FG-4592在促进表皮干细胞迁移方面的应用的制作方法

本发明涉及表皮干细胞的迁移，具体是fg-4592在促进表皮干细胞迁移方面的应用。

背景技术：

表皮干细胞是一种具有产生至少一种高度分化子代细胞潜能的细胞，位于表皮基底层。研究表明，表皮干细胞作为皮肤组织的特异性干细胞，是皮肤组织发生、创面修复及改建的关键性细胞，可通过增殖、分化、迁移等方式参与创面修复。创面愈合一般包括以下多个紧密联系且相互重叠的过程：凝血期、炎症反应期、在上皮化期、重塑期，其中创面再上皮化是早期启动、贯穿整个创面愈合过程的关键事件，在恢复皮肤屏障的完整性中发挥重要作用。再上皮化的过程主要依赖于表皮干细胞及其分化而来的子代细胞(表皮细胞)由创周向创面中心的迁移来实现。但由于对调控表皮干细胞迁移的机制不甚清楚，如何有效促进创面愈合，尤其是慢性、难愈性创面愈合是目前治疗皮肤创面的关键问题，导致对慢性、难愈性创面的治疗效果十分有限。

研究发现，低氧诱导整合素β1高表达可促进表皮细胞迁移(scientificreports杂志，第7卷，43926页)；张均辉等(experimentaldermatology杂志，第26卷，第5期，416-422页)发现bnip3的高表达也可促进表皮细胞迁移。

fg-4592是一种脯氨酰羟化酶抑制剂，分子式c19h16n2o5，能稳定hif(低氧诱导因子)，同时诱导epo(促红细胞生成素)产生。基于fg-4592能够稳定hif，激活与铁代谢相关的酶等机理，临床上通过口服fg-4592用于治疗贫血，例如由毒性化合物，化学治疗剂顺氯氨铂诱导的贫血，或由创伤、损伤、寄生虫、手术等失血所致的贫血。

除此之外，吴凯等(brainresearch杂志，1632卷，第19-26页)发现fg-4592通过稳定hif-1α，促进脊髓损伤功能恢复和神经保护；georgehoppe等(pnas杂志，113卷，18期，第2516-2525页)揭示了fg-4592在防治早产儿视网膜病变方面的作用。但迄今为止未见fg-4592对表皮干细胞迁移影响的报道，基于此，发明人探究了fg-4592在促进表皮干细胞迁移方面的应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供fg-4592在促进表皮干细胞迁移方面的应用。

本领域技术人员知晓，fg-4592临床上用于预防、预先治疗或治疗hif和/或epo相关病况，包括贫血、局部缺血和缺氧病况，其作用机理是通过抑制hif-1α羟基化从而稳定hif，激活hif调控基因的表达，诱导epo产生。本发明基于fg-4592的结构和性能以及特定的用药途径、用药剂量和用药频率/时间使得fg-4592能够有效促进表皮干细胞的迁移，并进一步应用于制备细胞培养液，制备治疗慢性、难愈性创面敷料等药物。

除特殊说明外，本发明中的实验步骤和调节均为本领域技术人员知晓的常规实验步骤和调节；本发明所述原料均为本领域技术人员知晓的市售产品，所述百分比均为质量百分比。

本发明的目的是这样实现的：

fg-4592在促进表皮干细胞迁移方面的应用，所述fg-4592结构式如式(i)所示，纯度≥99％：

式(i)。

fg-4592在促进表皮干细胞迁移方面的应用，原代表皮干细胞达到50-80％汇合时，给药fg-4592，工作浓度为5-20μm(微摩尔μmol/l)。

上述技术方案通过在表皮干细胞中加入fg-4592，能够提高表皮干细胞的运动性，促进表皮干细胞迁移，而且能够用于细胞培养等方面。

为进一步促进表皮干细胞的迁移，提高表皮干细胞的运动速率，fg-4592在促进表皮干细胞迁移方面的应用，原代表皮干细胞达到60-75％汇合时，给药fg-4592，工作浓度为8-12μm，且给药处理后于活细胞环境中培养。

根据本发明的一个实施方案，fg-4592在促进表皮干细胞迁移方面的应用，离体细胞培养中，给药方式为fg-4592溶液直接加入培养基。

本发明中，fg-4592在制备表皮干细胞培养液或创面愈合药物中的应用，例如按常规方法将fg-4592制备成片剂、粉剂、颗粒剂、半固态剂或注射剂，也可将fg-4592结合现有创面药物制备成新型创面愈合药物。

