新型抗‑PCSK9抗体的制作方法
发明领域
本发明涉及新的抗pcsk9抗体。
背景技术：
心血管疾病一直是威胁人类健康和生命的头号杀手(worldhealthorganization(who),worldhealthorganization(2011)。各类研究报告显示，低密度脂蛋白胆固醇的降低可以有效减少患心血管疾病的风险。目前降低胆固醇主要采用他汀类药物。但很多患者由于副作用而无忍受高剂量的他汀类药物或是通过他汀类药物无法有效控制血脂(baigent,c.etal.,lancet2000,376(9753),1670-1681)，所以该领域强烈需要新的治疗方法。
前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(pcsk9)最早是作为调控神经细胞凋亡的转化酶-1而被发现的。它主要在小肠和肝脏中被合成的(seidahngetal.,procnatlacadsciusa2003；100:928-33)。其前结构域经过细胞内的自裂解后成为成熟的pcsk9，然后经由肝脏细胞分泌出来(mcnutt,m.c.etal.,j.biol.chem.2007,20(282),20799-20803)。在胆固醇代谢调节中，pcsk9扮演很重要的角色。研究人员在两个患有常染色体显性遗传高胆固醇血症的法国家族中发现了pcsk9的功能增强型突变基因，从而发现了其在胆固醇代谢调节中的作用(abifadelmetal.,natgenet2003；34:154-6)。pcsk9主要通过结合低密度脂蛋白受体(ldl-r)从而在肝脏中被分解来达到调节胆固醇水平的作用。在没有pcsk9存在的条件下，肝脏细胞上的低密度脂蛋白受体在运送低密度脂蛋白胆固醇到溶菌酶进行降解之后，会循环回到细胞膜表面。当pcsk9结合到低密度脂蛋白受体上时，会阻碍ldl-r的循环使用，并且会加剧其降解(verbeek,r.,etal.,eurjpharmacol2015；losurdopetal.,emborep2011；12:1300-5)。
目前在研中的几种抑制pcsk9的方法包括通过抗体或多肽结合来阻止pcsk9与ldl-r的结合，通过基因沉默来抑制pcsk9的合成，通过小分子药物来抑制pcsk9的细胞内的合成(michelfarnier,archivesofcardiovasculardisease,2014,107,58-66)。近期获批的单克隆抗体alirocumab和evolocumab在二期和三期临床研究中都显示了在降低低密度脂蛋白胆固醇方面的显著效果。现有数据显示，无论是否接受过他汀类药物治疗，低密度脂蛋白胆固醇水平的降低可达到70％(dias,c.setal.,j.am.coll.cardiol.2012,60(19),1888–1898；giugliano,r.petal.,lancet,2012,380(9858),2007-2017；mckenney,j.metal.,j.am.coll.cardiol.2012,59(25),2344–2353)。
发明简述
本申请提供了新的抗pcsk9单克隆抗体(特别是全人源抗体)、编码其的多核苷酸和使用其的方法。
在一个方面，本申请提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自下组的重链cdr序列：seqidno:1、3、5、13、15、17、25、27、29、37、39、41、49、55、57、59、67和69。
在某些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包括轻链cdr序列，所述序列选自：seqidno:7、9、11、19、21、23、31、33、35、43、45、47、51、53、61、63、65和71。
在某些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包括选自下组的重链可变区：
a)重链可变区，其包括seqidno:1、seqidno:3和/或seqidno:5；
b)重链可变区，其包括seqidno:13、seqidno:15和/或seqidno:17；
c)重链可变区，其包括seqidno:25、seqidno:27和/或seqidno:29；
d)重链可变区，其包括seqidno:37、seqidno:93和/或seqidno:41；
e)重链可变区，其包括seqidno:13、seqidno:49和/或seqidno:17；
f)重链可变区，其包括seqidno:55、seqidno:57和/或seqidno:59；和
g)重链可变区，其包括seqidno:1、seqidno:67和/或seqidno:69。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区，所述轻链可变区选自：
a)轻链可变区，其包括seqidno:7、seqidno:9和/或seqidno:11；
b)轻链可变区，其包括seqidno:19、seqidno:21和/或seqidno:23；
c)轻链可变区，其包括seqidno:31、seqidno:33和/或seqidno:35；
d)轻链可变区，其包括seqidno:43、seqidno:45和/或seqidno:47；
e)轻链可变区，其包括seqidno:51、seqidno:53和/或seqidno:23；
f)轻链可变区，其包括seqidno:61、seqidno:63和/或seqidno:65；和
g)轻链可变区，其包括seqidno:7、seqidno:9和/或seqidno:71。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括：
a)重链可变区，其包括seqidno:1、seqidno:3和/或seqidno:5；和轻链可变区，其包括seqidno:7、seqidno:9和/或seqidno:11；
b)重链可变区，其包括seqidno:13、seqidno:15和/或seqidno:17；和轻链可变区，其包括seqidno:19、seqidno:21和/或seqidno:23；
c)重链可变区，其包括seqidno:25、seqidno:27和/或seqidno:29；和轻链可变区，其包括seqidno:31、seqidno:33和/或seqidno:35；
d)重链可变区，其包括seqidno:37、seqidno:39和/或seqidno:41；和轻链可变区，其包括seqidno:43、seqidno:35和/或seqidno:47；
e)重链可变区，其包括seqidno:13、seqidno:49和/或seqidno:17；和轻链可变区，其包括seqidno:51、seqidno:53和/或seqidno:23；
f)重链可变区，其包括seqidno:55、seqidno:57和/或seqidno:59；和轻链可变区，其包括seqidno:61、seqidno:63和/或seqidno:65；或
g)重链可变区，其包括seqidno:1、seqidno:67和/或seqidno:69；和轻链可变区，其包括seqidno:7、seqidno:9和/或seqidno:71。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括选自下组的重链可变区：seqidno:73、seqidno:77、seqidno:81、seqidno:85、seqidno:89、seqidno:93和seqidno:97和与其具有至少80％(如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的同源序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括选自下组的轻链可变区：seqidno:75、seqidno:79、seqidno:83、seqidno:87、seqidno:91、seqidno:95和seqidno:99和与其具有至少80％(如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的同源序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括
a)重链可变区，其包括seqidno:73；和轻链可变区，其包括seqidno:75；
b)重链可变区，其包括seqidno:77；和轻链可变区，其包括seqidno:79；
c)重链可变区，其包括seqidno:81；和轻链可变区，其包括seqidno:83；
d)重链可变区，其包括seqidno:85；和轻链可变区，其包括seqidno:87；
e)重链可变区，其包括seqidno:89；和轻链可变区，其包括seqidno:91；
f)重链可变区，其包括seqidno:93；和轻链可变区，其包括seqidno:95；
g)重链可变区，其包括seqidno:97；和轻链可变区，其包括seqidno:99；或
h)与a)、b)、c)、d)、e)、f)或g)具有至少80％(如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的重链可变区和轻链可变区。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段能够以不超过10-7m、不超过10-8m、不超过10-9m、不超过10-10m、不超过10-11m或不超过10-12m的kd值特异性地与人pcsk9结合，所述kd值通过表面等离子(spr)共振结合法测定。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段能够以不超过10-7m、不超过10-8m、不超过10-9m、不超过10-10m、不超过10-11m或不超过10-12m的kd值特异性地与人pcsk9结合，所述kd值通过elisa法测定。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段能够以不超过10-7m、不超过10-8m、不超过10-9m、不超过10-10m、不超过10-11m或不超过10-12m的kd值特异性地与猴pcsk9结合。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段能够以不超过2.1nm(例如不超过3nm、2.5nm、1.8nm、1.7nm、1.6nm、1.5nm、1.4nm、1.3nm、1.2nm或1nm)的ic50值阻断人pcsk9与其配体的结合。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段能够以不超过0.15nm(例如不超过0.14、0.13、0.12、0.11、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03或0.02nm)的ec50值与人pcsk9结合。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段能够以不超过115nm、不超过106nm、不超过80nm、不超过77nm、不超过66nm或不超过40nm的ic50值(例如不超过120nm、110nm、100nm、90nm、85nm、80nm、75nm、70nm、65nm、60nm、55nm、50nm、45nm、40nm、35nm、30nm、25nm、20nm、15nm、11nm、10nm、9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm、2nm或1nm)恢复细胞ldl吸收。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段在血清中至少1天、至少3天、至少4天、至少5天、至少一周、至少2周、至少一个月是稳定的。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段不介导adcc或cdc或两者均不介导。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段是全人源单克隆抗体。在某些实施方式中，所述全人源单克隆抗体由宿主细胞或转基因动物生产。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段能够在动物中减少ldl胆固醇水平至10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、77％、80％、84％、85％、90％、95％或更多。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段能够在动物中维持hdl胆固醇水平。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段具有至少165小时、至少250小时、至少360小时、至少390小时或至少450小时的血清半衰期(例如至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少180、至少200、至少300、至少350、至少400、或至少500小时)。
在一个方面，本申请提供抗体或其抗原结合片段，其与本申请所述的抗体或其抗原结合片段竞争相同的表位。
