一种基于腺病毒AdC6的表达载体及其构建方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于基因治疗和疫苗载体的重组腺病毒载体及其构建方法。

背景技术：

腺病毒（adenovirus,ad）作为基因表达载体的研制起始于20世纪60年代初，当时病毒学家观察到腺病毒基因组可与猴类病毒40（sv40）基因组杂交，说明腺病毒基因组可承载异源性基因。此后腺病毒逐步发展成一种重要的载体系统。

目前，已经鉴别了57种不同的腺病毒血清型，重组腺病毒载体在基因治疗和疫苗载体方面得到了很多的应用，尤其是人血清5型腺病毒，它也是当前肿瘤基因治疗和人类免疫缺陷病毒（hiv）疫苗的研究的主要病毒载体。另外，诸如乙肝病毒、疟疾、结核等病原体的疫苗研制也都十分重视5型腺病毒载体的应用。

然而，由于人体内普遍存在抗ad5腺病毒本身的免疫反应，这种预存的免疫反应包括抗腺病毒中和抗体和针对腺病毒的杀伤性t细胞，从而抑制其进入机体细胞而其所携带的目的基因就得不到预期水平的表达甚至是完全不表达，此外具有交叉性的针对腺病毒载体的细胞免疫反应会杀死已经感染了腺病毒载体的靶细胞从而阻断外源基因的持续表达。总之，预存免疫反应会大大降低基于腺病毒载体的疫苗免疫或者基因治疗的效果。

为了克服预存免疫反应对腺病毒载体的影响，研究者们尝试了多种方法：（1）利用新方法运载重组ad5载体；（2）对ad5载体进行基因工程改造；（3）从其它人体腺病毒血清型甚至其他动物种属中开发新的重组腺病毒载体。由于人群中一般不会含有抗黑猩猩型腺病毒的中和抗体，因此基于黑猩猩型腺病毒的疫苗载体，其免疫效果显著优于以人血清型腺病毒构建的疫苗载体。该方法具体是以源于黑猩猩型腺病毒6型，改造为复制缺陷型的腺病毒载体

构建重组腺病毒载体的方法有三种。传统的方法是在包装病毒细胞系中进行外源基因和野生型病毒的同源重组，从而获得重组腺病毒，但这种方法操作复杂，不容易获得单一的重组腺病毒；第二种方法是基于在大肠杆菌中同源重组，其缺点是相对费时，容易发生突变；第三种方法是将像病毒基因组直接克隆到质粒载体，然后线性化转染包装细胞系，包装出腺病毒。

技术实现要素：

为了弥补已有技术的缺陷，本发明提供一种基于腺病毒adc6的表达载体及其构建方法。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：

一种制备腺病毒表达载体的方法，所述方法包括：以野生型腺病毒adc6基因组为基础，通过基因组直接克隆方法，删除e1编码区和e3编码区，在e1删除区插入i-ceui和pi-scei酶切位点，获得复制缺陷性的重组腺病毒表达载体；其中，野生型腺病毒adc6基因组的genebank登录号为ay530877。

进一步地，所述的删除e1编码区是指删除野生型adc6基因组中第492-3022位的碱基序列。

进一步地，所述的删除e3编码区是指删除野生型adc6基因组中第17895-31909位的碱基序列。

进一步地，制备腺病毒表达载体的方法包括：

（1）pcr扩增adc6腺病毒基因组的litr片段(1-492)（基于genebank登录号ay530877的序列计算序列位点），用pmei和batapi酶切pneb193质粒和pcr产物，连接形成质粒pneb193-pb；

（2）用snabi和ndei酶切puc57-linker和pneb193-pb，连接，获得质粒为pneb193-pb+linker；

（3）pcr扩增adc6腺病毒基因组从3022位至9022位片段，pcr扩增adc6腺病毒基因组从9002位至16002位片段和pcr扩增adc6腺病毒基因组从15982位至22000位片段（基于genebank登录号ay530877的序列计算序列位点），用ndei和mlui酶切质粒pneb193-pb+linker，通过takara的快速连接试剂盒连接4个片段，获得质粒pneb193-de1；