本发明中，fg-4592在制备治疗烧伤、烫伤、放射损伤、软组织损伤、糖尿病足溃疡、压疮、下肢静脉性溃疡患者以及瘢痕切除、体表良性肿块切除、皮瓣移植、皮肤移植术后创面敷料或药物中的应用。

本发明具有如下有益效果：

本发明fg-4592能够促进表皮干细胞运动，显著提高表皮干细胞的运动速率。实验证明，fg-4592组表皮干细胞在xy轴上的运动区间表征为(-110～60μm，-120～120μm)，细胞的平均运动速率为30μm/h，对照组表皮干细胞在xy轴上的运动区间表征为(-60～60μm，-50～90μm)，细胞的平均运动速率为19μm/h。相比于之下，fg-4592组表皮干细胞的运动范围显著扩大，fg-4592组表皮干细胞的运动速率显著高于对照组，细胞的平均运动速率提高了11μm/h。

本发明fg-4592还能够促进表皮干细胞增殖，提高表皮干细胞的增殖活力。试验证明，用fg-4592给药处理后表皮干细胞的吸光度值(od值)约为0.18，大于对照组od值(约为0.16)，且差异具有统计学意义，说明fg-4592可提高表皮干细胞的增殖活力。此外，通过蛋白印迹法检测pcna的表达，在内参β-actin表达量基本一致的情况下，pcna的表达在经fg-4592给药处理后明显增加，表明fg-4592有效地促进了表皮干细胞的增殖。

本发明fg-4592还能够提高创面愈合速度，缩短创面愈合时间。试验证明，经fg-4592给药处理后，术后第4天创面愈合区域可达60％，显著高于对照组(创面愈合率为45％)，且平均愈合时间缩短至8天。

本发明提供了fg-4592在促进表皮干细胞迁移方面的应用，为通过调控表皮干细胞迁移，继而调节表皮干细胞培养、表皮移植、创面愈合提供了依据。本发明可用于制备表皮干细胞培养液，表皮移植、创面愈合的辅助药物，为烧伤、压疮、下肢静脉性溃疡、糖尿病足患者以及皮瓣移植、皮肤移植术后等慢性、难愈性创面的患者带来了福音，具有广阔的应用和市场前景。

附图说明

图1：fg-4592的化学结构式；

图2：fg-4592对表皮干细胞迁移性的影响，其中图a为对照组表皮干细胞得运动轨迹图，图b为fg-4592组(10μm)表皮干细胞的运动轨迹图，图c为对照组、fg-4592组细胞运动速率图；

图3：对照组、fg-4592组(10μm)对表皮干细胞的增殖和活力的影响；

图4：fg-4592对表皮干细胞中增殖标志物pcna表达的影响；

图5：fg-4592对小鼠创面愈合的影响，其中：图a为愈合过程中代表性图片，图b为不同时间点未愈创面的百分比，图c为完全愈合所需时间的统计图；

图6：fg-4592对小鼠创面中增殖标志物pcna表达的影响，其中：图a为蛋白质印迹法检测fg-4592组和对照组小鼠皮肤创面组织中hif-1α和pcna表达，图b和图c分别为蛋白质印迹法检测fg-4592组和对照组小鼠皮肤创面组织中hif-1α和pcna表达的灰度值比较；

图7：fg-4592对表皮干细胞迁移性的影响，其中图a为对照组表皮干细胞得运动轨迹图，

图b为fg-4592组(5μm)表皮干细胞的运动轨迹图；图c为对照组、fg-4592组(5μm)、表皮干细胞的运动速率图；

图8：对照组、fg-4592组(5μm)对表皮干细胞的增殖和活力的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，用于具体说明fg-4592对表皮干细胞迁移及其细胞增殖等方面的影响，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

实施例1：fg-4592对表皮干细胞迁移性的影响

试验设计：gf-4592购自selleckchem公司，纯度为99.27％，实验分为对照组和gf-4592组。利用经典的两步消化法和差速贴壁法分离并培养1日龄小鼠的表皮干细胞，利用cd71和cd49f流式鉴定表皮干细胞纯度为95％。