在某些实施方式中，本申请提供一种抗体或其抗原结合片段是骆驼化单域抗体(camelizedsinglechaindomainantibody)、双功能抗体(diabody)、scfv、scfv二聚体、bsfv、dsfv、(dsfv)2、dsfv-dsfv'、fv片段、fab、fab'、f(ab')2、ds双功能抗体(dsdiabody)、纳米抗体、域抗体或双价域抗体。
在某些实施方式中，本申请提供一种抗体或其抗原结合片段进一步包括免疫球蛋白恒定区。
在某些实施方式中，本申请提供一种抗体或其抗原结合片段进一步包括缀合物。在某些实施方式中，所述缀合物可以是可检测标记、药代动力学修饰部分或纯化部分。
在一个方面，本申请还提供分离的多核苷酸，其编码如本申请所述的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，本申请提供的多核苷酸编码如本申请所述的抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列。在某些实施方式中，本申请提供了包括这些多核苷酸的载体。在某些实施方式中，本申请提供了表达本申请所述的一种或多种抗体或抗原结合片段的方法，其通过在载体中表达由多核苷酸编码的抗体或抗原结合片段的条件下培养宿主细胞实现。在某些实施方式中，本申请提供的多核苷酸在载体中与启动子如sv40启动子可操作地连接。在某些实施方式中，包括本申请提供的载体的宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞，或293细胞。
在一个方面，本申请提供了表达如本申请所述的抗体或其抗原结合片段的的方法，包括在表达所述多核苷酸的条件下培养所述宿主细胞。
在一个方面，本申请提供了包括本申请所述的抗体或其抗原结合片段的试剂盒。
在一个方面，本申请提供了在个体中治疗与pcsk9相关的疾病或状况的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的本申请所述的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述个体被鉴定为患有可能对pcsk9抑制剂响应的病症或状况。在某些实施方式中，所述个体被鉴定为在来自所述个体的待测生物样品中血清ldl胆固醇(ldl-c)、总胆固醇和/或非hdl胆固醇水平上调或ldl受体水平下降。在某些实施方式中，在施用了所述抗体或其抗原结合片段后，所述ldl-c和/或总胆固醇水平减少。
在一个方面，本申请还提供了药物组合物，包括本申请所述的抗体或其抗原结合片段以及一种或多种药学上可接受的载体。在某些实施方式中，所述药学载体可以是例如稀释剂、抗氧化剂、辅剂、赋形剂或无毒的辅助物质。
在一个方面，本申请还提供了治疗会从上调的免疫响应获益的受试者的状况的方法，包括对所述受试者施用有效量的本申请所述的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述受试者具有上调的ldl-c、总胆固醇和/或非hdl胆固醇水平或下调的ldl受体水平。
在一个方面，提供了本申请所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗会从上调的免疫响应中获益的状况的药物中的用途。在某些实施方式中，所述状况是心血管疾病、炎症性疾病和感染性疾病。在一个方面，所述感染性疾病是败血症。
附图简述
图1显示了11.4重链cdr3区挑选出的突变。
图2显示了全人源抗体18.156.8(higg4)的sds-page在sds-page胶中的染色结果。m:蛋白质分子量标记；lane5:18.156.8(higg4),还原条件；lane6:18.156.8(higg4),非还原条件。
图3显示了全人源抗体18.156.8(higg4)的hplc-sec图谱中显示为99.6％的纯度。
图4显示了全人源抗体40409(higg4)的sds-page在sds-page胶中的染色结果。m:蛋白质分子量标记；lane5:40409(higg4),还原条件；lane6:40409(higg4),非还原条件。
图5显示了全人源抗体40409(higg4)的hplc-sec图谱中显示为98％的纯度。
图6显示了全人源抗体15.14.2-uab-igg4l的sds-page在sds-page胶中的染色结果。m:蛋白质分子量标记；lane5:15.14.2-uab-igg4l,还原条件；lane6:15.14.2-uab-igg4l,非还原条件。
图7显示了全人源抗体15.14.2-uab-igg4l的hplc-sec图谱中显示为99.8％的纯度。
图8显示了全人源抗体17.72.3-uab2-igg4k的sds-page在sds-page胶中的染色结果。m:蛋白质分子量标记；lane5:17.72.3-uab2-igg4k,还原条件；lane6:17.72.3-uab2-igg4k,非还原条件。
图9显示了全人源抗体17.72.3-uab2-igg4k的hplc-sec图谱中显示为98.9％的纯度。
图10显示了全人源抗体18.136.7-igg4k的sds-page在sds-page胶中的染色结果。m:蛋白质分子量标记；lane5:18.136.7-igg4k,还原条件；lane6:18.136.7-igg4k,非还原条件。
图11显示了全人源抗体18.136.7-igg4k的hplc-sec图谱中显示为99.2％的纯度。
图12显示了全人源抗体19.3.8-uab1-igg4l的sds-page在sds-page胶中的染色结果。m:蛋白质分子量标记；lane5:19.3.8-uab1-igg4l,还原条件；lane6:19.3.8-uab1-igg4l,非还原条件。
图13显示了全人源抗体19.3.8-uab1-igg4l的hplc-sec图谱中显示为99.9％的纯度。
图14显示了全人源抗体与人源pcsk9结合的elisa实验。
图15显示了全人源抗体阻断pcsk9与ldl-r结合elisa实验。
图16显示了全人源抗体18.156.8通过分别结合野生型(图16a和16b)和突变pcsk9(d374y)(图16c和16d)恢复肝细胞癌(hepg2)细胞和huh-7细胞中的ldl吸收实验结果。
图17显示了全人源抗体40409通过分别结合野生型(图17a和17b)和突变pcsk9(d374y)(图17c和17d)恢复肝细胞癌(hepg2)细胞和huh-7细胞中的ldl吸收实验结果。
图18显示了全人源抗pcsk9抗体15.14.2-uab1-igg4l、17.72.3-uab1-igg4k和19.3.8-uab1-igg4l在肝细胞癌(hepg2)细胞中恢复ldl吸收的实验结果。
图19显示了elisa法结合测定的由浓度指示的全人源pcsk9抗体(图19a：18.156.8；图19b:b4g2；图19c:15.14.2、19.3.8和17.72.3)在血清中的稳定性。
图20显示了抗体18,156.8、40409和bmk.115给药后食蟹猴低密度脂蛋白(ldl-c)的变化百分率。图20a显示了单次注射10mg/kg的结果，图20b显示了单次注射30mg/kg的结果。
图21显示了抗体18,156.8、40409和bmk.115给药后食蟹猴高密度脂蛋白(hdl-c)的变化百分率。图21a显示了单次注射10mg/kg的结果，图21b显示了单次注射30mg/kg的结果。
图22显示了抗体15.14.2、19.3.8、17.72.3、18.136.7和repatha给药后食蟹猴低密度脂蛋白(ldl-c)的变化百分率。图22a显示了单次注射3mg/kg的结果，图22b显示了单次注射10mg/kg的结果。
图23显示了抗体15.14.2、19.3.8、17.72.3、18.136.7和repatha给药后食蟹猴高密度脂蛋白(hdl-c)的变化百分率。图23a显示了单次注射3mg/kg的结果，图23b显示了单次注射10mg/kg的结果。
图24显示了elisa法测定的食蟹猴血清中给药前后的抗体18.156.8、40409或bmk.115浓度。图24a显示了单次注射10mg/kg的结果，图24b显示了单次注射30mg/kg的结果。
图25显示了elisa法测定的食蟹猴血清中给药前后的抗体15.14.2(higg4)、19.3.8(higg4)、17.72.3(higg4)、18.136.7(higg4)或repatha浓度。图25a显示了单次注射10mg/kg的结果，图25b显示了单次注射30mg/kg的结果。
图26显示了食蟹猴血清中给药前后针对抗体18.156.8(higg4)、40409(higg4)或bmk.115的抗抗体(ada)浓度。图26a、26c和26e显示了单次注射10mg/kg的结果，图26b、26d和26f显示了单次注射30mg/kg的结果。
图27显示了食蟹猴血清中给药前后针对抗体15.14.2、19.3.8、17.72.3、18.136.7或repatha的抗抗体(ada)浓度。图27a、27c、27e、27g和27i显示了单次注射3mg/kg的结果，图27b、27d、27f、27h和27j显示了单次注射10mg/kg的结果。
图28a、28b和28c显示了参照抗体12h11.1和24b9.1的生成结果。图28a展示了12h11.1.uigg4k和24b9.1.uigg4l的sds-page结果。m:蛋白质分子量标记；lane1:24b9.1.uigg4l，还原条件；lane2:12h11.1.uigg4k，还原条件；lane3:24b9.1.uigg4l，非还原条件；lane4:12h11.1.uigg4k，非还原条件。图28b和28c显示对24b9.1.uigg4l和12h11.1.uigg4k的hplc-sec检测。
图29表示elisa法测定的，抗体18.156.8以及参照抗体24b9.1、12h11.1和bmk.115与人pcsk9结合的情况的比较。
图30显示了elisa法测定的，抗体18.156.8以及参照抗体24b9.1,12h11.1和bmk.115阻断pcsk9与ldlr的结合的情况的比较结果。
图31显示了抗体18.156.8以及参照抗体12h11.1和bmk.115在hepg2细胞中恢复ldl吸收的能力。
发明详述
本申请的以下描述只为说明本申请的多种实施方式。因此，此处讨论的具体修改方式不应理解为对申请范围的限制。本领域的技术人员在不偏离本申请范围的情况下即可很容易地得出多种等同方式，变化和修改，应理解这样的等同实施方式包括在本发明范围内。在本申请中引用的所有文献，包括公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入。
定义
本发明中的“抗体”一词包括任意可结合某特定抗原的免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或双特异性(双价)抗体。一个天然的完整抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链由一可变区和第一、第二、第三恒定区组成；每条轻链由一可变区和一恒定区组成。哺乳动物的重链可分为α、δ、ε、γ和μ，哺乳动物的轻链可分为λ或κ。抗体呈“y”型，“y”型结构的颈部由两条重链的第二和第三恒定区组成，其通过二硫键结合。“y”型结构的每条臂包括其中一条重链的可变区和第一恒定区，其与一条轻链的可变区和恒定区结合。轻链和重链的可变区决定抗原的结合。每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(cdr)(轻链(l)的cdr包含lcdr1、lcdr2、lcdr3，重链(h)的cdr包含hcdr1、hcdr2、hcdr3)。本发明中公开的抗体和抗原结合片段的cdr边界可通过kabat，chothia或al-lazikani命名法命名或识别。(al-lazikani,b.,chothia,c.,lesk,a.m.,j.mol.biol.,273(4),927(1997)；chothia,c.等，jmolbiol.dec5；186(3):651-63(1985)；chothia,c.andlesk,a.m.,j.mol.biol.,196,901(1987)；chothia,c.等，nature.dec21-28；342(6252):877-83(1989)；kabate.a.等，nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))。其中，三个cdr由被称为框架区(fr)的侧面连续部分间隔开，框架区比cdr更加高度保守并形成一个支架支撑超变环。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类。根据是否含有α、δ、ε、γ和μ重链，抗体可分别分为五个主要的分类或异构体：iga、igd、ige、igg和igm。几个主要的抗体分类还可分为亚类，如igg1(γ1重链)、igg2(γ2重链)、igg3(γ3重链)、igg4(γ4重链)、iga1(α1重链)或iga2(α2重链)等。
本申请中的“抗原结合片段”一词，指由含有一个或多个cdr的抗体部分或者任何其他结合抗原但不具有完整抗体结构的抗体片段所形成的一种抗体片段。抗原结合片段的例子包括，但不限于，如双功能抗体(diabody)、fab、fab'、f(ab')2、fv片段、二硫键稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv－dsfv')、二硫键稳定的双功能抗体(dsdiabody)、单链抗体分子(scfv)、scfv二聚体(双价的双功能抗体)、双价单链抗体(bsfv)、多特异性抗体、骆驼化单域抗体(camelizedsingledomainantibody)、纳米抗体、域抗体和双价域抗体。抗原结合片段可以与母体抗体结合相同的抗原。在某些实施方式中，抗原结合片段可以含有来自某特定人抗体的一个或多个cdr，移接至来自一个或多个不同人抗体的框架区。
