本发明涉及医药化学领域，具体涉及一种具抗肿瘤活性的新型棉酚席夫碱类衍生物的结构及其合成方法。
背景技术：
罗丹明123(rh123)是一种常用的阳离子绿色荧光染料，可以透过细胞膜从而在活细胞线粒体内聚集，并发出黄绿色荧光，用作检测线粒体膜电位的荧光探针，并且对细胞没有任何毒性。作为一种常用的生物染色材料，有研究证实罗丹明123本身也具有一定的细胞毒性，其广泛用于癌症研究如：肝癌、膀胱癌、胰腺癌等，研究者通过其在癌细胞中的荧光分布从而分析药物作用下的癌细胞变化情况，对于癌症的研究具有重要的意义。
棉酚作为一种倍半萜烯类植物抗菌素广泛存在于棉花的根、种子等表皮组织的色素腺体里，其药理作用广泛，除抗生育作用外还具有抗肿瘤、抗寄生虫和抗病毒等生物学活性，特别是其显著的抗肿瘤能力,使得棉酚在肿瘤治疗领域中的研究前景十分广阔。目前研究发现棉酚在前列腺癌、淋巴瘤、头颈部肿瘤、结肠癌等肿瘤治疗中表现出显著的抑制增殖和诱导凋亡能力，进一步的研究证实棉酚是抗凋亡蛋白bcl-2/bcl-xl的一种小分子抑制剂，能够特异性结合在bcl-2/bcl-xl的bh3位点,阻止其与促凋亡蛋白bax等形成异二聚体，抑制bcl-2/bcl-xl的抗凋亡功能，发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用。目前临床用于恶性肿瘤的化疗药物毒副作用较强，对骨髓抑制作用明显，而且在长期使用后会逐渐产生耐药性，棉酚作为天然药物具有显著的抗瘤作用，且副作用较小，另外其代谢产物氧化棉酚同样具有显著的抗肿瘤作用。因此，对于棉酚及其衍生物的抗肿瘤活性研究已经成为当前研究的热点。
席夫碱化合物因其独特的结构特征，即核心基团含有带孤对电子的n原子，从而具有很好的配对能力，使得该类化合物在实际应用上极具特色，因此，本发明中通过利用罗丹明123上裸露的氨基与棉酚的醛基结合形成活性亚胺结构，从而得到一种新型棉酚席夫碱类化合物，通过阐述该化合物的合成方法结合初步的药理学实验验证该类棉酚席夫碱类化合物的抗肿瘤作用，证实了目标化合物a与b在抗肿瘤的治疗中具有较高的医药研究与应用价值。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种具抗肿瘤活性的新型棉酚席夫碱类衍生物及其制备方法。
本发明所述的化合物其结构式如式a与式b所示：
本发明的技术方案是采用罗丹明123和醋酸棉酚为起始原料于非极性有机溶剂中反应，通过极性溶剂重结晶后进行硅胶柱层析得到两种新型棉酚席夫碱类衍生物。
本发明提供的所述化合物的合成路线如下所示：
为了实现上述合成路线，本发明的合成步骤如下：
(1)将罗丹明123和棉酚分别溶于非极性有机溶剂中，加热回流反应10～14小时；
(2)薄层层析方法跟踪反应至完全，停止加热，冷却反应液后抽滤得混合物a和b；
(3)将混合物a和b的粗品加入到反应器中，加入极性有机溶剂进行重结晶，减压浓缩得固液混合浓缩液；
(4)对上述(3)所得固液混合浓缩液进行柱层析分离，tcl跟踪至目标产物a与产物b分别富集充分；分段收集洗脱液分别浓缩、静置析晶后抽滤，干燥即得目标产物a与产物b。
上述步骤(1)中的非极性有机溶剂优选甲苯、氯仿、乙酸乙酯，进一步优选为氯仿。
上述步骤(1)中的醋酸棉酚和罗丹明123的摩尔比为1:2～1:2.5，进一步优选为1:2.2。
上述步骤(1)中的反应时间优选为10～12小时，进一步优选为12小时。
上述步骤(3)中的重结晶极性溶剂优选为丙酮或甲醇，进一步优选为丙酮。
上述步骤(4)中的柱层析洗脱液优选为氯仿：甲醇＝10：1。
本发明的优点在于：反应原料价廉易得，反应步骤少，操作安全性高，反应原料利用率高，适用于工业化生产，化合物结构新颖且具有较高的研究价值。
具体实施方案
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目的，而不限制本发明的范围和实质。
实施例1
