellsfreeofvectorandtransgenesequences.science324,797-801)。由于oct4、sox2、c-myc和klf4调控着具体的信号通路，因此采用化学小分子调节剂的组合重编程体细胞也是近年来的前沿方向。
2013年和2015年，相关研究报道了小鼠体细胞在化学小分子的诱导下转化为多功能干细胞(houetal.,2013,pluripotentstemcellsinducedfrommousesomaticcellsbysmall-moleculecompounds.science341,651-654；zhaoetal.,2015,axen-likestatebridgessomaticcellstopluripotencyduringchemicalreprogramming.cell163,1678-1691)，与此同时，不同的研究组陆续报道了利用小分子鸡尾酒化学诱导法将小鼠胚胎成纤维细胞转化为心肌细胞(fuetal.,2015,directreprogrammingofmousefibroblastsintocardiomyocyteswithchemicalcocktails.cellresearch25,1013-1024)，将人体成纤维细胞或星形胶质细胞转化为神经细胞(huetal.,2015,directconversionofnormalandalzheimer'sdiseasehumanfibroblastsintoneuronalcellsbysmallmolecules.cellstemcell17,204-212)。小分子化合物本身存在着相对稳定，细胞包容度好，性价比高，无免疫原性，结构来源丰富，并且非常易于操作及标准化等一系列特点，使其在应用中具有巨大的优势。小分子鸡尾酒化学诱导法突破了经典重编程对转录因子的依赖，在改变细胞命运的重编程方面有重要的应用前景，是未来临床应用的重要方向之一。
内胚层细胞系在细胞替代治疗方面具有发展潜力。通过顺序暴露体细胞于模拟胚胎形态发生的化学小分子细胞抑制剂、激活剂以及生长因子可以在体外产生发育期间形成的内胚层细胞系、内胚层祖细胞及其衍生谱系。
技术实现要素：
一方面，本发明提供用于制备内胚层细胞系的培养体系，其包括包含tgf-β受体抑制剂、ra受体激活剂和camp激活剂的组合物，其中，所述组合物不包含外源转录因子。所述组合物还包含转化生长因子β、碱性成纤维细胞生长因子、gsk3抑制剂、roh/rock通道抑制剂中的至少一种。其中，所述tgf-β受体抑制剂选自：repsox(e-616452),bmp4，sb431542,a8301,gw788388,sd208,sb525334,ly364947,d4476,sb505124，gw6604，su5416,cat-152，cat-192，sb431542，sd-208，sm16，npc-30345，ki26894，sb-203580，sd-093和gleevec；所述gsk3抑制剂选自：chir99021，chir98014，td114-2，bio,kenpaullone,tws119,cbm1078,sb216763,3f8(tocris),ar-a014418,fratide,indirubin-3’monoxime,l803,ct99021,ct20026和sb415286；所述roh/rock通道抑制剂选自：y-27632和法舒地尔；所述ra受体激活剂选自：ttnpb，ch55，retinol，am580，atra，13-cis-ra和retinoic；所述camp激活剂选自：forskolin(fsk)，fsh，米力农(milrinone)，西洛酰胺(cilostamide)，咯利普兰(rolipram)，dbcamp，8-br-camp，ibmx，pge2，nkh477和sp-8-br-camps。所述转化生长因子β选自：激活素a。并且，所述培养体系还可包括基础培养基，其可选自：n2b27改良培养基、hcm培养基和dmem培养基。所述外源转录因子例如，但不仅限于sox17。
在本发明的一种实施方式中，所述培养体系包括：0.1-50ng/ml的bmp4、0.1-20μm的repsox、0.1-50μm的forskolin、0.1-5μm的ttnpb、0.1-20μm的chir99021、0.1-20μm的y27632，0.1-50ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子和/或1-200ng/ml的激活素a。并且，该培养体系还可包括作为基础培养基的n2b27改良培养基。
另一方面，本发明提供一种通过化学诱导制备内胚层细胞系的方法，所述方法包括使体细胞在包含第一组合物的培养基中培养，从而使所述体细胞发生改变细胞命运的重编程，产生内胚层细胞系，其中：所述第一组合物包含：tgf-β受体抑制剂、ra受体激活剂和camp激活剂，但不包含外源转录因子。优选地，所述第一组合物还包含碱性成纤维细胞生长因子、gsk3抑制剂、roh/rock通道抑制剂中的至少一种。
在本发明的优选实施方式中，本发明的通过化学诱导制备内胚层细胞系的方法包括使体细胞在包含第一组合物的培养基中培养，随后使得到的细胞产物在包含第二组合物的培养基中培养，其中：所述第一组合物包含：tgf-β受体抑制剂、ra受体激活剂和camp激活剂，碱性成纤维细胞生长因子、gsk3抑制剂和roh/rock通道抑制剂；所述第二组合物包含：tgf-β受体抑制剂、碱性成纤维细胞生长因子、gsk3抑制剂、roh/rock通道抑制剂、camp激活剂的组合物和转化生长因子β。
在本发明的更为优选的实施方式中，所述第一组合物包含：0.1-50ng/ml的bmp4、0.1-20μm的repsox、0.1-50μm的forskolin、0.1-5μm的ttnpb、0.1-20μm的chir99021、0.1-20μm的y27632和/或0.1-50ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子；所述第二组合物包含：0.1-50ng/ml的bmp4、0.1-20μm的repsox、0.1-50μm的forskolin、10-20μm的chir99021、0.1-20μm的y27632、0.1-50ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子和/或1-200ng/ml的激活素a。所述内胚层细胞系为内胚层祖细胞。所述第一组合物和所述第二组合物均不包含外源转录因子，所述外源转录因子例如，但不仅限于sox17。