抗体的“fab”片段是指由一条轻链(包括可变区和恒定区)和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的那部分抗体分子。
“fab'”片段是指包含了部分铰链区的fab片段。
“f(ab')2”指的是fab的二聚体。
抗体的“fc”指的是由重链的第二、第三恒定区经二硫键结合组成的那部分抗体。抗体的fc段负责多种不同的效应功能如adcc和cdc，但不参与抗原的结合。
抗体的“fv”段指的是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。fv片段由一条轻链的可变区和一条重链的可变区组成。
“单链fv抗体”或“scfv”是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体(hustonjs等，procnatlacadsciusa、85:5879(1988))。
“单链抗体fv-fc”或“scfv-fc”是指由连接到某抗体fc段的scfv组成的工程抗体。
“骆驼化单域抗体(camelizedsingledomainantibody)”、“重链抗体”或“hcab(heavy-chain-onlyantibodies，hcab)”都是指含有两个vh域而不含有轻链的抗体(riechmannl.和muyldermanss.,jimmunolmethods.dec10；231(1-2):25-38(1999)；muyldermanss.,jbiotechnol.jun；74(4):277-302(2001)；wo94/04678；wo94/25591；u.s.patentno.6,005,079)。重链抗体最初从驼科(骆驼、单峰驼和美洲驼)衍生得到。虽然缺失轻链，骆驼化抗体(camelizedantibodies)有确证的抗原结合全部功能(hamers-castermanc.等，nature.jun3；363(6428):446-8(1993)；nguyenvk.等，“heavy-chainantibodiesincamelidae；acaseofevolutionaryinnovation,”immunogenetics.apr；54(1):39-47(2002)；nguyenvk.等，immunology.may；109(1):93-101(2003))。重链抗体的可变区(vhh域)是最小的已知的获得性免疫产生的抗原结合单位(koch-noltef.等，fasebj.nov；21(13):3490-8.epub2007jun15(2007))。
“纳米抗体”是指一种抗体片段，其由一个来自重链抗体的vhh域和两个恒定区ch2和ch3组成。
“双功能抗体(diabody)”包括带有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中该片段含有在同一条多肽链上相连的vh域和vl域(vh-vl或vh-vl)(请参见，holligerp.等，procnatlacadsciusa.jul15；90(14):6444-8(1993)；ep404097；wo93/11161)。两个域之间衔接物很短，使同一条链上的两个域不能互相配对，从而迫使两个域与另一条链的互补域配对，形成两个抗体结合位点。这两个抗体结合位点可靶向结合相同或不同的抗原(或抗原表位)。
“域抗体”是指仅含有一条重链可变区或一条轻链可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或多个vh域由一个多肽衔接物共价结合并形成双价域抗体。双价域抗体的两个vh域可靶向作用于相同或不同的抗原。
在某些实施方式中，“(dsfv)2”含有三条肽链：两个vh基团间通过一条多肽衔接物相连，并通过二硫键与两个vl基团结合。
在某些实施方式中，“双特异性ds双功能抗体”含有vl1-vh2(由一个多肽衔接物相连)和vh1-vl2(也是由一个多肽衔接物相连)，两者在vh1和vl1间通过二硫键结合。
“双特异性dsfv”或“dsfv-dsfv”含有三条多肽链：vh1-vh2基团，其中两者的重链通过多肽衔接物(如：长的弹性衔接物)相连，并通过二硫键分别与vl1和vl2基团结合，每对通过二硫键配对的重链轻链具有不同的抗原特异性。
在某些实施方式中，“scfv二聚体”是双价双功能抗体或双价单链抗体(bsfv)，含有二聚化的两个vh-vl(由多肽衔接物连接)基团，其中一个基团的vh与另一个基团的vl协作形成两个结合位点，这两个结合位点可靶向结合相同抗原(或抗原表位)或不同抗原(或抗原表位)。在另一些实施方式中，“scfv二聚体”是双特异性双功能抗体，含有相互连接的vl1-vh2(由多肽衔接物连接)和vh1-vl2(由多肽衔接物连接)，其中vh1和vl1协作，vh2和vl2协作，且每个协作的配对具有不同的抗原特异性。
本申请中使用的术语“全人源”当用于抗体或抗原结合片段时，是指所述抗体或抗原结合片段具有某氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列对应于由人或人免疫细胞生产的、或从例如利用人源抗体库的转基因非人动物等非人来源衍生的抗体的氨基酸序列，或者其他编码人源抗体的序列。在某些实施方式中，全人源抗体不包含来源于非人抗体的氨基酸残基(特别是抗原结合残基)。
本申请中使用的术语“人源化”当用于抗体或抗原结合片段时，是指包括来源于非人动物的cdr、来源于人的fr区，以及来源于人的恒定区(当适用时)的抗体或抗原结合片段。由于人源化的抗体或抗原结合片段具有降低的免疫原性，其在某些实施方式中可用作人的治疗剂。在一些实施方式中，所述非人动物是哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。在一些实施方式中，所述人源化抗体或抗原结合片段除了cdr序列是非人源的以外，基本上全部由人源序列组成。在一些实施方式中，所述来源于人的fr区可以包括与其来自的人源抗体相同的氨基酸序列，或其可以包括一些氨基酸改变，例如，不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸改变。在一些实施方式中，该氨基酸改变可以仅存在于重链fr区、仅存在于轻链fr区或同时存在于两个链中。在一些优选实施方式中，所述人源化抗体包括人源fr1-3和人源jh和jκ。
本申请中使用的术语“嵌合”是指具有来源于一种物种的重链和/或轻链的一部分，和所述重链和/或轻链其余部分来源于不同物种的抗体或抗原结合片段。在一个示例性的例子中，嵌合抗体可以包括来源于人的恒定区和来源于非人动物例如小鼠的可变区。
本申请使用的“pcsk9”是指前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型，其为属于分泌性枯草杆菌蛋白酶家族的蛋白酶k亚家族的天然的人前蛋白转化酶。pcsk9作为溶酶原被合成，在内质网中经历自催化型分子内处理，并被认为作为前蛋白转化酶起作用。pcsk9在调节血液中胆固醇水平具有关键作用。pcsk9的功能获得性(如s127r、f216l和d374y)突变可能与一种常染色体显性遗传的家族性高胆固醇血症相关，其中pcsk9突变提高了ldl受体水平(参见如burnettandhooper,clinbiochemrev(2008)29(1):11-26、benjannetetal.j.biol.chem.,(2004)279(47):48865-48875和fasanotetal.,atherosclerosis.(2009)203(1):166-71)。人源pcsk9代表性的氨基酸序列由genbank登记号np_777596.2公开，且编码所述人源pcsk9的代表性核酸序列由genbank登记号fj525880.1公开。在某些实施方式中，术语pcsk9包括pcsk9氨基酸序列的翻译后修饰的pcsk9分子，如糖基化、聚乙二醇化pcsk9序列、剪切掉其信号序列的pcsk9序列或从催化结构域中剪切掉其原结构域(prodomain)但不与所述催化结构域分离的pcsk9序列。
本申请使用的“ldl-c”是指低密度脂蛋白胆固醇，且“hdl-c”是指高密度脂蛋白胆固醇。ldl和hdl属于5个主要的脂蛋白群组：乳糜微粒，极低密度脂蛋白(vldl)、中间密度脂蛋白(idl)，低密度脂蛋白和高密度脂蛋白(hdl)(顺序为从大颗粒到最密集的(最小的粒子)。ldl(含有颗粒的“坏”的胆固醇)能够运输脂质/固醇分子，如胆固醇(即ldl-c)至动脉壁，吸引巨噬细胞，因此诱发动脉粥样硬化。相反，hdl(含有颗粒的“好”的胆固醇)能够从动脉壁上的巨噬细胞移除脂质分子，如胆固醇(即hdl-c)。因此，高水平的ldl-c是心血管疾病(cvd)的主要风险，如外周动脉疾病、冠状动脉疾病(cad，如心绞痛、心肌梗塞(俗称心脏病)、高脂血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症)、动脉粥样硬化、中风、高血压性心脏病、风湿性心脏病、心肌病、心律失常、先天性心脏病、心脏瓣膜病、心肌炎、主动脉瘤、周围动脉疾病、肥胖、肝胆疾病、肾病综合征、甲状腺功能减退症和静脉血栓形成。
本申请中使用的“ldl-r”或“ldl受体”是细胞表面嵌合蛋白，其具有839个氨基酸(移除21个氨基酸的信号肽后)，介导ldl-c的内吞并从血液中移除ldl-c。人源ldl-r的代表性氨基酸序列由genbank登记号p01130.1公开，且其编码人源ldl-r的代表性mrna核酸序列由genbank登记号nm_000527.4公开。当pcsk9与ldl受体结合时，所述抗体被破坏且不能将ldl-c从血液中移除。相反，当pcsk9被阻断时，在肝脏表面会有更多的ldl受体且会从血液中移除更多的ldl胆固醇。本申请使用的“抗pcsk9抗体”是指能够特异性结合pcsk9(例如人源或猴pcsk9)的抗体，其具有足以提供诊断和/或治疗用途的亲和性。
本申请中的“特异性结合”或“特异性的结合”是指，指两分子间的非随机结合反应，如抗体和抗原间的反应。在某些实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合片段与人和/或猴pcsk9特异性结合，并且其结合亲和力(kd)≤10-6m(如：≤5x10-7m，≤2x10-7m，≤10-7m，≤5x10-8m，≤2x10-8m，≤10-8m，≤5x10-9m，≤2x10-9m，≤10-9m，≤10-10m)。本申请中的kd是指解离速度与结合速度的比值(koff/kon)，可通过表面表面等离子共振的方法测定，例如使用如biacore的仪器。
本申请中的“阻断结合”或“竞争性同样的表位”的能力是指抗体或其抗原结合片段将两个分子间结合(例如人pcsk9和抗-pcsk9抗体)的相互作用抑制到任何可检测的程度的能力。在某些实施方式中，阻断两个分子间结合的抗体或抗原结合片段可将两个分子间结合的相互作用抑制至少50％。在某些实施方式中，这样的抑制作用可以大于60％，大于70％，大于80％，或大于90％。
本申请中使用的“表位”是指抗原分子中与抗体结合的那部分氨基酸或原子基团。如果两种抗体表现出对抗原的竞争性结合，则可能结合抗原上的相同表位。例如，如果本申请提供的抗体或其抗原结合片段阻断示例抗体，例如wbp3011-2.6.6,11.4、18.156.8、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8、40409与人pcsk9的结合，那么所述抗体或其抗原结合片段可以被认为与那些示例的抗体结合相同的表位。
本申请使用的抗体名称中的符号具有不同代表意义：“higg4”是指具有人源igg4同种型恒定区的抗体；“uab”是指人源抗体，uab1、uab2等是指所述人源抗体的不同版本；“k”或“l”是指所述抗体使用kappa轻链或lambda轻链。
本申请所述“11.4”是指具有如seqidno：73所示的重链可变区和如seqidno：75所示的轻链可变区的全人源单克隆抗体。抗体“11.4.1”是11.4的亚克隆。
本申请所述“18.156.8”是指具有如seqidno：77所示的重链可变区和如seqidno：79所示的轻链可变区的全人源单克隆抗体。“18.156.8(higg4)”是具有人源igg4同种型恒定区的18.156.8抗体。
本申请所述“15.14.2”是指具有如seqidno：81所示的重链可变区和如seqidno：83所示的轻链可变区的全人源单克隆抗体。“15.14.2-uab-igg4l”是具有人源igg4同种型恒定区的18.156.8抗体。
本申请所述“17.72.3”是指具有如seqidno：85所示的重链可变区和如seqidno：87所示的轻链可变区的全人源单克隆抗体。“17.72.3-uab1-igg4k”和“17.72.3-uab2-igg4k”是具有人源igg4同种型恒定区的17.72.3抗体的不同版本。
本申请所述“18.136.7”是指具有如seqidno：89所示的重链可变区和如seqidno：91所示的轻链可变区的全人源单克隆抗体。“18.136.7-igg4k”是具有人源igg4同种型恒定区的18.136.7抗体。
本申请所述“19.3.8”是指具有如seqidno：93所示的重链可变区和如seqidno：95所示的轻链可变区的全人源单克隆抗体。“19.3.8-igg4l”和“19.3.8-uab1-igg4l”是具有人源igg4同种型恒定区的19.3.8抗体。