化合物adimethyl2,2'-(6,6'-((1z,1'e)-((1,1',6,6',7,7'-hexahydroxy-5,5'-diisopropyl-3,3'-dimethyl-[2,2'-binaphthalene]-8,8'-diyl)bis(methanylylidene))bis(azanylylidene))bis(3-imino-3h-xanthene-9,6-diyl))dibenzoate和化合物b(z)-methyl2-(6-(((8'-formyl-1,1',6,6',7,7'-hexahydroxy-5,5'-diisopropyl-3,3'-dimethyl-[2,2'-binaphthalen]-8-yl)methylene)amino)-3-imino-3h-xanthen-9-yl)benzoate的制备。
准确称取醋酸棉酚103.71mg(0.2mmol)和罗丹明123131.7mg(0.4mmol)分别用20ml氯仿溶解然后混合后置于圆底烧瓶中，磁力搅拌下升温至40℃，反应12小时。薄层层析方法跟踪反应至完全，停止加热，撤去冷凝装置，反应液冷却后抽滤得混合物a、b粗品，将所得的粗品加入25ml丙酮进行重结晶后将反应液浓缩，浓缩液经100ml洗脱液氯仿-甲醇(10:1)反复洗脱，根据tcl跟踪结果分段收集洗脱液对化合物a和b进行富集，富集液分别静置析晶，抽滤干燥即得化合物a0.52g，化合物b0.15g，总摩尔收率为67％。
化合物a:
1h-nmr(300mhz,dmso-d6)δ(ppm):11.04(2h,s),9.74(2h,s),8.12(2h,d,j＝7.5hz),8.01(2h,d,j＝10.9hz),7.82(2h,s),7.50-7.68(6h,m,j＝7.5hz,j＝1.5hz),7.14(2h,d,j＝7.5hz),6.93(2h,s),6.81-6.83(4h,m,j＝1.5hz),6.01(2h,d),5.54(6h,s),3.78(6h,s),2.71(2h,m,j＝6.8hz),2.63(6h,s),1.25(12h,d,j＝6.8hz)；13c-nmr(75mhz,dmso-d6)δ(ppm):167.2,165.3,154.2,153.7,152.8,151.8,149.2,147.1,143.1,141.4,138.4,133.3,132.4,131.5,130.2,130.8,130.2,129.7,127.7,126.5,126.0,125.2,118.8,117.0,116.4,115.4,113.3,111.2,110.1,103.9,100.4,52.5,28.4,27.1,22.8；ms(esi)for(m+h)+:1171.4.
化合物b:
1h-nmr(300mhz,dmso-d6)δ(ppm):10.84(1h,s),10.11(1h,s),9.53(1h,s),8.21(2h,d,j＝10.9hz),8.04(2h,s),7.44-7.79(3h,m,j＝7.5hz),7.32(1h,s),7.01(1h,s),6.91-6.94(2h,m,j＝1.5hz),6.42(1h,d),5.62(6h,s),3.82(3h,s),2.74(2h,m,j＝6.8hz),2.66(6h,s),1.22(12h,d,j＝6.8hz)；13c-nmr(75mhz,dmso-d6)δ(ppm):194.1,167.0,163.3,153.0,152.8,152.1,148.9,145.1,143.1,141.6,138.4,134.1,132.4,132.1,131.9,130.8,127.7,126.6,126.0,124.8,117.8,116.6,116.0,115.4,114.4,113.9,112.3,111.2,110.1,105.9,102.4,54.5,29.4,26.1,21.5；ms(esi)for(m+h)+:845.3.