在本发明的最优选的实施方式中，在包含基础培养基n2b27和第一组合物的培养基中培养体细胞4天，随后将由此得到的细胞产物在包含基础培养基n2b27和第二组合物的培养基中培养4-14天，其中：所述第一组合物包含10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、10ng/ml的bmp4、5μm的repsox、3μm的chir99021、10μm的forskolin、1μm的ttnpb以及10μm的y27632；所述第二组合物包含10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、10ng/ml的bmp4、5μm的repsox、10μm的chir99021、10μm的forskolin、10μm的y27632和100ng/ml的激活素a。所述内胚层细胞系为内胚层祖细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述体细胞选自：小鼠体细胞和人体细胞，包括成纤维细胞、骨髓衍生的单核细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞、神经干细胞、肝细胞、角质细胞、口腔角质细胞、头发毛囊真皮细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞、滑膜细胞、肾细胞、皮肤上皮细胞或成细胞。
另一方面，本发明还提供一种通过本发明的上述制备内胚层细胞系的方法获得的化学诱导内胚层细胞系、内胚层祖细胞和肝细胞。
另一方面，本发明还提供一种本发明上述促进内胚层细胞系形成的组合物在制备诱导内胚层细胞系、内胚层祖细胞和肝细胞中的应用。
另一方面，本发明还提供一种包含上述促进内胚层细胞系形成的组合物的试剂盒。
附图说明
图1a为用f2brfcyt化学诱导间质上皮转化过程(f2，fgf2(即，碱性成纤维细胞生长因子)；b，bmp4；r，repsox；f，forskolin；c，chir99021；y，y27632；t，ttnpb)。
图1b为化学诱导间质上皮转化过程中的细胞形态学变化，表明小鼠成纤维细胞在用f2brfcyt处理第4天和第8天由间质细胞转化为上皮细胞。
图1c显示了化学诱导间质上皮转化过程中的上皮基因和间质基因的qrt-pcr分析，表明间质基因cdh2、cd44、zeb2和vim得到了抑制(图1c下)，而上皮基因cdh1、epcam、oclddin和ck19开始表达(图1c上)。
图1d为化学诱导间质上皮转化12天后的免疫染色结果，表明经f2brfcyt诱导10天后的小鼠成纤维细胞表达上皮细胞的标志物e-cad和β-catenin。
图1e和1f分别显示了化学诱导间质上皮转化后内胚层标记物和多能性标记物的表达情况。表明经f2brfcyt诱导10天后的小鼠成纤维细胞表达中表达内胚层标记物sox17、gata4/6，但并没有表达多能性标记物。
图1g为sox17的免疫荧光染色实验结果，表明小鼠成纤维细胞不表达sox17，但经f2brfcyt诱导10天后表达内胚层标记物sox17。
图2a为小鼠成纤维细胞在只缺少一种小分子/生长因子培养基中诱导8天后的指定基因的qrt-pct分析结果。repsox对诱导sox17、foxa2、hnf4a、cdh1起重要作用；ttnpb和bmp4对诱导sox17起重要作用；foxa2、hnf4a和cdh1的诱导和chir99021、fsk、y27632、ttnpb、bmp4相关度低；ttnpb等小分子不利于foxa2、hnf4a和cdh1的诱导。
图2b为小鼠成纤维细胞在只缺少一种小分子/生长因子的培养基中的细胞生长曲线，表明fgf2和ttnpb在不同程度上促进了细胞增长。
图2c为小鼠成纤维细胞在不同浓度的小分子/生长因子的培养基中诱导后指定标记物的表达情况。
图2d为小鼠成纤维细胞在不同浓度的小分子/生长因子的培养基中诱导后指定标记物在不同时间的表达情况。
图3a显示了化学诱导内胚层祖细胞的优化过程：第1天到第4天使用低浓度的chir99021；第4天到第14天，使用高浓度的chir99021，并除去ttnbp，加入激活素a。
图3b和3c为所述图3a中的优化过程中指定表达物的表达，表明gata6先表达，而后出现gata4和epcam，在开始的14天内，cdh2没有任何变化；sox17迅速表达，而后foxa2、hnf4a和cdh1进行表达。
图3d为所述图3a中的优化过程中对指定表达物的westernblot分析，表明sox17早于cdh1表达。
图3e为经过所述图3a中优化过成中表达14天后的免疫荧光染色结果，表明了sox17，cdh1和β-catenin的大量表达。
图4a为化学诱导内胚层祖细胞经传代后第2代和第13代的细胞形态图，表明化学诱导内胚层祖细胞在传代过程中得以保持。
图4b为化学诱导内胚层祖细胞和小鼠成纤维细胞传代过程中的细胞生长曲线，表明化学诱导内胚层祖细胞可以持续传代至70天，细胞密度从初始5×105增长至1020，而对照组小鼠成纤维细胞只能持续增长5-10天，至第三十天仍维持同样的细胞密度。
图4c为化学诱导内胚层细胞在传代过程中不同代系之间转录谱的对比，表明其第1代和第22代之间维持着稳定的转录基因。
图4d为化学诱导内胚层祖细胞中e-cad、sox17、foxa2和hnf4a的免疫染色结果，表明在两组独立培养的化学诱导内胚层祖细胞中均表达了e-cad、sox17、foxa2和hnf4a。
图4e为小鼠成纤维细胞(55个)和化学诱导内胚层祖细胞(63个)的单细胞rna-seq数据，图上色盘表示基因表达程度，表明小鼠成纤维细胞表达纤维标记物thy1、dkk3、s100a4和中胚层标记bmp4，而化学诱导内胚层祖细胞表达内胚层标记物sox17、foxa2、gata4/6、hnf1b、sox7，肝/前肠标记物krt18、8、19和上皮标记物cdh1和epcam，并完全不表达多能性标记物，例如但不限于pou5f1(oct4)、nanog、sox2和essrb。
图4f为不同代的化学诱导内胚层祖细胞和小鼠成纤维细胞、肝细胞、肠细胞以及结肠细胞的基因对比，表明化学诱导内胚层祖细胞表达内皮标记物sox17、foxa2、gata4/6、sox7、hind1b和tead4，并大量表达肝脏/前肠标记物krt18、krt8、krt19。
图4g为不同代的小鼠成纤维细胞之间和化学诱导内胚层祖细胞之间的标记物表达量的分析，表明化学诱导内胚层祖细胞在不同代系对关键标记物sox17、foxa2、hnf4a和cdh1的进行稳定表达，但不表达肝脏标记物alb和afp。
图5a为化学诱导内胚层祖细胞分化为化学诱导肝细胞的示意图和各阶段的细胞形态，表明经特异化7-10天后细胞形态开始呈现扁平状肝细胞形态特征，经成熟10天后完全转化为肝细胞。
图5b显示了小鼠成纤维细胞、初代肝细胞、化学诱导肝细胞和化学诱导内胚层祖细胞的rna-seq数据热图，表明化学诱导肝细胞表达了初代肝细胞中的标记物。
图5c为针对肝细胞标记小鼠成纤维细胞、初代肝细胞、化学诱导肝细胞和化学诱导内胚层祖细胞的的qrt-pcr分析，表明afp，cyp3a13在化学诱导肝细胞中的表达量比初代肝细胞高；ck8、ck18、cyp2b10在化学诱导肝细胞中的表达量和初代肝细胞相当；alb、cyp311和cyp1a1在化学诱导肝细胞中的表达量相对初代肝细胞较低。
图5d为小鼠成纤维细胞和化学诱导肝细胞中针对肝细胞标记蛋白的免疫染色结果，表明化学诱导肝细胞表达标记物alb、afp、hnf4a、ck18、ck8和cdh1。
图5e为小鼠成纤维细胞和化学诱导肝细胞中的血清蛋白中的westernblot结果，表明化学诱导肝细胞中表达alb.