本申请所述“40409”是指具有如seqidno：97所示的重链可变区和如seqidno：99所示的轻链可变区的全人源单克隆抗体。40409与其亲本抗体11.4相比具有改善的亲和力。“40409(higg4)”和“40409(higg2)”分别是具有人源igg4同种型和igg2同种型恒定区的40409抗体。
在本申请中当“保守替代”用于氨基酸序列时，是指将一个氨基酸残基用另一个具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基替代。例如，可以在疏水侧链氨基酸残基间(例如met、ala、val、leu和ile)、中性亲水侧链残基间(例如cys、ser、thr、asn和gln)、酸性侧链残基间(例如asp、glu)、碱性侧链氨基酸间(例如his、lys和arg)或方向侧链残基间(例如trp、tyr和phe)进行保守替代。本领域已知保守替代通常不会引起蛋白构象结构的显著变化，因此能够保留蛋白质的生物活性。
当“百分比序列同一性”用于氨基酸序列(或核酸序列)时，是指在进行序列比对，并且必要时引入间隔使相同氨基酸(或核酸)数目达到最多后，在候选序列中，与参比序列相同的氨基酸(或核酸)残基占所述候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。所述氨基酸残基的保守替代可以认为或可以不认为是相同残基。可以通过本领域公开的工具，例如blastn,blastp(美国国家生物技术信息中心网站(ncbi)，也可参见，altschuls.f.等、j.mol.biol.，215:403–410(1990)；stephenf.等，nucleicacidsres.，25:3389–3402(1997))、clustalw2(欧洲生物信息研究所网站，可参见，higginsd.g.等，methodsinenzymology，266:383-402(1996)；larkinm.a.等，bioinformatics(oxford、england)，23(21):2947-8(2007))和align或megalign(dnastar)软件，对序列进行比对以确定氨基酸(或核酸)序列的百分比序列同一性。本领域技术人员可以使用所述工具的默认参数或根据比对的需要适当调整参数，例如通过挑选合适的算法。
本申请中使用的“效应功能”是指抗体的fc区与其效应器例如c1复合物和fc受体结合的生物活性。示例性的效应功能包括抗体与c1复合物上的c1q相互作用诱导的补体依赖性细胞毒性(cdc)、抗体的fc区与效应细胞上的fc受体结合诱导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)以及吞噬。
对某种状况的“治疗”或“疗法”包括预防或减轻某种状况，降低某种状况兴起或发展的速度，减少发展出某种状况的风险，预防或延迟与某种状况相关的症状发展，减少或终止与某种状况相关的症状，产生某种状况的完全或部分的逆转，治愈某种状况，或以上的组合。
“被分离”的物质已经经人工由自然状态改变。如果自然界中出现某种“被分离”的物质或成分，那么其已经被改变或脱离其原始状态，或二者均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在的多核苷酸或多肽是未被分离的，但如果这些多核苷酸或多肽与之在天然状态下共存的物质足够分离并以足够纯的状态存在，则可以认为是“被分离”。在某些实施方式中，抗体和抗原结合片段的纯度为至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％，其由电泳方法(如sds-page、等电聚焦、毛细管电泳)，或色谱法(如离子交换色谱或反相hplc)确定。
本发明中“载体”是指，可将编码某蛋白的多核苷酸操作性地插入其中并使该蛋白获得表达的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1衍生的人工染色体(pac)、噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体，以及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。
本发明中“宿主细胞”是指导入外源多核苷酸和/或载体的细胞。
本发明中的“与psck9介导的疾病或症状”是指通过pcsk9的变化引起或表征的疾病或症状，如表达水平、活性的改变，和/或pcsk9的变体或突变的存在。由pcsk9介导的疾病或状况的例子包括，但不限于，血脂异常，高脂蛋白血症，高脂血症；血脂异常；高胆固醇血症、心脏病、中风、冠心病、动脉粥样硬化、周围血管病、跛行、ii型糖尿病、高血压、心血管疾病或状况、炎症或自身免疫性疾病。鉴定/诊断上述疾病或症状的方法在本领域是已知的。对于本申请的抗体或其抗原结合片段在治疗cvd(如急性心肌梗死(ami)、急性冠状动脉综合征(acs)、中风和心血管死亡)中的用途，本申请使用的“治疗有效量”或“有效剂量”是指能够在血浆或血清中降低脂质(如胆固醇)、缓解与cvd状况相关的症状或标记物、预防或延迟cvd状况的发展，或上述的组合的所述抗体或其抗原结合片段的剂量或浓度。
“药用可接受的”是指所指的载剂、溶媒、稀释剂、辅料和/或盐，总的来说在化学上和/或在物理上与制剂中的其他配料相兼容，并在生理上与接受者相兼容。
抗-pcsk9抗体
在某些实施方式中，本申请提供了示例性的全人源单克隆抗体11.4、18.156.8、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8和40409，其cdr序列如表1中所示，并且重链或轻链可变区序列也如下列出。
表1
11.4-vh:
氨基酸序列(seqidno:73):
qlnlqqsgpglvnpsqtlsltcaisggsvssnsaawnwirqspsrglewlgrtysrskwyhdyavsvkgritinpdtsknqfflqlnsvtpedtavyycardwetsiwnddgpnyynygmdvwgqgttvtvss
核酸序列(seqidno:74)
cagctaaacctgcagcagtcaggtccaggactggtgaacccctcgcagaccctctcactcacctgtgccatctccgggggcagtgtctctagcaacagtgctgcttggaactggatcaggcagtccccgtcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactccaggtccaagtggtatcatgattatgcagtatctgtgaaaggtcggataaccatcaacccagacacatccaagaaccagttcttcctgcagctgaactctgtgactcccgaagacacggctgtgtattactgtgcgagagattgggagacctctatctggaacgacgacggtcccaactactacaactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
11.4-vl:
氨基酸序列(seqidno:75):
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgirndlgwyqqkpgkapkrliygasslqsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyyclqhnnypwtfgqgtkveik
核酸序列(seqidno:76)
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagcgcctgatctatggtgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtctacagcataataattacccgtggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
18.156.8-vh
氨基酸序列(seqidno:77):
qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewmaviwydgtnkyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycarekgldwgqgtlvtvss
核酸序列(seqidno:78)
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtggatggcagttatatggtatgatggaactaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagagaaggggctggactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
18.156.8-vl
氨基酸序列(seqidno:79):
divmtqspdslavslgeratinckssqsvlysstnknylvwyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyystpwtfgqgtkveik
核酸序列(seqidno:80)
gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcaagtccagccagagtgttttatacagctccaccaataagaactacttagtttggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttactgggcatctacccgggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaatattatagtactccgtggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
15.14.2-vh
氨基酸序列(seqidno:81):
evqmlesggglvqpggslrlscavsgftfsrfamswvrqapgkgldwvssisdnagrtyfadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraddtavyycaklsnwgpygmdvwgqgttvtvss
核酸序列(seqidno:82)
gaagtgcagatgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagtctctggattcacctttagcagatttgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggactgggtctcaagtattagtgacaatgctggtaggacatacttcgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgacgacacggccgtatattactgtgcgaaactctcaaactggggtccttacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcg
15.14.2-vl
氨基酸序列(seqidno:83):
qsaltqppsasgspgqsvtisctgtssdvgyynyvswyqqhpgeapklmiyevnkrpsgvpdrfsgsksgstasltvsglqavdeadyycssyagsknfvvfgggtkltvl
核酸序列(seqidno:84)
cagtctgccctgactcagcctccctccgcgtccgggtctcctggacagtcagtcaccatctcctgcactggaaccagcagtgacgttggttattataactatgtctcctggtaccaacagcacccaggcgaagcccccaaactcatgatttatgaggtcaataagcggccctcaggggttcctgatcgcttctctggctccaagtctggcagcacggcctccctgaccgtctctgggctccaggctgtggatgaggctgattattactgcagctcatatgcaggcagcaaaaattttgtggtattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
17.72.3-vh
氨基酸序列(seqidno:85):
sqvqlqesgpglvkpsgtlsltcavsggsirsynwwswvrqppgeglewigeihhsgttnynpslksrvtisvdksknqfslklssvtaadtavyycardysgsyfdywgqgtlvtvss
核酸序列(seqidno:86)
tctcaggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggggaccctgtccctcacctgcgctgtctctggtggctccatcaggagttataactggtggagttgggtccgccagcccccaggggaggggctggagtggattggggaaatccatcatagtgggaccaccaactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatcggtagacaagtccaagaaccagttctccctgaagctgagctctgtgaccgccgcggacacggccgtgtattactgtgcgagagattatagtgggagctactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