实施例2
化合物adimethyl2,2'-(6,6'-((1z,1'e)-((1,1',6,6',7,7'-hexahydroxy-5,5'-diisopropyl-3,3'-dimethyl-[2,2'-binaphthalene]-8,8'-diyl)bis(methanylylidene))bis(azanylylidene))bis(3-imino-3h-xanthene-9,6-diyl))dibenzoate和化合物b(z)-methyl2-(6-(((8'-formyl-1,1',6,6',7,7'-hexahydroxy-5,5'-diisopropyl-3,3'-dimethyl-[2,2'-binaphthalen]-8-yl)methylene)amino)-3-imino-3h-xanthen-9-yl)benzoate的制备。
准确称取醋酸棉酚103.71mg(0.2mmol)和罗丹明123158.1mg(0.48mmol)分别用25ml甲苯溶解然后混合后置于圆底烧瓶中，磁力搅拌下升温至60℃，反应12小时。薄层层析方法跟踪反应至完全，停止加热，撤去冷凝装置，反应液冷却后抽滤得混合物a、b粗品，将所得的粗品加入25ml乙醇进行重结晶后将反应液浓缩，浓缩液经200ml洗脱液氯仿-甲醇(10:1)反复洗脱，根据tcl跟踪结果分段收集洗脱液对化合物a和b进行富集，富集液分别静置析晶，抽滤干燥即得化合物a0.42g，化合物b0.17g，总摩尔收率为53％。
实施例3
化合物adimethyl2,2'-(6,6'-((1z,1'e)-((1,1',6,6',7,7'-hexahydroxy-5,5'-diisopropyl-3,3'-dimethyl-[2,2'-binaphthalene]-8,8'-diyl)bis(methanylylidene))bis(azanylylidene))bis(3-imino-3h-xanthene-9,6-diyl))dibenzoate和化合物b(z)-methyl2-(6-(((8'-formyl-1,1',6,6',7,7'-hexahydroxy-5,5'-diisopropyl-3,3'-dimethyl-[2,2'-binaphthalen]-8-yl)methylene)amino)-3-imino-3h-xanthen-9-yl)benzoate的制备。
准确称取醋酸棉酚103.71mg(0.2mmol)和罗丹明123168.1mg(0.5mmol)分别用25ml乙酸乙酯溶解然后混合后置于圆底烧瓶中，磁力搅拌下升温至60℃，反应12小时。薄层层析方法跟踪反应至完全，停止加热，撤去冷凝装置，反应液冷却后抽滤得混合物a、b粗品，将所得的粗品加入25ml丙酮进行重结晶后将反应液浓缩，浓缩液经200ml洗脱液氯仿-甲醇(5:1)反复洗脱，根据tcl跟踪结果分段收集洗脱液对化合物a和b进行富集，富集液分别静置析晶，抽滤干燥即得化合物a0.37g，化合物b0.15g，总摩尔收率为47％。
实施例4
本发明化合物的抗肿瘤活性测试
对本发明的化合物进行了肿瘤细胞增殖抑制试验，试验方法采用常规的mtt法。
细胞株选用：人前列腺癌细胞(du145)，人肺癌细胞(a-549)，人胃癌细胞(sgc-7901)。培养液为dmem+15％nbs+双抗。
样品液的配制：用dmso(merck)溶解后，加入pbs(-)配成的100μmol/l的溶液或者均匀的混悬液，然后用dmso的pbs(-)稀释，最终浓度分别为0.1，1，10，20，40，60，80，100μmol/l。
将上市的抗肿瘤药物醋酸棉酚(acetategossypol)以同样的条件配成对照品溶液。
细胞培养：贴壁生长肿瘤细胞细胞培养于含10％灭活新生牛血清和青霉素、链霉素(各100万u/l)的1640培养液中，置于37℃，5％co2，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。细胞贴壁生长，每2～3天传代1次，传代时首先倒出培养液，pbs洗2次，胰酶消化后，加入新鲜的培养液吹打均匀，调整细胞至适当浓度移入新的培养瓶中，添加培养液至适量。取对数生长期细胞用于实验。
mtt法检测细胞活性及ic50的测定：
实验原理：活细胞线粒体中脱氢酶能将黄色的mtt还原成不溶于水的蓝紫色产物甲臜(mttformazan)，并沉积在细胞中，生成的量与活细胞数目成正比，而死细胞没有这种功能。dmso能溶解蓝紫色结晶物，颜色深浅与所含的量成正比，因此用酶标仪测定的光吸收值可反映细胞存活率。
实验方法：取对数生长期细胞，消化、计数，以2×104/ml的密度接种于96孔培养板中，每孔100μl。培养24小时后，将待测化合物以0.1，1，10，20，40，60，80，100μmol/l浓度处理细胞。实验组每个浓度设5个复孔，以含0.4％dmso的培养液作对照。药物作用48小时后，去上清，每孔加入100μlmtt(2-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-3，5-二苯基-2h-四唑氢溴酸盐)(1mg/ml)，继续培养4小时，弃上清，每孔加入100μldmso，振荡混匀，用酶标仪在570nm处测定吸光度值，采用ic50计算软件求出半数抑制浓度(ic50)。
试验结果详见表1，其中，样品是指相应实施例中制备的棉酚席夫碱类衍生物,样品编号对应制备实施例中所得到的化合物的具体编号。
表1化合物对不同肿瘤细胞的半数抑制浓度ic50(单位：μmol/l)
检测数据显示化合物a和b在所测试的3种细胞株中均表现出了良好的抗肿瘤活性，在不同的细胞株中也表现出了良好的抗肿瘤活性。以上实验结果表明，本发明的化合物具有良好的抗肿瘤活性，可用于抗肿瘤药物的研究。