图5f为小鼠成纤维细胞、初代肝细胞、化学诱导肝细胞和化学诱导内胚层祖细胞的培养液中血清蛋白的elisa分析结果，表明化学诱导肝细胞中alb的表达量和初代肝细胞相当。
图5g为化学诱导肝细胞中的alb表达量的facs分析，表明化学诱导肝细胞表达大量的alb。
图5h显示了化学诱导肝细胞对zo-1和hnf4a/alb的表达。
图6a为化学诱导肝细胞和小鼠成纤维在ldl、icg和pas处理下的对比。
图6b和6c分别为小鼠肝脏损伤实验示意图和小鼠的存活率曲线，表明只有注入了化学诱导肝细胞和初代肝细胞的小鼠存活率。
图6d和6e显示了在cona肝损伤小鼠用初代肝细胞和化学诱导肝细胞处理前和处理后血浆中alt和ast的含量，表明化学诱导肝细胞和初代肝细胞均可降低血浆中alt和ast的含量。
图6f显示了显微镜下的肝脏结构，表明化学诱导肝细胞使小鼠肝脏免于进一步损伤。
图6g为经染色分子标记的化学诱导肝细胞在cona肝损伤小鼠体内随时间的分布情况，表明化学诱导肝细胞在小鼠体内状态良好。
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的科技术语的含义与本领域普通技术人员所理解的含义相同。
总体而言，本发明提供一种通过小分子化合物和生长因子化学诱导改变细胞命运的重编程以制备内胚层细胞系的方法以及该方法所用的促进内胚层细胞系形成的含有小分子化合物和生长因子的培养体系和试剂盒。
内胚层细胞系是一种瞬时状态细胞系，其快速分化、不能增殖、无明显的形态并且可不完全定向于内胚层命运。另一方面，内胚层祖细胞不是瞬时的、具有明显的形态并且可被无限地培养(chengetal.，2013)。内胚层细胞系的一个可靠标记物为sox17基因，内胚层祖细胞的特征还在于表达sox17、foxa2、gata4/6、hnf1b、sox7。内胚层祖细胞可产生内胚层谱系(例如肝、胰腺和肠)中的细胞，但不能体外或体内产生中胚层和外胚层。同样地，内胚层祖细胞在免疫缺陷小鼠中不形成畸胎瘤。因此，内胚层细胞系和内胚层祖细胞可代表不同的发育中间物并且可具有不同的发育潜能。
本发明中体细胞经小分子和生长因子的诱导在不引入外源转录因子的情况下进行改变细胞命运的重编程；化学诱导的内胚层系细胞表达标记物cdh1、epcam、oclddin、ck19、e-cad、β-catenin、sox17、gata4/6；化学诱导的内胚层祖细胞表达标记物sox17、foxa2、gata4/6、hnf1b、sox7、krt18、krt8、krt19、cdh1和epcam；内胚层细胞系和内胚层祖细胞均不表达多能型标记物pou5f1(oct4)、nanog、sox2和essrb。在matrigel、bmp4、vegf、fgf、egf2、激活素，以及任选的tgf-β存在下，在旋转或静态培养条件下，内胚层祖细胞扩增并维持标志物的表型表达。当被置于肝细胞谱系的培养条件下，化学诱导的内胚层祖细胞出现了肝细胞形态，并表达初代肝细胞的特征基因afp、cyp3a13、ck8、ck18、cyp2b10、alb、cyp311和cyp1a1，和初代肝细胞中的特征蛋白alb、zo-1、hnf4a/alb。
总之，本文提供了用小分子化合物和生长因子化学诱导体细胞有效产生内胚层细胞系的培养方法以及该方法所用的促进内胚层细胞系形成的含有小分子化合物和生长因子的培养体系和试剂盒。其中化学诱导的内胚层祖细胞保留其表型特征并且传代至少70天，置于肝分化培养基中的化学诱导内胚层祖细胞进一步分化为化学诱导的肝细胞。化学诱导肝细胞有用于治疗应用中的潜能。
1、定义
本文中使用的术语“重编程”或“重编程的”是指可将体细胞转化成内胚层细胞系和内胚层祖细胞。
“多能的”指细胞能够通过其后代产生成体动物中可见的数种不同细胞类型。“多潜能的”指细胞能够通过其后代产生构成成体动物的所有细胞类型，包括生殖细胞。胚胎干细胞、诱导多潜能干细胞和胚胎生殖细胞均属于多潜能细胞。
“分化”是指如下过程：通过该过程使较不特化的细胞变成更特化的细胞以形成至少一种新细胞类型的后代。“去分化”是指如下细胞过程：其中部分分化细胞或终末分化细胞回复至较早的发育阶段，例如多潜能性或多能性。“转分化”是将一种分化细胞类型转化成另一种分化细胞类型的过程。在某些条件下，具有新细胞类型的特征的后代的比例可以为至少约1％、5％、25％或更大。
本文中使用的术语“体细胞”可选自小鼠体细胞和人体细胞，优选地，所述小鼠体细胞和所述人体细胞选自：成纤维细胞、骨髓衍生的单核细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞、神经干细胞、肝细胞、角质细胞、口腔角质细胞、头发毛囊真皮细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞、滑膜细胞、肾细胞、皮肤上皮细胞或成骨细胞。
本文中使用的术语“分离的”是指以机械方式或化学方式分离细胞。分离的细胞的实例是发育中的细胞团、细胞培养物和细胞系。
表达活性的“抑制剂”或“激活剂”分别是指通过对靶蛋白(或编码多核苷酸)的表达或活性进行体外和体内检测所鉴定的抑制分子或活化分子，例如，配体、激动剂、拮抗剂、及其同系物和模拟物。抑制剂是指如下试剂：例如，抑制表达或结合，部分或全部阻断活化或蛋白酶抑制剂活性，降低，防止，延迟活化，失活，去稳定化，或下调所述靶蛋白活性的试剂，例如拮抗剂。激活剂是例如，诱导或活化所述靶蛋白表达或结合，刺激、增加、开放、活化、促进、增强活化或蛋白酶抑制剂活性，致敏或上调所述靶蛋白(或编码多核苷酸)的活性，例如，激动剂。所述关于抑制剂和激活剂的测定包括，例如，将特定的调节剂化合物应用到表达所述靶蛋白的细胞，然后确定对所述靶蛋白活性的功能性作用，如上所述。将用潜在的激活剂或抑制剂处理包括所述靶蛋白的样品或测定与无抑制剂或激活剂的对照样品进行比较，以检验作用程度。对照样品(未用调节剂处理)被赋予100％的相对活性值。当活性值相对于对照为约80％，50％，25％，10％，5％或1％时，实现所述靶蛋白的抑制。当活性值相对于对照为约110％，150％，200％,300％，400％，500％，或1000％-3000％或更高时，实现所述靶蛋白的活化。
2、参与内胚层细胞系形成的细胞
在本发明的制备内胚层细胞系的方法中使用的来自供体的细胞可为多种哺乳动物的细胞。合适的哺乳动物细胞的实例包括但不限于：成纤维细胞、骨髓衍生的单核细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞、神经干细胞、肝细胞、角质细胞、口腔角质细胞、头发毛囊真皮细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞、滑膜细胞、肾细胞、皮肤上皮细胞或成骨细胞。
来自供体的细胞还可为来源于不同类型的组织的细胞，所述组织例如，骨髓、皮肤(例如，真皮、上皮)、头皮组织、肌肉、脂肪组织、外周血、骨骼肌或平滑肌。细胞还可衍生自新生儿组织，包括但不限于：脐带组织(例如，脐带、脐带血、脐带血容器)、羊膜、胎盘或者其他不同的新生儿组织(例如，骨髓液、肌肉、脂肪组织、外周血、皮肤、骨骼肌，等等)。
来自供体的细胞优选地为人细胞，但是也可来自于非人类的哺乳动物的细胞。非人类的哺乳动物包括但不限于：非人类的灵长类动物(例如，猿、猴子、猩猩)、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠)、牛、猪、绵羊、马、狗、猫或兔子。