将表皮干细胞接种于24孔板，当原代表皮干细胞达到70％汇合时，给药处理，对照组加入0.1％dmso(二甲基亚砜)，gf-4592组加入工作浓度为10μm的fg-4592，处理24小时后放入活细胞工作站，每组随机选取3-5个视野，持续观察3小时，设置为每隔5分钟拍照一次记录细胞的位置。

采用imagej软件分析表皮干细胞的运动轨迹，如图2所示，图2中a图为对照组表皮干细胞的运动轨迹图，b图为fg-4592组表皮干细胞的运动轨迹图；对各组中细胞的平均运动速率进行统计分析，如图2中c图所示。

结果分析：由图2可知，fg-4592组表皮干细胞在xy轴上的运动区间表征为(-110～60μm，-120～120μm)，平均平均运动速率为30μm/h，对照组表皮干细胞在xy轴上的运动区间表征为(-60～60μm，-50～90μm)，平均平均运动速率为19μm/h。相比于之下，fg-4592组表皮干细胞的运动范围显著扩大，fg-4592组表皮干细胞的平均运动速率显著高于对照组，平均运动速率提高了11μm/h，差异具有统计学意义。可见，fg-4592能提高表皮干细胞的运动性和平均运动速率。

实施例2：fg-4592对表皮干细胞的增殖的影响(1)

试验设计：实验分为对照组和gf-4592组。利用经典的两步消化法和差速贴壁法分离并培养1日龄小鼠的表皮干细胞，利用cd71和cd49f流式鉴定表皮干细胞纯度为90％。

将表皮干细胞接种于96孔板，每组10孔，当原代表皮干细胞达到70％汇合时，给药处理，对照组加入0.1％dmso(二甲基亚砜)，gf-4592组加入工作浓度为10μm的fg-4592(纯度为99.27％)，给药处理24小时后，行cck-8细胞增殖检测，按照说明书的比例加入检测试剂(本实施例中每孔加入90ul培养基和10ulcck-8检测试剂)，孵育1小时，用酶标仪测定450nm处的吸光度值(od值)，见图3。

结果分析：由图3可知，fg-4592组的od值(约为0.18)，显著大于对照组(约为0.16)，且差异具有统计学意义，可见，fg-4592可提高表皮干细胞的增殖活力。

实施例3：fg-4592对表皮干细胞的增殖的影响(2)

试验设计：实验分为对照组和gf-4592组。利用经典的两步消化法和差速贴壁法分离并培养1日龄小鼠的表皮干细胞，利用cd71和cd49f流式鉴定表皮干细胞纯度为92％。将表皮干细胞接种于细胞培养皿，分两组，每组2个皿作为重复组。当原代表皮干细胞达到70％汇合时，给药处理，对照组加入0.1％dmso(二甲基亚砜)，gf-4592组加入工作浓度为10μm的fg-4592(纯度为99.27％)，给药处理24小时后，提取蛋白。利用蛋白印迹法检测hif-1α和pcna的表达，见图4。

结果分析：由图4可知，在内参β-actin表达量基本一致的情况下，hif-1α和pcna的表达在fg-4592组明显增加，可见，fg-4592有效地在常氧条件下稳定了hif-1α，同时促进了表皮干细胞的增殖。

实施例4：fg-4592对小鼠创面愈合的影响

试验设计：将8只成年的balb/c雄性小鼠随机分为对照组和fg-4592组，并编号。备皮后，用打孔器在背部对称打孔，形成两个直径为4毫米的全层缺损创面，随后用自粘环形硅胶圈固定创面外围皮肤，防止皱缩。

fg-4592组从打孔之日起每日腹腔注射10mg/kg(fg-4592重量/小鼠重量)fg-4592(纯度为99.27％),腹腔注射采用pbs(聚丁二酸丁二醇酯)溶液作为溶剂，对照组注射等量的pbs溶液，隔日拍照记录愈合情况，并统计分析小鼠创面愈合情况，见图5(图a为愈合过程中代表性图片，图b为不同时间点未愈创面的百分比，图c为完全愈合所需时间的统计图)。