17.72.3-vl
氨基酸序列(seqidno:87):
evvltqspatlslspgeratlscrtsqslssyvawsqqkpgqaprlliydaskratgvparfsgsgsgtdftltisnlepedfavyychqrgnwmssfgqgtkleik
核酸序列(seqidno:88)
gaggttgtgttgacacagtctcccgccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcaggaccagtcagagtctaagcagctacgtagcctggtcccagcagaagcctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaaaagggccactggcgtcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcaacctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcaccagcgtggcaactggatgtctagttttggccaggggaccaagctggagatcaaa
18.136.7-vh
氨基酸序列(seqidno:89):
qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvaiiwydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvrekgldwgqgtlvtvss
核酸序列(seqidno:90)
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctgggttcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcaattatatggtatgatggaagtaacaaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgtgagagagaaggggctggactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
18.136.7-vl
氨基酸序列(seqidno:91):
divmtqspdslavslgeratinckssqsvlyssnnknylvwyqqkpgqppklliywtstresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyystpwtfgqgtkveik核酸序列(seqidno:92)
gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcaagtccagccagagtgttttatacagctccaacaataagaactacttagtttggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttactggacatctacccgggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaatattatagtactccgtggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
19.3.8-vh
氨基酸序列(seqidno:93):
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyyinwvrqapgqglewmgrinpnsggtnyaqkfqgrvtmtrdtsintaymelsrlrsddtavyfcaswegtvttwdfyyyygmdvwgqgttvtvss
核酸序列(seqidno:94)
caggtgcagttggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttccggatacaccttcaccggctactatataaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggacggatcaaccctaacagtggtggcacaaactatgcacagaagtttcagggcagggtcaccatgaccagggacacgtccatcaacacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgacgacacggccgtgtatttctgtgcgagttgggagggaacggtgactacgtgggatttctactattactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca19.3.8-vl
氨基酸序列(seqidno:95):
qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdvdtynyvswyqhhpgkapkliifdvsnrpsgvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyycssytssstlvvfgggtkltvl
核酸序列(seqidno:96)
cagtctgccctgactcagcctgcctccgtgtctggatctcctggacagtcgatcaccatctcctgcactggaaccagcagtgacgttgatacttataactatgtctcctggtaccaacatcacccaggcaaagcccccaagctcataatttttgatgtcagtaatcggccctcaggggtttctaatcgcttctctggctccaaatctggcaacacggcctccctgaccatctctgggctccaggctgaggacgaggctgattattactgcagctcatatacaagcagcagcactctcgtggtattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
40409-vh
氨基酸序列(seqidno:97):
qlnlqqsgpglvnpsqtlsltcaisggsvssnsaawnwirqspsrglewlgriysrskwyhdyavsvkgritinpdtsknqfflqlnsvtpedtavyycardwetiiwgddgpnyynygldvwgqgttvtvss
核酸序列(seqidno:98)
cagctaaacctgcagcagtcaggtccaggactggtgaacccctcgcagaccctctcactcacctgtgccatctccgggggcagtgtctctagcaacagtgctgcttggaactggatcaggcagtccccgtcgagaggccttgagtggctgggaaggatatactccaggtccaagtggtatcatgattatgcagtatctgtgaaaggtcggataaccatcaacccagacacatccaagaaccagttcttcctgcagctgaactctgtgactcccgaagacacggctgtgtattactgtgcaagagattgggagaccattatctggggcgacgacggtcccaactactacaactacggtttggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
40409-vl
氨基酸序列(seqidno:99):
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgirndlgwyqqkpgkapkrliygasslqsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyyclqhnnylwtfgqgtkveik
核酸序列(seqidno:100)
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagcgcctgatctatggtgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtctacagcataataattacctgtggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
在一些实施方式中，本申请所述的一个或多个cdr序列可以被修饰或改变以使获得的抗体在一个或多个性质上相对原来的抗体有所改进(例如改进的抗原结合、改进的糖基化模式、降低的cdr残基上的糖基化风险、增加的药代动力学半衰期、ph敏感性和对缀合的相容性)，或与原来的抗体相当(即除上述修饰和改变外具有相同cdr序列的抗体)，或至少实质上保留了原来的抗体的抗原结合特性。
本领域技术人员应理解可以将表1中提供的cdr序列进行修饰以包含一个或更多氨基酸的取代，由此得到提高的生物学活性例如提高的与人pcsk9的结合亲和性。例如，可以利用噬菌体展示技术生产并表达抗体变体库(例如fab或fcfv变体)，随后筛选与人pcsk9有亲和性的抗体。另一个例子中，可以用计算机软件模拟所述抗体与人pcsk9的结合并鉴别抗体上形成结合界面的氨基酸残基。可以避免这些残基的替代以防止结合亲和性降低，或可以靶向这些残基进行替代以形成更强的结合。在某些实施方式中，cdr序列中的至少一个(或全部)取代是保守替代。
在某些实施方式中，所述抗体和抗原结合片段包括一个或多个cdr序列，这些序列具有与表1中所列的序列至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性，并且同时保留了与其亲本抗体相似或甚至高于其的与人pcsk9的结合亲和性，所述亲本抗体具有基本相同的序列，但其相应的cdr序列与表1所列的序列具有100％序列同一性。
在某些实施方式中，所述抗-pcsk9抗体和其抗原结合片段是全人源的。这些全人源抗体保留了与人pcsk9的结合亲和性，优选地与示例性抗体：11.4、18.156.8、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8和40409的水平相似。
本申请还包括了与本申请抗-pcsk9抗体和其抗原结合片段竞争相同表位的抗体和其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述抗体以低于10-6m、低于10-7m、低于10-7.5m、低于10-8m、低于10-8.5m或低于10-9m或低于10-10m的ic50值(即半数抑制浓度)阻断11.4、18.156.8、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8和40409与人或猴pcsk9的结合。ic50值通过竞争性测试例如elisa测定和放射性配体竞争结合测定法。
在一些实施方式中，本申请所述抗-pcsk9抗体和其抗原结合片段能够以不超过10-8m、不超过10-9m或不超过10-10m(例如≤2.5x10-8m、≤2x10-8m、≤7.5x10-9m、≤3.5x10-9m、≤7x10-10m、≤6x10-10m、≤5x10-10m、≤2.5x10-10m、≤2x10-10m、≤1.5x10-10m、≤7.5x10-11m、≤6.5x10-11m或≤5.5x10-11m)的结合亲和性(kd)与人pcsk9和/或猴pcsk9特异性结合，其通过表面等离子共振结合法或elisa测量。结合亲和性可以用kd值表示，其通过当抗原和抗原结合分子的结合达到平衡时的解离速率与结合速率的比值(koff/kon)计算得到。所述抗原结合亲和性(例如kd)可以通过本领域已知的适宜方法适宜地确定，所述方法包括使用仪器如如biacore的表面等离子共振结合法(参加例如murphy,m.etal,currentprotocolsinproteinscience,chapter19,unit19.14,2006)。
在某些实施方式中，本申请所述抗体和其抗原结合片段与人pcsk9以0.01nm-0.2nm(例如0.02nm-0.2nm、0.02nm-0.15nm、0.02nm-0.05nm、0.01nm-0.05nm或0.02nm-0.3nm)的ec50(即半数结合浓度)结合。所述抗体与人pcsk9的结合可以通过本领域已知的方法如夹心法如elisa，western印迹或其他结合试验测定。在示例性的例子中，将待测抗体(即一抗)与固定化的人pcsk9结合，随后洗掉未结合抗体，引入标记的二抗，其能够与一抗结合因此能够检测出结合的一抗。当使用固定化的pcsk9时可在酶标仪板上进行所述检测。
在某些实施方式中，本申请所述抗体和其抗原结合片段以0.5nm-3nm(例如0.5nm-2.5nm、1nm-2.5nm、1nm-2nm或1nm-1.5nm)的ic50抑制人pcsk9与其配体的结合，其通过竞争性测试测得。
在某些实施方式中，所述抗体和其抗原结合片段与猴pcsk9以与人pcsk9相似的结合亲和性结合。例如，示例性抗体11.4、18.156.8、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8和40409与猴pcsk9以与人pcsk9相似的亲和性或ec50值结合。