在本发明的一些实施方式中，可从患有各种不同的疾病的患者中收集细胞，或者，可从未患病的人体中收集细胞。在一些情况下，从患有如下疾病或处于患上如下疾病的风险中的人体中收集细胞，所述疾病例如，慢性病(例如，心血管疾病)、眼部疾病(例如，黄斑变性)、听力疾病(例如，失聪)、糖尿病、认知功能障碍、精神分裂症、抑郁症、躁郁症、痴呆、阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病、、多发性硬化、骨质疏松症、肝病、肾病、自体免疫性疾病、哮喘或增殖失调疾病(例如，癌症)。在一些情况下，可从患有如下疾病或处于患上如下疾病的风险中的人体中收集细胞，所述疾病例如，急性发生的疾病，例如，中风、脊髓损伤、烧伤、创伤，等等。
3、诱导内胚层细胞系的培养体系
本发明提供一种用于制备内胚层细胞系的培养体系，其包括包含tgf-β受体抑制剂、ra受体激活剂和camp激活剂的组合物，其中，所述组合物不包含外源转录因子。
在本发明的一些实施方式中，所述组合物还包括转化生长因子β、碱性成纤维细胞生长因子、gsk3抑制剂、roh/rock通道抑制剂中的至少一种。
所述内胚层细胞系优选为内胚层祖细胞，所述内胚层祖细胞可以进一步分化为肝细胞系。
本发明的培养体系中所包含的抑制剂、激活剂以及生长因子将在下文详细描述。
4、内胚层细胞系的诱导方法
本发明提供一种通过化学诱导制备内胚层细胞系的方法，所述方法包括使体细胞在包含第一组合物的培养基中培养，从而使所述体细胞发生改变细胞命运的重编程，产生内胚层细胞系。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括将体细胞与包含小分子化合物和生长因子的第一组合物相接触，随后再将所获得的细胞产物进一步与包含小分子化合物和生长因子的第二组合物相接触，所述内胚层细胞系优选为内胚层祖细胞。其中所述第一组合物包含：tgf-β受体抑制剂，camp激活剂和ra受体激活剂。在一些实施方式中，除上述三种组分外，第一组合物还可包含如下小分子化合物或生长因子的至少一种：(1)gsk3抑制剂，(2)碱性成纤维细胞生长因子；(3)roh/rock通道抑制剂。第二组合物包含：tgf-β受体抑制剂，gsk3抑制剂，camp激活剂，转化生长因子β和碱性成纤维细胞生长因子和roh/rock通道抑制剂。并且，所述第一组合物和所述第二组合物均不包含外源转录因子，例如，但不限于：sox17。
本发明的方法中所使用的抑制剂、激活剂以及生长因子将在下文详细描述。
5、抑制剂、激活剂和生长因子
本发明利用包含细胞信号传导的抑制剂和/或激活剂和生长因子的组合物实现了内胚层细胞系和内胚层祖细胞的诱导。本发明中所述的抑制剂、激活剂和生长因子的所有同种型和变体均包括在本发明中。
a、细胞信号传导抑制剂、激活剂。
在本发明的某些方面，在分化过程中，可在抑制参与信号转导级联的一种或更多种信号转导抑制剂存在下维持细胞。应当理解，在这些方面和实施方案中，可替换抑制相同信号转导途径中信号转导组分的其他信号转导抑制剂。这可包括抑制上游刺激。同样地，可将抑制剂替换为相关信号转导途径的其他抑制剂。
tgf-β受体抑制剂
tgf受体是丝氨酸/苏氨酸激酶受体。其信号传递可以通过smad信号通路和/或daxx信号通路，与细胞凋亡、细胞周期的调控、死细胞的发展以及分化等有密切关系。本文所述的“tgf-β受体抑制剂”能够抑制tgf-β信号通路并激发细胞特定功能分化，tgf-β受体抑制剂的实例包括，但不限于：repsox(e-616452),bmp4，sb431542,a8301,gw788388,sd208,sb525334,ly364947,d4476,sb505124，gw6604，su5416,cat-152，cat-192，sb431542，sd-208，sm16，npc-30345，ki26894，sb-203580，sd-093，gleevec。在一些实施方式中，tgf-β受体抑制剂的一个实例为alk5抑制剂，可以包括tgf-β受体的抗体、tgf-β受体的显性阴性变体和抑制tgfii受体(alk5)表达的反义核酸。虽然alk5抑制剂无意包括非特异性激酶抑制剂，但是应当理解的是，alk5抑制剂还包括抑制alk4和/或alk7的抑制剂，例如，sb-431542。alk5抑制剂被认为影响间充质到上皮的转变/转换(met)过程。tgfii激活素途径是上皮到间充质转换(emt)的驱动子。因此，抑制tgfii激活素途径可以促进met(即重编程)过程。
本发明中使用的tgf-β受体抑制剂优选为repsox和bmp4，repsox的浓度为0.1-20μm，优选为5-10μm，更优选为5μm；bmp4的浓度为0.1-50ng/ml，优选为5-20ng/ml,更优选为10ng/ml。
camp激活剂
腺苷酸环化酶(camp)是膜整合蛋白，能够将atp转变成camp，引起细胞的信号应答，是g蛋白偶联系统中的效应物。腺苷酸环化酶(camp)激活剂可以通过细胞激活腺苷酸环化酶，从而升高细胞内的camp水平。示例性的camp激活剂包括，但不限于：forskolin，fsh，米力农(milrinone)，西洛酰胺(cilostamide)，咯利普兰(rolipram)，dbcamp,8-br-camp，ibmx，pge2，nkh477，sp-8-br-camps。
本发明中使用的camp激活剂优选为forskolin，浓度为0.1-50μm，优选为2-20μm，更优选为10μm。
ra受体激活剂
维甲酸类化合物(retinoicacids，ra)在调控细胞生长、分化、凋亡等生命活动中起重要作用。其在体内的生理活性代谢产物包括全反式维甲酸(atra)、13-顺维甲酸(13-cis-ra)和9-顺维甲酸(9-cis-ra)，它们可通过核维甲酸受体(ra受体)结合于dna应答元件调节靶基因的转录。示例性的ra受体激活剂包括，但不限于：ttnpb，ch55，retinol，am580，atra，13-cis-ra，retinoic。
本发明中使用的ra受体激活剂优选为ttnpb，浓度为0.1-5μm，优选为0.5-2μm，更优选为1μm。
gsk3抑制剂
糖原合成酶激酶-3(gsk-3)普遍存在于哺乳动物真核细胞中，除去最早发现的调控糖原合成酶(gs)的活性外，gsk-3还能作用于众多信号蛋白、结构蛋白和转录因子，调节细胞的分化、增殖、存活和凋亡。gsk3抑制剂可以活化，例如，wnt/β-catenin途径。许多β-catenin下游基因共调节多能性基因网。例如，gsk抑制剂活化cmyc表达以及增强其蛋白稳定性和转录活性。因此，在一些实施方式中，gsk3抑制剂可以用于刺激细胞中内源性myc多肽表达，由此消除诱导多能性对myc表达的需要。gsk3的抑制剂包括与其结合的抗体、其显性失活的突变体和靶向gsk的sirna和反义寡核苷酸。gsk3抑制剂的实例包括，但不限于：chir99021,chir98014,td114-2,bio,kenpaullone,tws119,cbm1078,sb216763,3f8(tocris),ar-a014418,fratide,indirubin-3’-monoxime,l803,ct99021,ct20026,sb415286。