（4）pcr扩增adc6腺病毒基因组从21980位至27895位片段和pcr扩增adc6腺病毒基因组从31909位至36604位片段，用ecorv和hpai酶切线性化质粒pneb193-de1，通过takara的快速连接试剂盒连接3个dna片段，获得质粒pneb193-de1e3，即为复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。

在本发明的另一方面，提供一种腺病毒表达载体，所述表达载体在野生型腺病毒adc6基因组基础上删除e1和e3编码区，并且在e1删除区插入i-ceui和pi-scei酶切位点。

进一步地，所述腺病毒表达载体的核苷酸序列如seqidno：16所示。

在另外的一选例中，所述表达载体的酶切位点i-ceui和pi-scei之间，还包括外源的抗原编码基因。

进一步地，所述外源的抗原是丙肝病毒的非结构蛋白ns3的抗原。

在本发明的另外一方面，提供一种制备疫苗的方法，所述方法包括：

（1）提供所述的腺病毒表达载体；

（2）将外源的抗原编码基因插入到（1）中腺病毒表达载体的酶切位点i-ceui和pi-scei之间；

（3）将步骤（2）的重组表达载体转染包装病毒细胞，病毒在细胞内包装完成，从而获得具有免疫原性的疫苗。

本发明具有如下有益效果：

（1）本发明人经过深入的研究，设计了一种有效的方法，成功地基于黑猩猩型腺病毒adc6构建成一种新型表达载体，所述的疫苗载体可应用于制备高效表达且具有良好免疫原性的病毒疫苗。

（2）本发明通过in-fusion连接的方法，构建大片段质粒，不受限制性酶切位点的限制，可以用于任何大片段载体的构建；本发明通过几次连接可以构建完成腺病毒表达载体，步骤简单；本发明在删除e1和e3区，在pcr扩增dna片段的过程中就能够完成；本发明在细菌水平筛选阳性克隆更加容易、快捷，而且缩短了腺病毒载体构建时间。

（3）本发明的载体构建的方法可以适用于一切腺病毒载体的构建，能被普遍推广应用于所有生物医学实验室，并且对腺病毒内部序列可以进行优化改造，构建各种特异的腺病毒载体。

附图说明

图1为adc6基因组dna的酶切鉴定结果。

图2为重组腺病毒载体pneb193-de1e3的酶切鉴定结果。

图3为构建重组腺病毒adc6-egfp，其中

a：重组腺病毒载体adc6-egfp的酶切鉴定结果；

b:重组腺病毒adc6-egfp的噬斑形成。

图4为构建重组腺病毒adc6-ns3，其中，

a:pneb193-de1e3-ns3的酶切鉴定结果；

b:检测ns3蛋白的表达。

图5为构建复制缺陷性腺病毒载体pneb193-de1e3的流程图。

具体实施方式

本发明提供了一种腺病毒表达载体，所述表达载体包括：在野生型腺病毒adc6基因组基础上删除e1和e3编码区，且在e1删除区插入酶切位点i-ceui和pi-scei。

经过仔细的分析adc6基因组，最终确认应用酶切位点i-ceui和pi-scei作为外源基因的插入位点，此酶切位点不存在于腺病毒表达载体的其它位置。

黑猩猩型腺病毒adc6，即sadv23，从黑猩猩体内分离得到。本发明以野生型adc6为基础，通过基因组直接克隆方法，删除e1和e3编码区，在e1删除区插入酶切位点i-ceui和pi-scei，最终获得复制缺陷性的adc6重组腺病毒表达载体。

本发明还提供了一种制备腺病毒表达载体的方法，所述方法包括：以野生型腺病毒adc6基因组为基础，删除e1和e3编码区，在e1删除区插入酶切位点i-ceui和pi-scei，最终获得复制缺陷性的adc6重组腺病毒表达载体。