结果分析：由图5可知，fg-4592组术后第4天创面愈合区域可达60％，术后至7-10天创面可完全愈合；而对照组术后第4天创面愈合区域小于50％，术后创面完全愈合需8-12天。可见，fg-4592组的创面愈合情况快于对照组，差异具有统计学意义。

fg-4592对小鼠创面中增殖标志物pcna表达的影响

术后10天，大部分创面已完成再上皮化，但仍处于创面愈合的增生期。各组随机选取3个样本，创面取材，组织蛋白提取并定量，采用蛋白质印迹法检测组织蛋白中hif-1α和pcna表达情况，结果见图6，其中图a为蛋白质印迹法检测fg-4592组和对照组小鼠皮肤创面组织中hif-1α和pcna表达；图b和图c分别为蛋白质印迹法检测fg-4592组和对照组小鼠皮肤创面组织中hif-1α和pcna表达的灰度值比较。

由图6可知，fg-4592组创面及周围皮肤中hif-1α表达增加，说明本实施例中的用药途径、用药剂量和用药频率能有效上调创面及周围皮肤中的hif-1α表达，同时使增殖标志物pcna(增殖细胞核抗原)表达增加，说明fg-4592组比对照组细胞增殖更旺盛。

实施例5

试验设计：gf-4592购自selleckchem，纯度为99.27％，实验分为对照组和gf-4592组(gf-4592工作浓度为5μm)，当原代表皮干细胞达到80％汇合时，给药处理。参照实施例1，分析表皮干细胞的运动轨迹和平均运动速率，如图7所示。

结果分析：由图7可知，fg-4592组表皮干细胞在xy轴上的运动区间表征为(-70～40μm，-60～100μm)，平均运动速率提约为30μm/h，对照组表皮干细胞在xy轴上的运动区间表征为(-60～60μm，-50～90μm)，平均运动速率提约为19μm/h。相比于之下，fg-4592组表皮干细胞的运动范围略有扩大，但是fg-4592组(5μm)表皮干细胞的平均运动速率均显著高于对照组，平均运动速率提高了11μm/h，差异具有统计学意义。可见，fg-4592能提高表皮干细胞的运动性和平均运动速率。此外，对比图2与图7可知，fg-4592对表皮干细胞的运动范围有直接影响，浓度不同，运动范围变化明显，当fg-4592浓度高于5μm时，fg-4592工作浓度越大，表皮干细胞的运动区间越大。

实施例6

试验设计：试验设计：gf-4592购自selleckchem，纯度为99.27％，实验分为对照组和gf-4592组(gf-4592工作浓度为5μm)，当原代表皮干细胞达到50％汇合时，给药处理。参照实施例2，测定450nm处的吸光度值(od值)，见图8。

结果分析：由图8可知，fg-4592组(5μm)的od值约为0.18，且与fg-4592组(10μm)相差较小(图3)，显著大于对照组(约为0.16)，且差异具有统计学意义，可见，fg-4592可提高表皮干细胞的增殖活力。

实施例7

试验设计：gf-4592购自华中海威(北京)基因科技有限公司，纯度≥99％，实验分为对照组和gf-4592组(gf-4592工作浓度为20μm)，当原代表皮干细胞达到60-75％汇合时，给药处理。参照实施例1分析表皮干细胞的运动轨迹和平均运动速率，参照实施例2并测定450nm处的吸光度值(od值)。试验表明，fg-4592组表皮干细胞在xy轴上的运动区间进一步扩大，平均运动速率进一步提高，且od值略有提高，其运动范围、平均运动速率和od值均显著高于对照组，差异具有统计学意义。

实施例8

试验设计：gf-4592购自华中海威(北京)基因科技有限公司，纯度≥99％，实验分为对照组和gf-4592组(gf-4592工作浓度为8-12μm，包括但不限于8μm、12μm)，当原代表皮干细胞达到60-75％(包括但不限于60％、65％、75％)汇合时，给药处理。参照实施例1分析表皮干细胞的运动轨迹和平均运动速率，参照实施例2并测定450nm处的吸光度值(od值)。试验表明，当gf-4592工作浓度为8-12μm，待原代表皮干细胞达到60-75％汇合时给药处理，其运动范围、平均运动速率和od值均显著高于对照组，差异具有统计学意义。综合考虑到gf-4592对hif-1α和pcna的表达以及创面愈合情况的影响，gf-4592工作浓度为8-12μm，当原代表皮干细胞达到60-75％汇合时进行给药处理作为优选。