本发明中使用的gsk3抑制剂优选为chir99021，浓度为0.1-20μm，优选为2-10μm，更优选为10μm和3μm。
rho/rock通道抑制剂
本文使用的术语“rho/rock抑制剂”用来表示rockrho激酶的小分子抑制剂，包括，但不限于：y-27632或法舒地尔。
本发明中使用的rho/rock通道抑制剂优选为y-27632，浓度为0-20μm，优选为5-10μm，更优选为10μm。
b.生长因子
本发明举例说明的内胚层祖细胞促生长因子的非限制性实例包括，但不限于，生长因子，例如碱性成纤维细胞生长因子(fgf2或bfgf)、bmp4、egf、激活素a、tgf-β和vegf，或者其同种型或变体。
在本发明的一些实施方式中，一种或多种生长因子是碱性成纤维细胞生长因子，其是能促进中胚层和神经外胚层细胞分裂的多肽，具有强烈的血管生成作用。在体外，碱性成纤维细胞生长因子能刺激细胞增殖、迁移，诱导纤溶酶原激活物及胶原酶活性，其是与肝素具有高亲和力的细胞促分裂原。本发明中使用的生长因子优选为碱性成纤维细胞生长因子，其浓度为0.1-50ng/ml，优选为0.1-20ng/ml，更优选为10ng/ml。
在本发明的一些实施方式中，一种或多种生长因子是转化生长因子β是一种多功能蛋白质，可以影响多种细胞的生长、分化、细胞凋亡及免疫调节等功能，转化生长因子β包括三个亚型：转化生长因子β1，转化生长因子β2和转化生长因子β3。转化生长因子β可以与细胞表面的tgf-β受体结合而激活其受体。本发明中的转化生长因子β优选为激活素a，浓度为1-200ng/ml，优选的浓度为50-150ng/ml，更优选为100ng/ml。
6、内胚层细胞系和内胚层祖细胞的特征
内胚层细胞系是一种瞬时状态细胞系，其快速分化、不能增殖、无明显的形态并且可不完全定向于内胚层命运。另一方面，内胚层祖细胞不是瞬时的、具有明显的形态并且可被无限地培养。内胚层祖细胞可产生内胚层谱系(例如肝、胰腺和肠)中的细胞，但不能在体外或体内产生中胚层或外胚层。同样地，内胚层祖细胞在免疫缺陷小鼠中不形成畸胎瘤。因此，内胚层细胞系和内胚层祖细胞可代表不同的发育中间物并且可具有不同的发育潜能。可根据多个表型标准对细胞进行表征。所述标准包括但不限于对所表达细胞标志物的检测或量化、酶活性以及对形态特征和细胞内信号转导的表征。
在本发明的一些实施方式中，内胚层细胞具有天然内胚层细胞的特征性形态特征。所述特征性形态特征是本领域技术人员在评价内胚层细胞时通常理解的特征并且包括圈样(doughnut-like)形态(当在2d培养物中培养时)。单个细胞中存在的一个或多个这样的特征与作为内胚层细胞谱系成员的细胞一致。对于细胞是否具有内胚层细胞的特征性形态特征，可如下进行确定：加密分化的后代细胞、成体或胎儿内胚层细胞以及一种或多种阴性对照细胞(例如成纤维细胞或rpe(视网膜色素上皮细胞)的显微图，然后以盲法方式评价这些显微图并破译密码以确定是否精确地鉴定了来自分化的内胚层细胞。
本发明的细胞还可根据其是否表达内胚层谱系的特征性表型标记物来进行表征。本文中使用的“表达”指材料或物质的产生以及材料或物质的产生水平或产生量。因此，确定特异性标志物的表达是指检测所表达的标志物的相对量或绝对量，或者简单地检测标志物是否存在。
本文中使用的"标志物"指可观察到或检测到的任何分子。例如，标志物可包括，但不限于，核酸(例如特异性基因的转录本)、基因的多肽产物、非基因产物多肽、糖蛋白、碳水化合物、糖脂、脂质、脂蛋白或小分子。
标志物的存在、不存在和/或表达水平可通过实时定量pcr(qrt-pcr)来确定(美国专利no.5,843,780)。本发明所列举的特定标志物的序列数据可从公开数据库(例如genbank)获得。如果根据典型对照实验中的标准操作,在标准时间窗口内对细胞样品进行测定，样品产生明确可辨别的杂交带或扩增产物，则认为在本发明的测定mrna的方法中，所测定的目标mrna是"可检测的"。除非另有说明，否则如果通过qrt-pcr可检测到相应的mrna，则指示特定标志物的表达。如果所检测到的mrna水平高于对照细胞(例如，未分化多潜能干细胞、成纤维细胞或其他不相关细胞类型)的mrna水平至少2倍，并且优选10倍或50倍以上，则认为在蛋白质或mrna水平检测的内胚层祖细胞或肝细胞标志物的表达是阳性的。例如，通过qrt-pcr来确定由某些遗传标志物产生的转录本的量，所述标志物例如sox17，gata4，gata6，bmp4，foxa2、hnf1b、sox7等。
本发明中sox17是内胚层细胞谱系中的一个可靠标记物，以下列出了本发明中用于区分所述细胞谱系中的主要标记物：
内胚层标记物：sox17，gata4，gata6；
中胚层标记物：bmp4；
内胚层祖细胞标记物：sox17、foxa2、gata4/6、hnf1b、sox7；
纤维细胞系标记物：thy1、dkk3、s100a4；
上皮标记物：cdh1、epcam、oclddin、ck19；
间质标记物：cdh2、cd44、zeb2、vim；
多能性标记物：pou5f1(oct4)、nanog、sox2、essrb；
肝/前肠标记物：krt18、krt8、krt19；
肝标记物：afp、cyp3a13、ck8、ck18、cyp2b10、alb、cyp311和cyp1a1、hnf4a、zo-1。
可用于区分细胞谱系的标记物包括，但不仅限于以上所述。
本发明列举的内胚层祖蛋白决定簇可使用任何合适的免疫学技术来检测，例如针对细胞表面标志物的流式免疫细胞化学、针对细胞内或细胞表面标志物的免疫组织化学(例如，对固定细胞或组织切片进行免疫组织化学)、细胞提取物的免疫印迹分析(westernblot)以及针对分泌到培养基中的细胞提取物或产物的酶联免疫测定(elisa)。任选地固定细胞并且任选地使用经标记的二抗或其他缀合物(例如生物素-抗生物素蛋白缀合物)以放大标记之后，如果在标准免疫细胞化学或流式细胞术测定中显著可检测量的抗体与抗原结合，则细胞表达的抗原被认为是"抗体可检测的"。
其他的物理和生物化学方法也可用于鉴定或定量本发明的报告基因的表达。这些方法包括但不限于：(1)southernblot分析或pcr扩增，以检测并确定重组dna插入子的结构；(2)酶测定法，以检测酶活性(当报告基因产物由基因构建体编码时)；以及(3)由于所转染的基因构建体表达而产生的化合物的生物化学测定。另外的技术，例如原位杂交、酶染色和免疫染色也可用于检测特定细胞中报告基因的存在或表达。
可通过对细胞的生物学功能进行测定，而对内胚层祖细胞进行测试。例如，可将所述细胞移植到小鼠胚胎的内胚层区室中以测试所移植的细胞与内源性内胚层相互作用的能力。
本领域技术人员将会理解的是：培养内胚层祖细胞的一个优势是所述细胞可在同源的未分化细胞群中生长。因而，其产生的下游谱系细胞可提高更特化的细胞类型的分化效率。这也降低了其他类型的细胞(例如来自其他胚层的那些细胞类型)的污染，进一步避免了其他细胞与所培养的内胚层祖细胞不一致的分化潜能。如通过免疫染色或其他本领域已知的合适的技术所确定的，如果内胚层细胞携带少于0.1％(优选少于100ppm或l0ppm)的不期望的细胞类型的标志物或其他特征，则说明本发明的内胚层细胞可被表征为基本不含污染细胞类型。此外，内胚层细胞可不含或者基本不含间充质细胞或造血细胞。