在一些实施方式中，所述的抗-pcsk9抗体和其抗原结合片段还包括免疫球蛋白恒定区。在一些实施方式中，免疫球蛋白恒定区包括重链和/或轻链恒定区。所述重链恒定区包括ch1、ch1-ch2或ch1-ch3区。在一些实施方式中，所述恒定区还可以包括一个或多个修饰以得到需要的性质。例如，所述恒定区可以被修饰以减少或耗竭一个或多个效应功能，以增强fcrn受体结合，或引入一个或多个半胱氨酸残基。在一些实施方式中，所述的抗-pcsk9抗体和其抗原结合片段具有igg4同种型的恒定区，其具有降低的或耗竭的效应功能。已知有许多测试用来评估adcc或cdc活性，例如fc受体结合试验、补体c1q结合实验和细胞裂解法，本领域技术人员能够容易选择。
在一些实施方式中，所述抗体和其抗原结合片段可以用作抗体-药物缀合物、双特异性或多价抗体的基础分子。
本申请所述的抗-pcsk9抗体和其抗原结合片段可以是单克隆抗体、多克隆抗体、全人源抗体、全人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、双特异性抗体、标记抗体、二价抗体或抗独特型抗体。重组抗体是在体外使用重组方法而非动物制备的抗体。双特异性抗体或双价抗体是具有两种不同的单克隆抗体的片段的人工抗体，其能结合两种不同的抗原。“二价”的抗体和其抗原结合片段包括两个抗原结合位点。两个抗原结合位点可以结合相同抗原，或者可以各自结合到不同的抗原，在这种情况下，抗体或抗原结合片段为“双特异性”。
在一些实施方式中，本申请所述的抗-pcsk9抗体和其抗原结合片段是全人源抗体。在一些实施方式中，使用重组方法制备所述全人源抗体。例如，可以制备转基因动物如小鼠，使其携带人源免疫球蛋白基因的转基因或转染色体，并因此在用适宜的抗原如人源pcsk9免疫后能够生产全人源抗体。全人源抗体可以从这样的转基因动物中分离，或另选地，可以通过杂交瘤技术制备，将所述转基因动物的脾细胞与永生细胞系融合以生成分泌所述全人源抗体的杂交瘤细胞。示例性的转基因动物包括但不限于，omni大鼠，其内源性大鼠免疫球蛋白基因的表达被失活并同时被基因工程化以包含功能性的重组人源免疫球蛋白基因座；omni小鼠，其内源性小鼠免疫球蛋白基因的表达被失活并同时被基因工程化以包含具有j-基因座缺失和c-kappa突变的重组人源免疫球蛋白基因座。omnifilc，其为转基因大鼠，其内源性大鼠免疫球蛋白基因的表达被失活，并同时被基因工程化以包含具有单个的共有的、重组的vkjk轻链和功能性重链的重组人源免疫球蛋白基因座。具体信息请进一步参见：osbornm.etal,journalofimmunology,2013,190:1481-90；mab.etal,journalofimmunologicalmethods400–401(2013)78-86；geurtsa.etal,science,2009,325:433；美国专利8,907,157；欧洲专利2152880b1；欧洲专利2336329b1，其均通过引用整体并入本申请。也可使用其他适宜的转基因动物，例如，humab小鼠(具体参见lonberg,n.etal.nature368(6474):856859(1994)),xeno-小鼠(mendezetal.natgenet.,1997,15:146–156),transchromo小鼠(ishidaetal.cloningstemcells,2002,4:91–102)和velocimmune小鼠(murphyetal.procnatlacadsciusa,2014,111:5153–5158),kymouse转基因小鼠(leeetal.natbiotechnol,2014,32:356–363)，和转基因兔(flisikowskaetal.plosone,2011,6:e21045)。
在一些实施方式中，本申请所述的抗-pcsk9抗体和其抗原结合片段是骆驼化单域抗体(camelizedsinglechaindomainantibody)、双功能抗体(diabody)、scfv、scfv二聚体、bsfv、dsfv、(dsfv)2、dsfv-dsfv'、fv片段、fab、fab'、f(ab')2、ds双功能抗体(dsdiabody)、纳米抗体、域抗体或双价域抗体。
在某些实施方式中，所述抗-pcsk9抗体及其抗原结合片段进一步包含缀合物。可以设想，本发明中的抗体或其抗原结合片段可与多种缀合物连接(见例如"conjugatevaccines"、contributionstomicrobiologyandimmunology、j.m.cruseandr.e.lewis、jr.(eds.)、cargerpress、newyork、(1989))。这些缀合物可以通过共价结合、亲和结合、嵌入、同等结合(coordinatebinding)、络合、结合、混合或加入等其他方式与所述抗体或抗原结合物连接。在某些实施方式中，本发明公开的抗体和抗原结合片段可以通过工程的方法使其含有表位结合部分以外的特定位点，这些位点可用来结合一种或多种缀合物。例如，这样的位点可包含一种或多种反应性氨基酸残基，例如半胱氨酸残基和组氨酸残基，用于协助与结合物的共价连接。在某些实施方式中，抗体可间接连于缀合物，或通过另一个缀合物相连。例如，所述抗体或其抗原结合片段可结合生物素，然后间接结合第二个缀合物，其与亲和素相连。所述缀合物可以是可检测的标记、药代动力学修饰部分、纯化部分或细胞毒性部分。可检测的标记的例子可以包括荧光标记(例如荧光素、罗丹明、丹酰、藻红蛋白或德克萨斯红)、酶-底物标记物(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-d-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如、123i、124i、125i、131i、35s、3h、111in、112in、14c、64cu、67cu、86y、88y、90y、177lu、211at、186re、188re、153sm、212bi、and32p、其他镧系元素、发光标记)、发色团部分、地高辛、生物素/亲和素、dna分子或金以进行检测。在某些实施方式中，所述缀合物可以是药代动力学修饰部分如peg，其帮助延长抗体的半衰期。其他适宜的聚合物包括例如羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇共聚物等。在某些实施方式中，所述缀合物可以是纯化部分例如磁珠。“细胞毒性部分”可以是对细胞有害的或可能损坏或杀死细胞的任何试剂。细胞毒性部分的示例包括，但不限于，紫杉醇、细胞松弛素b、短杆菌肽d、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素d、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴)、烷化剂(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(bsnu)和洛莫司汀(ccnu)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素c和顺-二氯二胺铂(ii)(ddp)顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(amc))以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
多核苷酸和重组方法
本申请提供了编码抗-pcsk9抗体和其抗原结合片段的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸包括一个或多个如表1中的核苷酸序列，其编码如表1中的cdr序列。
在一些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码重链可变区并包括选自下组的序列：seqidno:26、seqidno:30、seqidno:34，以及与之具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性的同源序列。在一些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码轻链可变区并包括选自下组的序列：seqidno:28、seqidno:32、seqidno:36，以及与之具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性的同源序列。在某些实施方式中，所述一致性的百分比是源自遗传密码的简并性，而编码的蛋白序列保持不变。
使用本领域公知的重组技术，可以将包括编码所述抗-pcsk9抗体和其抗原结合片段(例如包括表1所示的序列)的多核苷酸的载体引入宿主细胞用于克隆(扩增dna)或基因表达。在另一实施方式中，所述抗体可通过本领域公知的同源重组的方法制得。编码所述单克隆抗体的dna可以通过常规的方法分离和测序(如可以使用寡核苷酸探针，该探针可特异性与编码所述抗体的重链和轻链的基因结合)。多种载体可供选择。载体组分通常包括，但不限于，以下的一种或多种：信号序列、复制起始点、一种或多种标记基因、增强序列、启动子(例如：sv40、cmv、ef-1α)和转录终止序列。
在一些实施方式中，所述载体系统包括哺乳动物、细菌、酵母系统等，并将包括质粒例如但不限于palter、pbad、pcdna、pcal、pl、pet、pgemex、pgex、pci、pcmv、pegfp、pegft、psv2、pfuse、pvitro,pvivo、pmal、pmono、pselect、puno、pduo、psg5l、pbabe、pwpxl、pbi、p15tv-l、ppro18、ptd、prs420、plexa、pact2等其他可从实验室获得或市售的载体。适宜的载体可以包括质粒或病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
可以将包括编码所述抗体和其抗原结合片段的多核苷酸的载体引入宿主细胞用于克隆或基因表达。本发明中适用于克隆或表达所述载体中的dna的宿主细胞为原核细胞、酵母或上述高级真核细胞。适用于本发明用途的原核细胞包括真细菌如，革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如，肠杆菌科，如，大肠杆菌，肠杆菌属，欧文氏菌属，克雷白氏杆菌属，变形杆菌属，沙门氏菌属，如，鼠伤寒沙门(氏)杆菌，沙雷氏菌属，如，粘质沙雷氏菌，以及志贺氏菌属，及杆菌属如，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，假单胞菌如，绿脓杆菌和链霉菌。
除了原核细胞以外，真核微生物如丝状真菌或酵母也可作宿主细胞克隆或表达编码抗pcsk9抗体的载体。酿酒酵母，或面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。但是，许多其他属、种和株都比较常用且在本发明中适用，如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母属宿主如，乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(atcc12,424)、保加利亚克鲁维酵母(atcc16,045)、魏氏克鲁维酵母(atcc24,178)、克鲁雄酵母(atcc56,500)、果蝇克鲁维酵母(atcc36,906)、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母；解脂耶氏酵母(ep402,226)；巴斯德毕赤酵母(ep183,070)；假丝酵母；里氏木霉(ep244,234)；链孢霉；西方许旺酵母，如：西方许旺酵母；和丝状真菌，如：脉孢菌、青霉菌、弯颈霉和曲霉菌，如：钩巢曲霉和黑曲霉。
本发明中提供的适用于表达糖基化抗体或其抗原结合片段的宿主细胞由多细胞生物衍生得到。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已发现多种杆状病毒株(baculoviralstrains)及其变体以及对应的许可性昆虫宿主细胞(permissiveinsecthostcells)，来自于诸如以下的宿主：草地夜蛾(毛虫)、埃及斑蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)及家蚕。多种用于转染的病毒株为公众可得，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒的bm-5变种，这些病毒都可在本发明中使用，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛花、西红柿和烟草的植物细胞培养也可用作宿主。