作为本发明的优选方式，克隆步骤包括：（1）pcr扩增adc6腺病毒基因组的litr片段（约450bp），用pmei和batapi酶切pneb193质粒和pcr产物，连接形成质粒pneb193-pb；（2）用snabi和ndei酶切puc57-linker和pneb193-pb质粒，连接成质粒pneb193-pb+linker；（3）pcr分别扩增adc6腺病毒基因组从3022位至9022位片段，从9002位至16002位片段和15982位至22000位片段，用ndei和mlui酶切质粒pneb193-pb+linker，通过takara的快速连接试剂盒连接4个dna片段，获得质粒pneb193-de1；（4）pcr分别扩增adc6腺病毒基因组从21980位至27895位片段和从31909位至36604位dna片段，用ecorv和hpai酶切线性化质粒pneb193-de1，通过takara的快速连接试剂盒连接3个dna片段，获得质粒pneb193-de1e3。

获得腺病毒表达载体之后，将其转染入包装病毒细胞，进行病毒的扩增。转染一段时间后，可以收获病毒。收获的病毒可以反复感染病毒包装细胞系，持续传代。

本发明的复制缺陷性的腺病毒载体作为一种表达载体平台，适用于表达多种抗原，从而制备病毒疫苗。

为了验证adc6的有效性，本发明将绿色荧光蛋白基因克隆入adc6载体，研究显示adc6载体能高表达抗原基因，证明本发明获得了一种新型的腺病毒载体，可用于疫苗研发以及其它生物医学基础研究，为新型疫苗研发提供一种新型的载体平台。

本发明通过腺病毒基因组直接克隆的方法，利用host08大肠杆菌稳定转化体系，极大程度上降低了腺病毒发生突变的可能，获得的重组腺病毒载体遗传稳定性好。因此，医用本发明构建的腺病毒载体表达外源基因将更稳定。本发明利用体外in-fusion的pcr的方法构建腺病毒载体，在细菌水平筛选阳性克隆更加容易、快捷，而且缩短了腺病毒载体构建时间。而且本发明的载体构建的方法可以适用于一切腺病毒载体的构建，能被普遍推广应用于所以生物医学实验室，并且对腺病毒内部序列可以进行优化改造，构建各种特异的腺病毒载体。因此，本发明不仅提供了一种新的腺病毒表达载体，而且提供了一种新型的腺病毒构建方法，有利于促进腺病毒载体在生物医学基础研究领域和临床开发方面的应用。

下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。下列实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著的分子克隆指南第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或者按照试剂的说明书的条件。

材料

1.1病毒株和细胞

野生型腺病毒adc6购于atcc(vr-592)；293a细胞株本实验室保存，培养基为10%胎牛血清（fbs）的dmem。

限制性内切酶、菌种和质粒

限制性内切酶购自newenglandbiolabs；dh5α感受态购自于天根生化科技有限公司；e.colihst08感受态购自于takara。

phage-cmv-mcs-egfp质粒由实验室保存。

pdc315-ns3-5b(hcv)质粒由实验室保存。

pshuttle2-cmv-flag载体购于addgene。

puc57-linker质粒：linker序列（seqidno：1）由北京华大基因合成并克隆至puc57载体上，获得puc57-linker。

快速连接试剂盒

in-fusion快速克隆试剂盒购自takara（货号：638912）

2方法

2.1腺病毒的扩增与纯化

293a细胞在含有10%fbs的dmem培养基培养，adc6腺病毒在293a细胞中培养增值，当细胞全部表现出病毒病变（cpe）后，收集感染的细胞，离心，用dmem重悬，反复冻融细胞三次，使细胞裂解释放出病毒。病毒经过cscl密度梯度离心纯化，加入甘油保存于-80摄氏度。