在本发明的一些实施方式中提供的细胞可具有从原始来源获得的细胞的多个特征。特定细胞中存在越多这些特征，其越可被表征为内胚层祖细胞谱系细胞。在本发明的一些优选实施方式中，提供的细胞具有这些特征中至少2、3、5、7或9个特征。
7、细胞培养
内胚层细胞系的培养
在根据本发明的方法制备诱导内胚层细胞系的过程中，在培养细胞的过程中使诱导细胞重编程的因子和选择标志物进行表达，随后根据上述内胚层细胞生物学特征和表观遗传性特征对所得到的细胞进行筛选。在一些实施方式中，细胞在一种培养基中培养。在一些实施方式中，在不同的时间段使用不同的细胞培养基。例如，在诱导之前使用一种类型的培养基，而在诱导过程中使用另一类型的培养基。有时在选择细胞的过程中使用第三种类型的培养基。
在从供体样本(例如，组织样本或细胞样本)中收集细胞之后，根据不同的细胞类型或组织类型使用合适的培养基。一些代表性的培养基包括但不限于：n2b27改良培养基、hcm培养基、dmem培养基、tesr、essential8培养基、bme、bgjb、cmrl1066、glasgowmem、改进的memzincoptionumdm、培养基199(medium199)、eaglemem、amem、dmem、ham、rpmi1640和fischer。但所述培养基并不特别限于此，只要其可用于培养动物细胞即可。
本发明的培养基还可包含脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化物质、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂和无机盐。其中小分子细胞抑制剂、激活剂的种类包括，但不仅限于tgf-β受体抑制剂，gsk3抑制剂，camp激活剂，ra受体激活剂、rho/rock通道抑制剂。生长因子包括，但不仅限于bfgf、bmp4、egf、激活素a、tgfβ、vegf、b27、tgfβ、oms、dapt、dex、a83-01和hgf。
在本发明的优选实施方式中，用于诱导内胚层细胞系、内胚层祖细胞和肝细胞的培养基主要包括如下几种：
(1)诱导内胚层细胞系的n2b27改良培养基1：n2b27+bfgf(10ng/ml,peprotech)+bmp4(10ng/ml，r&dsystem)+repsox(5μm，sigma)+chir(3μm，sigma)+fsk(3μm，selleck)+ttnpb(1μm，selleck)+y27632(10μm，selleck)。
(2)诱导内胚层细胞系的n2b27改良培养基2：n2b27+bfgf(10ng/ml,peprotech)+bmp4(10ng/ml，r&dsystem)+repsox(5μm，sigma)+chir(10μm，sigma)+fsk(3μm，selleck)+y27632(10μm，selleck)+activina(100ng/ml)
(3)诱导内胚层祖细胞的n2b27+hcm培养基：n2b27+bfgf(10ng/ml,peprotech)+bmp4(10ng/ml，r&dsystem)+repsox(5μm，sigma)+chir(10μm，sigma)+fsk(3μm，selleck)+y27632(10μm，selleck)+activina(100ng/ml)+hcm
(4)诱导肝细胞的dmem培养基：dmem+n2+b27+bfgf(20ng/ml)+bmp4(20ng/ml)
(5)诱导肝细胞的hcm培养基：hcm+osm(20ng/ml)、dapt(10μm,selleck)、dex(0.1μm,selleck)、a83-01(0.5μm,stemrd)、hgf(25ng/ml)。
用于培养本发明的细胞的培养容器可包括，但不特别限于：瓶、组织培养瓶、皿、培养皿、组织培养皿、多皿、微板、微孔板、多板、多孔板、微载玻片、腔室载玻片、管、盘、
培养容器可以是细胞粘附型的或非粘附型的，并且可根据目的来选择。细胞粘附型培养容器可包被有用于细胞粘附的任何底物(例如胞外基质(ecm))以改善容器表面对细胞的粘附性。用于细胞粘附的底物可以是附着干细胞或饲养细胞(如果使用的话)的任何物质。用于细胞粘附的底物包括胶原蛋白、明胶、聚-l-赖氨酸、聚-d-赖氨酸、玻连蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、pl0层粘连蛋白、纤维蛋白、凝血酶，和retronectin及其混合物，例如matrigeltm，以及经裂解的细胞膜制备物(klimanskaya等，2005)。
可适当地限定其他培养条件。例如，培养温度可以为约30℃至40℃，例如，至少或约31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃，但不特别限于这些。
细胞传代
本发明的方法的某些方面还可涉及解离细胞的步骤。可使用任何已知的程序来进行细胞解离。这些程序包括用螯合剂、酶(例如胰蛋白酶、胶原酶)处理等以及诸如机械解离(例如用移液管抽打)的操作。可在解离之前和/或之后，用rock抑制剂或肌球蛋白ii抑制剂处理细胞。例如，可仅在解离之后对细胞进行处理。
在细胞培养的另一些实施方式中，一旦培养容器是满的，就可通过适于解离的任何方法将集落分成聚集的细胞或者甚至单个细胞，然后将细胞置于用于进行传代的新培养容器中。细胞传代是能够使细胞保持存活并在培养条件下长期生长的技术。通常在细胞大约70％至100％汇合时，对其进行传代。
8、内胚层祖细胞和分化细胞的应用
根据本发明所述的方法，使用本发明的培养体系制备的内胚层细胞系或者内胚层祖细胞系及其分化的细胞可以应用于各种商业上重要的研究、诊断以及治疗的目的。
例如，分化的内胚层祖细胞可以用于制备分化的表型特异的抗体和cdna文库。下列参考文献对在抗体的生产、纯化和修饰以及其在免疫分析和免疫分离方法的应用中所使用的常规技术进行了描述：handbookofexperimentalimmunology(weir&biackwell,eds.)；currentprotocolsinimmunology(coliganetal"eds.)methodsofimmunologicalanalysis(masseyeffetal.,eds.,weinheim:vchverlagsgmbh)。下列参考文献对涉及mrna和cdna文库制备的常规技术进行了描述：rnamethodologies:alaboratoryguideforisolationandcharacterization(r.e.farrell,academicpress,1998)；cdnalibraryprotocols(cowell&austin,eds.,humanapress)和functionalgenomics(hunt&livesey,eds.,2000)。相对均质的细胞群，根据本发明所述的方法，使用本发明的培养体系制备的内胚层细胞系或者内胚层祖细胞系尤其适用于药物筛选和治疗应用。
在下文或者本文其它地方将对内胚层祖细胞以及其进一步分化得到的内胚层分化细胞的上述应用以及其它应用进行进一步详细的描述。所述内胚层祖细胞系和分化的细胞尤其可以用于制备治疗疾病的药用组合物。上述疾病可以包括通过再生疗法治疗的疾病，包括心力衰竭、骨髓疾病、皮肤病、烧伤、退行性疾病例如糖尿病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等等以及癌症。