但是，最感兴趣的是脊椎细胞，且脊椎细胞的培养(组织培养)已经成为常规操作。可用的哺乳动物宿主细胞实例有，sv40转化的猴肾细胞cv1系(cos-7,atcccrl1651)；人胚胎肾细胞系(293或悬浮培养的293细胞亚克隆，grahametal.,j.genvirol.36:59(1977))；幼地鼠肾细胞(bhk，atccccl10)；中国仓鼠卵巢细胞/-dhfr(cho，urlaubetal.,proc.natl.acad.sci.usa77:4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(tm4，mather,biol.reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(cv1atccccl70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76，atcccrl-1587)；人宫颈癌细胞(hela，atccccl2)；犬肾细胞(mdck，atccccl34)；布法罗大鼠肝细胞(brl3a，atcccrl1442)；人肺细胞(w138，atccccl75)；人肝细胞(hepg2，hb8065)；小鼠乳腺瘤(mmt060562，atccccl51)；tri细胞(mather等，annalsn.y.acad.sci.383:44-68(1982))；mrc5细胞；fs4细胞；及人肝癌细胞系(hepg2)。在某些优选的实施方式中，所述宿主细胞是293f细胞。
用上述的可产生抗pcsk9抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将其在常规的营养培养基中培养，所述营养培养基经修饰后适宜于诱导启动子、选择转化细胞或扩增编码目的序列的基因。
本发明中用于产生所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基如ham'sf10(sigma)、最低基本培液(mem，(sigma))、rpmi-1640(sigma)及dulbecco'smodifiedeagle'smedium(dmem)，sigma)可用于培养所述宿主细胞。另外，任何在hametal.,meth.enz.58:44(1979),barnesetal.,anal.biochem.102:255(1980),美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；wo90/03430；wo87/00195；或美国专利申请re.30,985中说明的培养基都可以用作所述宿主细胞的培养基。这些培养基都可添加必要的激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、氯化钙、氯化镁和磷酸盐)、缓冲液(如hepes)、核苷酸(如腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(如庆大霉素)、微量元素(定义为终浓度通常在微摩尔范围无机化合物)，和葡萄糖或与之等同的能量源。所述培养基还可含有本领域公知的适当浓度的任何其他必要的添加剂。所述培养基的条件，如温度、ph值等类似条件，为选择用于表达的宿主细胞此前所使用的条件，为普通技术人员所熟知。
在使用重组技术时，所述抗体可在胞内、壁膜空间生成，或直接分泌到培养基中。如果所述抗体在胞内生成，首先除去宿主细胞或裂解片断的颗粒残骸，例如，可通过离心或超声的方法。carteretal.,bio/technology10:163-167(1992)描述了将分泌到大肠杆菌壁膜空间的抗体分离的方法。简要地说，在醋酸钠(ph3.5)、edta和苯甲磺酰氟(pmsf)存在的条件下化开细胞糊(cellpaste)约30分钟以上。离心除去细胞碎片。如所述抗体分泌到培养基中，则通常首先使用市售的蛋白浓度过滤器，如amicon或milliporepelliconultrafiltrationunit，浓缩该表达系统的上清液。在任何前述的步骤中都可加入蛋白酶抑制剂如pmsf以抑制蛋白降解，以及抗生素以防止偶然污染物的生长。
从所述细胞中制得的抗体可采用纯化方法进行纯化，例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、deae-纤维素离子交换色谱柱、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱，其中亲合色谱为优选的纯化技术。所述抗体的种类以及所述抗体中存在任何免疫球蛋白的fc结构域决定了蛋白a作为亲和配体是否适合。蛋白a可用于纯化基于人γ1，γ2或γ4重链的抗体(lindmarketal.,j.immunol.meth.62:1-13(1983))。蛋白g适用于所有鼠源异构体和人γ3(gussetal.,emboj.5:15671575(1986))。琼脂糖是最常用的亲和配体附着基质，但也可选用其他基质。机械力稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯与用琼脂糖相比可实现更快的流速和更短的处理时间。如该抗体含有ch3结构域，则可用bakerbondabx.tm树脂进行纯化(j.t.baker,phillipsburg,n.j.)。也可根据需要获得的抗体确定其他蛋白纯化的技术，如离子交换柱中的分馏、乙醇沉淀、反相hplc、硅胶色谱、基于阴离子或阳离子交换树脂的肝素琼脂糖凝胶色谱(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、sds-page、以及硫酸铵沉淀。
在任意初步纯化步骤之后，可用低ph疏水相互作用色谱的方法处理含有感兴趣的抗体和杂质的混合物，用ph约2.5-4.5的洗涤缓冲液，优选地在低盐浓度下进行(例如，从约0到0.25m盐浓度)。
试剂盒
本申请提供了包括所述抗-pcsk9抗体和其抗原结合片段的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒用于检测在生物样品中的pcsk9的存在情况或水平。所述生物样品可以包括血清。在一些实施方式中，所述试剂盒包括与可检测标记缀合的抗-pcsk9抗体和其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述试剂盒包括未标记的抗-pcsk9抗体和其抗原结合片段，并进一步包括能够与未标记的抗-pcsk9抗体和其抗原结合片段结合标记的二抗。所述试剂盒可以进一步包括使用说明和在试剂盒中将每个组件分隔开的包装。
在一些实施方式中，所述试剂盒用于治疗、预防或延迟由pcsk9介导的疾病或状况。在一些实施方式中，所述抗-pcsk9抗体和其抗原结合片段与底物或仪器连接用于夹心测定如elisa或免疫色谱测定。适用的底物或仪器可以是例如微孔板和试纸。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括一种或多种已知对降低胆固醇有益的试剂。示例性的试剂包括他汀类药物、他汀类以外的hmg-coa还原酶抑制剂，烟酸(尼克酸)、胆固醇吸收抑制剂、胆固醇酯转移蛋白(cetp)、胆汁酸螯合剂、贝特类、植物甾醇；或选自小分子的脂质/脂质浓度比的调节剂、拟肽、反义rna、小干扰rna(sirna)和天然或改性脂。在某些实施方式中，胆固醇吸收抑制剂是依折麦布或sch-48461；cetp是evacetrapib，anacetrapib或dalcetrapib；胆汁酸螯合剂优选考来维仑，消胆胺或贝特类降脂宁优选非诺贝特，吉非贝齐，安妥明，或苯扎贝特；或上述试剂的组合。
药物组合物和治疗方法
本申请进一步提供了包括所述抗-pcsk9抗体和其抗原结合片段的药物组合物和一个或多个药学上可接受的载体。
用在本申请公开的药物组合物中的药用可接受载剂可包括，例如，药用可接受的液体、凝胶或固体载剂、水相介质、非水相介质、抗微生物物质、等渗物质、缓冲液、抗氧剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、螯合剂、稀释剂、佐剂、辅料或无毒辅助物质，其他本领域公知的组分或以上的多种组合。
适用的组分可包括，例如，抗氧剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、搅味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂例如糖和环糊精。适用的抗氧剂可包括，例如，甲硫氨酸、抗坏血酸、edta、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙酸、巯基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本发明所公开，在一种含有本发明公开的抗体或其抗原结合片段的组合物中包括一种或多种抗氧剂如甲硫氨酸，可将降低所述抗体或其抗原结合片段的氧化。对氧化作用的减少可防止或减少结合亲和力的降低，从而提高抗体稳定性并延长保质期。因此，在某些实施方式中，本发明提供的组合物中含有一种或多种所述的抗体或其抗原结合片段以及一种或多种抗氧剂例如甲硫氨酸。本发明进一步提供了多种方法，通过将本发明中提供的抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧剂混合，例如甲硫氨酸，可防止所述抗体或其抗原结合片段氧化、延长其保质期和/或提高其活性。
进一步的说，药用可接受的载剂可包括，例如，水相介质如氯化钠注射液、林格氏液注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、或葡萄糖和乳酸林格注射液、非水介质例如：植物来源的不挥发性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或者花生油、细菌抑制或真菌抑制浓度下的抗菌物质、等渗剂如：氯化钠或葡萄糖、缓冲液如：磷酸盐或枸橼酸酸盐缓冲液，抗氧化剂如：硫酸氢钠，局部麻醉剂如：盐酸普鲁卡因，助悬剂和分散剂如：羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如：聚山梨醇酯80(吐温-80)、螯合试剂如edta(乙二胺四乙酸)或egta(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。作为载剂的抗菌剂可加入多次剂量容器中的药物组合物中，其包括酚类或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯代丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷铵和氯苯乙铵。适用的辅料可包括，例如，水、盐、葡萄糖、甘油或乙醇。适用的无毒辅助物质可包括，例如，乳化剂、ph值缓冲剂、稳定剂、增溶剂，或者醋酸钠、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或者环糊精之类的物质。
所述药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、丸剂、胶囊、片剂、持续释放制剂或粉末。口服制剂可以包括标准载体如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
在某些实施方式中，所述药物组合物被制剂成可注射的组合物。可注射的药物组合物可以任何常规的形式制备，例如，液体溶剂、悬浮剂、乳化剂或适用于产生液体溶剂、悬浮剂或乳化剂的固体形式。注射制剂可包括现用的无菌和/或无热原溶液、使用前现与溶剂结合的无菌干燥的可溶物，如冻干粉，包括皮下片、注射即用的无菌悬浮剂、使用前现与介质结合的无菌干燥不溶产品，和无菌和/或无热原的乳剂。溶剂可以为水相或非水相。
在某些实施方式中，单位剂量的注射制剂包装在一个安瓿、一支管或一支带有针的针筒中。本领域习知，所有注射给药的制剂应为无菌无热原。
在某些实施方式中，通过将本申请公开的抗体或其抗原结合片段溶解于某适当的溶剂中可制备无菌冻干的粉末。所述溶剂可含有一种可提高粉或由粉末制得的重组溶液的稳定性，或改善粉末或重组溶液的其他药理组分。适用的辅料包括，但不限于，水、葡萄糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他适用的物质。溶剂可含有缓冲液，如枸橼酸缓冲液、磷酸钠或磷酸钾缓冲液或其他本技术熟练人员公知的缓冲液，在一种实施方式中，缓冲液的ph为中性。在本领域公知的标准条件下进行对所述溶解进行随后的过滤除菌，然后冻干制得理想的制剂。在一种实施方式中，将所得的溶剂分装至小管中冻干。每支小管可容纳单次剂量或多次剂量的所述抗-pcsk9抗体或其抗原结合片段或其组合物。每支小管中的装入量可略微高于每次剂量所需或多次剂量所需(例如10％过量)，从而保证取样精确和给药精确。冻干粉可在适当的条件下储存，如在约4℃到室温范围。
用注射用水将冻干粉重溶得到用于注射给药的制剂。在一种实施方式中，可将冻干粉加至无菌无热原水或其他适用的液体载剂中重溶。精确的量由选择的疗法决定，可根据经验值决定。
还提供了治疗方法，包括将治疗有效量的本申请所述的抗体或其抗原结合片段施用给需要其的受试者，由此治疗或预防与pcsk9相关的状况或病症。在另一方面，还提供了治疗会从上调的免疫响应获益的受试者的状况的方法，包括对所述需要其的受试者施用治疗有效量的本申请所述的抗体或其抗原结合片段。
本申请中提供的抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量依赖于本领域公知的多种因素，例如体重、年龄、过往病史、现用治疗、对象的健康状况和交叉感染的潜力、过敏、超敏和副作用，以及给药途径和肿瘤发展的程度。本领域熟练人员(例如医生或兽医)可根据这些或其它条件或要求按比例降低或升高剂量。