提取腺病毒基因组dna

adc6腺病毒纯化后，用标准方法提取基因组dna。用agei酶切鉴定基因组dna。

构建复制缺陷性的的腺病毒载体

2.3.1构建质粒pneb193

用限制性内切酶ecori和hindiii消化puc19质粒，通过梯度降温连接如下的含有多克隆位点的dna片段，获得pneb193质粒。多克隆位点的dna序列如下：

f:5-aattcgagctcggtacccgggggcgcgccggatccttaattaagtctagagtcgactgtttaaacctgcaggcatgca-3（seqidno：2）

r:5-agcttgcatgcctgcaggtttaaacagtcgactctagacttaattaaggatccggcgcgcccccgggtaccgagctcg-3（seqidno：3）

2.3.2构建质粒pneb193-pb

以adc6腺病毒基因组为模版，用如下的引物pcr扩增得到pmei到batapi约450bp，用pmei和batapi酶切pcr产物和pneb193，连接，获得质粒：pneb193-pb。含有限制性内切酶位点pmei和batapi的引物如下：

f:5-gggtttaaacccgcgatcgcgcatcatcaataatatacctcaaac-3（seqidno：4）

r:5-aagggcaccatctgcacgcgtcgccatatggaatacgtaaaaacaccggactttg-3（seqidno：5）

2.3.3构建质粒pneb193-pb+linker

用snabi和ndei酶切puc57-linker和pneb193-pb质粒，连接成质粒pneb193-pb+linker。

构架质粒pneb193-de1

以adc6腺病毒基因组为模版，用引物1和2pcr扩增3022位至9022位dna片段，用引物3和4pcr扩增从9002位至16002位dna片段，用引物5和6（表1）pcr扩增从15982位至22000位（基于genebank登录号ay530877的序列计算序列位点）dna片段，再用ndei和mlui酶切质粒pneb193-pb+linker，胶回收四段dna片段，用takara的快速连接试剂盒连接获得质粒pneb193-de1。

表1

2.3.5构建质粒pneb193-de1e3

以adc6腺病毒基因组为模版，用引物d1和d2pcr扩增adc6腺病毒基因组从21980位至27895位dna片段，用引物d3和d4（表2）pcr扩增adc6腺病毒基因组从31909位至36604位（基于genebank登录号ay530877的序列计算序列位点）dna片段，用ecorv和hpai酶切线性化质粒pneb193-de1，分别胶回收三段dna片段，用takara的快速连接试剂盒连接获得质粒pneb193-de1e3。

pneb193-de1e3的核苷酸序列如seqidno：16。

表2

2.4构建重组腺病毒pneb193-de1e3-egfp（adc6-egfp）

2.4.1将egfp基因克隆至pneb193-de1e3

以ecori和bamhi分别双酶切phage-cmv-mcs-egfp和pshuttle2-cmv-flag质粒，琼脂糖凝胶回收目的片段，连接获得载体pshuttle2-cmv-egfp。用i-ceui和pi-scei分别酶切pshuttle2-cmv-egfp和pneb193-de1e3，琼脂糖凝胶电泳回收dna片段，连接，转化，鉴定，获得pneb193-de1e3-egfp

2.4.2包装adc6-egfp重组腺病毒

用sgfi酶切线性化pneb193-de1e3-egfp质粒（egfp核苷酸序列seqidno：17）。用293a细胞铺六孔板，当细胞融合度到70%-80%时，用x-tremegene(roche)转染约2ug已线性化的pneb193-de1e3-egfp。每天观察细胞荧光的情况。

2.5构建重组腺病毒pneb193-de1e3-ns3(adc6-ns3)

2.5.1将hcv的ns3基因克隆至pneb193-de1e3

用ecori和bamhi双酶切pshuttle2-cmv-flag质粒，胶回收载体部分片段，以pdc315-ns3-5b质粒为模版，用引物e1和e2（表3）pcr扩增ns3的基因片段，通过takara的快速连接试剂盒，连接，转化，鉴定，获得pshuttle2-cmv-ns3（ns3核苷酸序列seqidno：18）。用i-ceui和pi-scei分别酶切pshuttle2-cmv-ns3和pneb193-de1e3，琼脂糖凝胶电泳回收dna片段，连接，转化，鉴定，获得pneb193-de1e3-ns3。