优选的，根据本发明所述的方法，使用本发明所述的培养体系制备的内胚层祖细胞系以及内胚层分化细胞也可以用于患者的组织重建或者再生。所述细胞以允许其移植到预期的组织位点以及重建或者再生功能缺失区域的方式来施用。利用本发明的方法制备的肝细胞和肝祖细胞可以用于修复肝损伤。作为修复肝损伤的一个实例是修复通过尾部注射cona引起损伤，通过对肝细胞进行标记的免疫组化染色和显微切片观察来鉴定肝修复后的生长组织中是否有小管结构形成并且检测肝特异性蛋白合成的能力来确定修复治疗的有效性。肝细胞可以直接施用于患者用于治疗或者作为急性肝衰竭的患者在其肝组织再生时提供部分肝功能的生物辅助装置。
9、试剂盒
本发明还提供一种包含促进内胚层细胞系形成的组合物的试剂盒，该试剂盒还包括包装和/或本发明的组合物的使用说明。该试剂盒中还包括使用本发明的组合物培养内胚层细胞系所需的培养平板、培养基(例如，n2b27培养基、hcm培养基等)以及小分子诱导剂(例如tgf-beta受体抑制剂，gsk3抑制剂，camp激活剂，ra受体激活剂、roh/rock通道抑制剂)和生长因子诱导剂(例如，成纤维细胞生长因子(fgf)-2、tgb-beta、bmf-4)等。该试剂盒还可包括从供体收集细胞样本或组织样本的工具、保存所述细胞样本或组织样本的培养瓶、以及内胚层祖细胞进行进一步分化所用的培养基等。所述试剂盒中的说明书可向使用者提供关于组合物的使用及其相关信息。该说明书可为任何合适的形式，包括，但不限于，印刷物、录像带、电脑可读盘或光盘。
实施例
以下通过实施例进一步举例说明本发明。本领域的普通技术人员可以理解本发明并不限于所述实施例，并且本领域的普通技术人员可以基于说明书的教导对实施例进行修改。这些修改同样包含在本发明由后附的权利要求所定义的本发明的范围内。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
1、小鼠成纤维细胞的培养和保存。
小鼠成纤维细胞来自于13.5dpc胚胎，该胚胎取自携带oct-fgp转基因等位基因的公鼠(cba/caj×c57bl/6j)和129sv/jae的母鼠。所述细胞的保存条件为：dmem，10％fbs，glutamax和neaa。
2、内胚层细胞系的诱导和鉴定。
图1a示例性地显示了化学诱导间质上皮转化过程。将小鼠成纤维细胞在含有包含小分子和生长因子的组合物(f2brfcyt)的培养基中进行培养，其中所述组合物包含：repsox(0.1-20μm)、bmp4(0.1-50ng/ml)、碱性成纤维细胞生长因子(0.1-50ng/ml)、chir99021(0.1-20μm)、y27632(0.1-20μm)、foskolin(0.1-50μm)和ttnpb(0.1-5μm)，第4天和第8天后，细胞形态表明间质细胞向上皮细胞的转化(如图1b所示)。qrt-pcr表明间质基因cdh2、cd44、zeb2和vim得到了抑制(如图1c下图所示)，而上皮基因cdh1、epcam、oclddin和ck19开始过表达(如图1c上图所示)，从分子层面上确定了间质细胞向上皮细胞转化的过程。免疫染色表明接种后十天细胞系中的出现了上皮标记物e-cad和β-catenin(图1d)。rnaseq实验表明化学诱导的上皮细胞(cielc)中表达内胚层标记物sox17、gata4/6(图1e)，但并没有表达多功能标记物(图1f)。免疫印迹和荧光实验也表明了sox17的表达(图1g)。以上结果可证明cielc属于内胚层细胞系。
3、小分子和生长因子组合物的优化
如图2a、2b所示，通过如下方法建立包含小分子和生长因子的组合物对化学诱导的改变细胞命运的重编程的影响：将小鼠成纤维细胞经过缺失某一种小分子或生长因子的组合物诱导八天后，通过qrt-pct分析内胚层基因的诱导表达(图2a)，repsox对诱导sox17、foxa2、hnf4a、cdh1起重要作用；ttnpb和bmp4对诱导sox17起重要作用；foxa2、hnf4a和cdh1的诱导和chir99021、fsk、y27632、ttnpb、bmp4相关度低；ttnpb等小分子不利于foxa2、hnf4a和cdh1的诱导。跟踪将小鼠成纤维细胞经过缺失某一种小分子或生长因子的组合物诱导过程中的细胞生长曲线(图2b)，表明fgf2和ttnpb在不同程度上促进了细胞增长。
如图2c所示，通过如下方法建立小分子和生长因子的剂量对化学诱导的改变细胞命运的重编程的影响：通过改变小分子或生长因子的计量bmp4(0-50ng/ml)、chir99021(0-20μm)、repsox(0-20μm)、ttnpb(0-5μm)、fgf2(0-50ng/ml)和fsk(0-50μm)，并分析内胚层基因的诱导表达。如图2d所示，通过跟踪在诱导过程中不同时间点指定标记物的表达情况进一步优化化学诱导的流程。
如下为优选的通过化学诱导改变细胞命运重编程而获得内胚层祖细胞的过程。
4、内胚层祖细胞的诱导
经过上述优化过程，如下为优选的通过化学诱导改变细胞命运重编程而获得内胚层祖细胞(图3a)的方法。以1万个/孔的密度种植小鼠成纤维细胞于12孔培养板。接种后第1天到第4天，换液为含有小分子和生长因子的组合物的上皮样细胞培养基i开始诱导。所述上皮样细胞诱导培养基i为：n2b27培养基；并且补充有如下诱导细胞重编程的小分子和生长因子：bfgf(10ng/ml,peprotech)，bmp4(10ng/ml，r&dsystem)，repsox(5μm，sigma)，chir(3μm，sigma)，fsk(3μm，selleck)，ttnpb(1μm，selleck)，y27632(10μm，selleck)。接种后第4天到第14天，将培养液更换为含有小分子和生长因子组合物的上皮样细胞培养基ii开始诱导，上述培养基ii和培养基i的差别在于：chir的浓度为10μm，不含ttnpb，新加入激活素a(100ng/ml)。在第14天加入hcm培养液(lonza，cc-3198)，继续培养十天后，这些原代小分子诱导的内胚层祖细胞将用0.25％的胰蛋白酶传代于基质胶包被的培养板中进行进一步鉴定，细胞密度为5000-6000每平方厘米。
对优化过程中的制定表达物进行跟踪表明诱导过程中，gata6先表达，而后出现gata4和epcam，在头14天内，cdh2没有任何变化(图3c)；图3b表明sox17迅速表达，而后foxa2、hnf4a和cdh1进行表达。westernblot和免疫染色结果同时表明在sox17早于cdh1表达(图3d)，并且在十四天后sox17，cdh1和β-catenin具有大量表达量(图3e)。
根据所述优化方法和培养基，培养化学诱导内胚层祖细胞并对得到的诱导多能性干细胞进行如下分析鉴定。
i.细胞传代，化学诱导的内胚层祖细胞和小鼠成纤维细胞的细胞接种密度50万/孔(6孔板)，传代间隔为5天。传代培养表明第二代和第十三代化学诱导内胚层祖细胞在细胞形态上没有发生明显改变(图4a)；化学诱导内胚层祖细胞可以持续传代至70天，细胞密度从初始5×105增长至1020，而对照组小鼠成纤维细胞只能持续增长5-10天并维持细胞密度至第30天(图4b)；rna-seq表明第一代和第二十二代之间维持着相同的转录谱(图4c)。
ii.免疫染色。在两组独立培养的ciepc细胞系中均表达了sos17,foxa2,hnf4a和cdh1(图4d)。
iii.单细胞rnaseq检测，rnaseq检测、qrt-pcr。不同的检测方法表明ciepcs表达内胚层标记物sox17、foxa2、gata4/6、hnf1b、sox7和上皮标记物cdh1和epcam(图4e和图4f)，并完全缺失多功能标记物，比如，pou5f1(oct4)、nanog、sox2和essrb。mef表达纤维标记物thy1、dkk3、s100a4和中胚层标记bmp4。qrt-pcr表明化学诱导内胚层祖细胞在不同代系对关键标记物sox17、foxa2、hnf4a和cdh1的进行稳定表达(图4g)。分析结果表明化学诱导内胚层祖细胞表达肝/前肠标记物krt18、krt8、krt19，但并不表达肝脏标记物alb和afp。
以上结果可以证明上述培养方法得到的细胞系为具有自我更新能力的内胚层祖细胞。
5、化学诱导内胚层祖细胞向肝细胞的分化和鉴定
将化学诱导的内胚层祖细胞分化为肝细胞是本领域的常规技术。简要来说，将ciepc在特异化培养液中培养7到10天，然后在成熟培养液中培养10天(图5a上)，其中特异化培养液为：dmem+n2+b27+bfgf(20ng/ml)+bmp4(20ng/ml)；成熟化培养液为：含有osm(20ng/ml)、dapt(10μm,selleck)、dex(0.1μm,selleck)、a83-01(0.5μm,stemrd)、hgf(25ng/ml)的hcm培养基。
经过特异化和成熟化的培养，细胞形态表现出了扁平状肝细胞形态(图5a)。rnaseq表明，化学诱导肝细胞表达了初代肝细胞的标记物(图5b)：afp，cyp3a13在化学诱导肝细胞中的表达量比初代肝细胞高；ck8、ck18、cyp2b10在化学诱导肝细胞中的表达量和初代肝细胞相当；alb、cyp311和cyp1a1在化学诱导肝细胞中的表达量相对初代肝细胞较低(图5c)。免疫染色实验表明和小鼠成纤维细胞相比，化学诱导肝细胞表达alb、afp、hnf4a、ck18、ck8和cdh1(图5d)。westernblot和elisa表明化学诱导肝细胞中血清蛋白大量表达，其表达量和初代肝细胞相当(图5e、5f、图5g)，此外化学诱导肝细胞还表达肝细胞中的特征蛋白zo-1、hnf4a/alb(图5h)。
6、化学诱导肝细胞在肝损伤中的应用
如图6a所示，化学诱导肝细胞能够储存肝糖原，并可通过ldl、idg和pas进行荧光显色研究其在体内的应用。向c57b16/j小鼠通过尾部被注入刀豆蛋白a(35mg/kg体重)引发小鼠急性肝炎和急性肝损伤，在不经任何处理情况下小鼠在12-24小时内死亡。4小时后，小鼠成纤维细胞、化学诱导肝细胞和初代肝细胞被分别从尾部注入小鼠。被注入小鼠成纤维细胞的小鼠24小时内死亡，被注入化学诱导肝细胞的小鼠存活(图6b和6c)。如图6d和6e所示，化学诱导肝细胞在降低血清中alt和ast的作用上和初代肝细胞相当。组织病理学实验表明化学诱导肝细胞保护了小鼠肝脏的进一步损伤(图6f)。追踪标记实验表明经mcherry标记的化学诱导肝细胞在体内生存良好(图6g)。
7、检测
免疫染色
将细胞用pbs洗三次，4％pfa固定30分钟，然后将其在0.1％tritonx-100和3％的bsa室温下封闭30分钟，而后加入一抗培育。2小时候用pbs洗3次，加入二抗培育1小时。细胞核通过在dapi中染色2分钟来检测。图像利用共焦显微镜(zeiss710nlo)来捕获。本发明中优选的抗体：小鼠抗-e-cad(1：100，abcamab11512)，兔抗-β-catenin(1:200，santacruzsc7199)，山羊抗-sox17(1:200，r&daf1924)，山羊抗-foxa2(1:200，santacruzsc6554)，兔抗-hnf4a(1:100，sigma-aldrichsab2104352)，兔抗-ck8(1:200，abcamab53280)，小鼠抗-ck18(1:200，abcamab31844)，山羊抗-albumin(1:200，bethyla90-134a)，小鼠抗-afp(1:100,r&dmab1368)。
免疫印迹
细胞在加入蛋白酶抑制剂(roche)的裂解液中裂解15分钟，加热到100℃持续10分钟。离心后，对上层清液进行sds-page分析并用相应的一抗和二抗进行检测。本发明中优选的抗体：抗e-cad(1:1000，csf3195)；抗-c-sox17(1：200，r&daf1924)，抗-gapdh(1：5000，biowordap2063)。
qrt-pcr和rna-seq
rna经trizol提取法制备。在实时定量pcr实验中，cdna由revertraace(toyobo)和oligo-dt(takara)制备后，用premixextaq(takara)进行qrt-pcr分析。文库经由truseqrnasampleprep试剂盒(rs-122-2001，illumina)建立，并用miseqreagentkitv2(ms-102-2011,illumina)进行测序。本发明qrt-pcr中用到的启动子序列在下表中列出：
单细胞rna-seq
用c1tmautoprepsystem(fluidigm)进行单细胞的捕捉和文库建立。简单来说，单细胞经微流体设备c1tm整合流射电路(mrna试验中用c1ifs)补获分离。cdna由smarterultralowrnakit(clotech，634833)在流射电路中合成。产物经放大收获后，用nexteraxtdnasamplepreparationkit(illumina)进行样品制备。样品在illuminanextseq500dna测序仪上用nextseqhighoutput150cyclekit进行测序。
facs分析
facs用来对albumin的细胞内染色分析。细胞用4％pfa固定15分钟，而后用perm/washbuffer(bd，557885)透化10分钟。加入一抗(抗-albumin-488)在染色液中(bd，554656)培育30分钟。用perm/washbuffer(bd，557885)洗两次后，细胞用calibur流式细胞仪(bectondickinson)进行分析。
pas染色，dil-ac-ldl和icg摄取实验
依照生厂商使用手册，细胞用pas(sigma)，dil-ac-ldl(invitrogen)进行染色。对于icg(sigma)摄取实验，icg在二次蒸馏水中溶解，加入细胞液中，最终icg浓度为1mg/ml。在37℃培育1小时后，用pbs洗细胞三次，以显微镜检测摄取状况。
elisa实验
小鼠成纤维细胞、化学诱导肝细胞和初代肝细胞在hcm培养基(lonza，cc-3198)中进行培养。24小时后收集上层清液。依照生产厂商使用手册，albumin在上层清液中的含量使用mousealbuminelisa试剂盒(bethyllaboratory)测定。
虽然本文描述并显示了本发明的优选的实施方式，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方式仅仅是举例说明。本领域技术人员可对这些实施方式作出多种改变、修改和替换，而不背离本发明。通过所附的权利要求来限定本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物也被所附的权利要求涵盖。
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