2.5.2包装adc6-ns3重组腺病毒

用sgfi酶切线性化pneb193-de1e3-ns3质粒。用293a细胞铺六孔板，当细胞融合度到70%-80%时，用x-tremegene(roche)转染约2ug已线性化的pneb193-de1e3-ns3。每天观察细胞是否有病变。

扩增与纯化重组腺病毒adc6-ns3

293a细胞在含有10%fbs的dmem培养基培养，adc6-ns3腺病毒在293a细胞中培养扩增。重组腺病毒感染293a细胞后，当细胞全部出现细胞病变（cpe），收集被感染的细胞，离心。用dmem重悬细胞，反复冻融细胞三次，使细胞裂解。病毒经过cscl密度梯度离心纯化，然后用病毒保存液冻存于-80℃冰箱。

酶切鉴定adc6-ns3

adc6-ns3腺病毒纯化之后，用标准方法提取基因组dna。用agei、hindiii和sphi分别酶切做鉴定。

检测hcv的ns3的表达

用293a细胞铺六孔板。当细胞融合度达到80-90%时，用adc6-ns3病毒去感染细胞，同时用adc6病毒去感染细胞，24小时之后收细胞，westernblot检测ns3的表达。

实施例

实施例1、腺病毒的扩增、纯化与腺病毒基因组的提取

野生型adc6在293a细胞中增值，经过cscl密度梯度离心得到纯化的病毒，之后提取病毒基因组dna，用agei酶切鉴定，进行琼脂糖电泳，结果显示扩增和纯化的病毒是adc6的腺病毒，实验结果请参阅图1。

实施例2构建复制缺陷性的腺病毒载体

按照图5所示的流程图，pcr扩增adc6腺病毒基因组的litr片段（约450bp），用pmei和batapi酶切pneb193质粒和pcr产物，连接形成质粒pneb193-pb。

用snabi和ndei酶切puc57-linker和pneb193-pb质粒，连接成质粒pneb193-pb+linker。

pcr分别扩增adc6腺病毒基因组从3022位至9022位片段，从9002位至16002位片段和15982位至22000位片段，用ndei和mlui酶切质粒pneb193-pb+linker，通过takara的快速连接试剂盒连接4个dna片段，获得质粒pneb193-de1。

pcr分别扩增adc6腺病毒基因组从21980位至27895位片段和从31909位至36604位dna片段，用ecorv和hpai酶切线性化质粒pneb193-de1，通过takara的快速连接试剂盒连接3个dna片段，获得质粒pneb193-de1e3。

用agei、hindiii和sphi分别酶切pneb193-de1e3，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示pneb193-de1e3为正确目的载体。实验结果请参阅图2。

实施例3、构建重组腺病毒adc6-egfp

将egfp基因片段克隆至pneb193-de1e3之后，重组腺病毒载体adc6-egfp的酶切鉴定结果请参阅图3a。

参阅图3b，重组载体adc6-egfp线性化之后转染293a细胞，第十天出现细胞病变，随后细胞病变逐渐扩大。

实施例4、构建重组腺病毒adc6-ns3

将hcv的ns3基因克隆至pneb193-de1e3之后，线性化质粒转染如293a细胞，包装出病毒。扩增、纯化病毒之后，提基因组酶切鉴定，请参阅图4a。

用重组的复制缺陷性的adc6-ns3和空载的adc6病毒分别感染293a细胞，24小时之后，收集细胞，weaternblot的检测ns3的表达，请参阅图4b。

结论

通过以上病毒基因组直接克隆的方法，本发明将野生型腺病毒adc6构建成能稳定表达外源基因的载体。因此本发明为新型疫苗的研发以及生物医学的基础研究提供了一种基于adc6的新型表达载体，同时提供了一种新型的构建腺病毒载体的方法。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>南方医科大学

<120>一种基于腺病毒adc6的表达载体及其构建方法

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