在某些实施方式中，本发明提供的抗体或其抗原结合片段可在治疗有效剂量约0.01mg/kg到约100mg/kg之间给药(例如，约0.01mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg)。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以约50mg/kg或更少的剂量给药，在某些实施方式中，给药剂量为10mg/kg或更少、5mg/kg或更少、3mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少或0.1mg/kg或更少。某特定剂量可在多个间隔给药，例如每天一次、每天两次或更多、每月两次或更多、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或每两月或更多月一次。在某些实施方式中，给药剂量可随治疗进程变化。例如，在某些实施方式中，初始给药剂量可比后续给药剂量高。在某些实施方式中，给药剂量在治疗进程中根据给药对象的反应进行调整。
给药方案可通过调整达到最优反应(如治疗反应)。例如，可进行单剂量给药或在一段时间分多个分隔的剂量给药。
本发明中公开的抗体和抗原结合片段可通过本领域公知的给药方式给药，例如注射给药(如，皮下注射、腹腔注射、静脉注射，包括静脉滴注，肌肉注射或皮内注射)或非注射给药(如，口服给药、鼻腔给药、舌下给药、直肠给药或外用给药)。
使用方法
本申请进一步提供了使用所述抗-pcsk9抗体或其抗原结合片段的方法。
在一些实施方式中，本申请提供了在个体中治疗pcsk9介导的状况或病症的方法，包括施用治疗有效量的本申请所述的pcsk9抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述个体被鉴定为患有可能对pcsk9抑制剂响应的病症或状况。在某些实施方式中，所述个体处于具有或发展由pcsk9介导的疾病或状况的风险，所述pcsk9介导的疾病或状况表现出一种或多种所述疾病或状况的症状，如超重、具有升高的胆固醇水平、具有编码ldl-r或apob的基因的遗传性突变或具有此类疾病或状况的家族病史。在某些实施方式中，所述个体在治疗中对另一种降低胆固醇的试剂(例如，他汀类药物)是抵抗的或不耐受的，因此在该治疗中胆固醇水平不能被有效地降低到可接受的水平。在某些实施方式中，所述由pcsk9介导的疾病或状况包括感染性疾病，如严重蜂窝织炎、肠胃炎、败血症、肺炎、皮肤和软组织感染、肾盂肾炎、病毒感染，例如，乙型肝炎、丙型肝炎、疱疹病毒的病毒感染、epstein-barr病毒、艾滋病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒i型、单纯疱疹病毒2型、人乳头状瘤病毒、腺病毒、卡波西西肉瘤相关疱疹病毒流行病、薄环病毒(torquetenovirus)、jc病毒或bk病毒，或包括炎性疾病，如阿尔茨海默氏症、强直性脊柱炎、关节炎(骨关节炎、类风湿关节炎(ra)、牛皮癣性关节炎)、哮喘、动脉粥样硬化、克罗恩病、结肠炎、皮炎、憩室炎、纤维肌痛、肝炎、肠易激综合征(ibs)、系统性红斑狼疮(sle)、肾炎、帕金森氏病和溃疡性结肠炎。
在目标生物组织中ldl-c的存在情况和水平可以指示所述生物样品来源的个体是否可能对pcsk9抑制剂响应。可以使用多种方法在来自所述个体的待测生物样品中确定ldl-c的存在情况或水平。在美国使用毫克(mg)每分升(dl)血液测量胆固醇水平，而在加拿大和许多欧洲国家则使用毫摩(mmol)每升(l)血液测量。
在一些实施方式中，在所述待测生物样品中ldl-c、总胆固醇或非hdl-c的存在或水平上调表示响应的可能性。本申请使用的术语“上调”是指与使用相同抗体检测的参照样品中胆固醇水平相比，使用本申请所述的抗体或其抗原结合片段在待测样品中检测的胆固醇水平的总的增加不少于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多。所述参照样品可以是从健康或无疾病的个体中获得的对照样品，或从待测样品来源的个体中获得的健康或无疾病的样品。
本发明公开的抗体和抗原结合片段可单独给药或与一种或多种其他治疗手段或物质联合给药。例如，本发明公开的抗体和抗原结合片段可与他汀类药物、他汀类以外的hmg-coa还原酶抑制剂，烟酸(尼克酸)、胆固醇吸收抑制剂、胆固醇酯转移蛋白(cetp)、胆汁酸螯合剂、贝特类、植物甾醇；或选自小分子的脂质/脂质浓度比的调节剂、拟肽、反义rna、小干扰rna(sirna)和天然或改性脂。在某些实施方式中，胆固醇吸收抑制剂是依折麦布或sch-48461；cetp是evacetrapib，anacetrapib或dalcetrapib；胆汁酸螯合剂优选考来维仑，消胆胺或贝特类降脂宁优选非诺贝特，吉非贝齐，安妥明，或苯扎贝特；或上述试剂的组合进行联用。
在某些这样的实施方式中，本发明公开的抗体和抗原结合片段与一种或多种上述治疗物质联用时，可与所述的一种或多种治疗物质同时给药，在某些这样的实施方式中，所述的抗体和抗原结合片段可作为同一个药物组合物的一部分同时给药。但是，与其他治疗物质“联用”的抗体和抗原结合物不需要同时给药或与该治疗物质在同一组合物中给药。本发明中“联用”的含义还包括在另一个治疗物质之前或之后给药的抗体和抗原结合物也被认为是与该治疗物质“联用”，即使所述抗体或其抗原结合片段与第二种物质通过不同给药方式给药。在可能的情况下，与本发明公开的抗体或其抗原结合片段联用的其他治疗物质可参照该其他治疗物质的产品说明书的方法用药，或参照外科医生的案头参考书2003(physicians'deskreference，57thed；medicaleconomicscompany；isbn:1563634457；第57版(2002年11月))，或参照其他本领域公知的方法。
以下实施例旨在更好地说明本发明，且不应理解为限制本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法，其整体或部分，都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制本发明，而只是为说明特定的实施方式在本发明的范围内。本领域熟练技术人员可不添加创造性及不偏离本发明范围而开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，在对本发明的方法作出的多种改动可以仍然包括在本发明范围内。发明人意在将这样的变动包括在本发明的范围内。
实施例1：抗原和其他蛋白的产生
1.1人源和鼠源pcsk9
将人和鼠的pcsk9基因分别组装到pcdna3.3载体，c端融合了6-his标签或鼠源fc标签。用转染试剂plasfect(biolineusa,bio-46026)，将这些质粒分别转染到hek293细胞。转染后收集细胞上清。his标签蛋白通过ni柱(qiageninc)纯化，鼠源fc融合蛋白通过proteina柱(mabselectsure,ge)纯化。
1.2人源ldl-r
将ldl-r胞外区基因组装到pcdna3.3载体，c端融合了6-his标签。用转染试剂plasfect(biolineusa,bio-46026)，将这些质粒转染到hek293细胞。转染后收集细胞上清，ldl-r蛋白第一步用ni柱(qiageninc)纯化，第二步用离子交换柱纯化。
1.3参照抗体
参照抗体bmk.115的序列是基于美国专利号8889834b2中的21b12序列。将含有重链和轻链的质粒共转染到hek293细胞。转染后收集细胞上清，抗体通过proteina柱(mabselectsure,ge)纯化。
实施例2：抗体的产生
2.1免疫
用含有人源免疫球蛋白可变区基因的转基因大鼠
2.2血清效价检测
使用酶联免疫吸附法(elisa)检测大鼠血清效价。先用ph值9.2的包被液将人源pcsk9蛋白稀释至1μg/ml，加入到酶标板(nunc)中，4℃过夜孵育。洗板后封闭，每孔加入200μl封闭液1xpbs/2％bsa，室温静置孵育1小时。起始孔加入稀释100倍的大鼠血清，然后用封闭液以3倍的比例进行连续梯度稀释，室温静置孵育1小时。洗板后加入山羊抗大鼠igg1和山羊抗大鼠igg2b的hrp酶标二抗混合物(bethyl)，室温静置孵育1小时。洗板后加入tmb底物显色液，然后用2m盐酸终止显色。使用酶标仪(moleculardevice)读取在450nm处的吸光值。
2.3动物免疫与杂交瘤的产生
选取滴度达到要求的大鼠，取出淋巴结和脾脏，转移至组织研磨器中研磨。100目筛网过滤后计数b细胞。骨髓瘤p3细胞用培养基调整至适当的体积后计数。将两种细胞按照b细胞:p3＝1:1数目重悬并混匀。细胞悬浮液加入融合槽内进行电融合(btxecm2001).融合后将细胞转移至含有1/2ha培养基中，按每板5x105个细胞的密度铺板。
免疫后的动物血清中抗原特异性抗体的滴度用elisa进行检测。挑选出滴度达到312500的大鼠进行融合产生杂交瘤细胞。
2.4杂交瘤筛选
elisa法检测结合：先用ph值9.2的包被液将链霉亲和素(streptavidin)稀释至1μg/ml，加入到96孔酶标板中(nunc)，4℃过夜孵育。封闭洗板后加入生物素标记的人源pcsk9蛋白，浓度为250ng/ml，室温静置孵育1小时。洗板后加入杂交瘤细胞上清，室温静置孵育1小时。洗板后加入山羊抗大鼠igg1和山羊抗大鼠igg2b的hrp酶标二抗(bethyl)混合物，室温孵育45分钟。洗板后加入tmb底物显色液，用2m盐酸终止显色，然后使用酶标仪(moleculardevice)读取在450纳米处的吸光值。
竞争elisa：酶标板(nunc)中加入ldl-r，4℃过夜孵育。同时将杂交瘤细胞上清与生物素标记的人pcsk9蛋白混合，pcsk9蛋白的终浓度为250ng/ml，4℃过夜孵育。酶标板洗板封闭后，加入杂交瘤细胞上清与pcsk9蛋白的混合物，室温静置孵育1小时。洗板后加入hrp标记的链霉亲和素。最后加入tmb底物显色液，并用2m盐酸终止显色，然后使用酶标仪(moleculardevice)读取在450纳米处的吸光值。
抗体筛选
首轮筛选用杂交瘤培养上清进行抗原结合检测。4次融合共筛选出13000个与抗原有特异性结合的杂交瘤。对这些杂交瘤细胞株进行进一步的竞争实验的筛选。通过竞争elisa的筛选得到104株杂交瘤细胞，其分泌的抗体可以阻断人源pcsk9与人源ldl-r的结合。将这些能够结合抗原并有阻断功能的抗体从杂交瘤细胞上清中纯化出来。同时对这些杂交瘤细胞株进行亚克隆。亚克隆用结合和竞争elisa进行检测，并对其亚型进行鉴定。
纯化后的抗体进行细胞ldl吸收实验。结合与阻断活性也会用纯化的抗体进行进一步检测。最终的候选克隆是根据结合的亲和力，阻断pcsk9结合ldl-r的能力以及恢复细胞ldl吸收的能力选定的。
2.5杂交瘤细胞亚克隆
将选取的杂交瘤细胞株按照每孔0.5个、1个和5个细胞的密度铺到96孔板中。选出其中的单克隆孔用elisa进行检测。每个杂交瘤细胞株保留并冻存3个亚克隆。
2.6抗体亚型检测
用elisa鉴定抗体同种型(见表2)。分别用包被液将山羊抗大鼠igg1、igg2a、igg2b、igg2c、igm的抗体(bethyl)稀释至1μg/ml，加入到96孔酶标板(nunc)中，4℃过夜孵育。洗板封闭后，加入杂交瘤细胞培养上清，室温静置孵育1小时。洗板后分别加入山羊抗人kappa链酶标二抗(southernbiotech)，或山羊抗人lambda链酶标二抗(southernbiotech)，室温静置孵育45分钟。洗板后加入tmb底物显色液，用2m盐酸终止显色后使用酶标仪(moleculardevice)读取在450纳米处的吸光值。
表2.抗体亚型
2.7抗体纯化
将收集的杂交瘤上清调节ph到7.0后，上样到proteina柱(mabselectsure,ge)。抗体用glycine洗脱，并立即用1mtris中和。纯化后的蛋白浓度用nanodrop(thermal-fisher)检测。蛋白的纯度通过sds-page(invitrogen,nupage4％-12％bis-trisgel)和hplc-sec(agilent)检测。
实施例3：全人源抗体的产生
3.1杂交瘤测序
采用trizol试剂盒(invitrogen-15596018)从杂交瘤细胞中提取rna，再利用5’-race试剂盒(takara-28001488)扩增得到cdna，然后通过3’-简并引物和3’-接头引物(extaq:takara-rr001b)扩增cdna。将扩增得到的片段插入到pmd18-t载体(takara-d101c)并送测序(上海铂尚公司)。
选择的抗体11.4、18.156.8、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8和40409的可变区序列(氨基酸序列和核酸序列)如seqidno:73-100所示。
3.2全人源抗体的表达与纯化
将每一个抗体(人-鼠嵌合抗体)可变区基因序列克隆到含有人源恒定区基因的pcdna3.3载体上。将重链和轻链质粒转染到hek293细胞中进行抗体表达。离心收集细胞上清。用proteina(mabselectsure,ge)纯化抗体，并将纯化后的抗体透析到pbs中。抗体浓度通过nanodrop。蛋白的纯度通过sds-page(invitrogen,nupage4％-12％bis-trisgel)和hplc-sec(agilent)检测。
3.3亲和力成熟
构建11.4重链cdr3区的饱和突变文库，并用elisa方法进行筛选。挑选与原始克隆相比，单点突变使pcsk9亲和力提高的克隆。将挑选出的突变位点建成一个组合文库。根据elisa结合实验和sprkoff排序结果，挑选出亲和力提高的突变组合。
以11.4序列作为模板，构建2个随机突变文库。通过对该文库进行2轮淘选及筛选，挑选出能够提高亲和力的突变，并与饱和突变文库中得到的突变组合，从而进一步提高抗体的亲和力。
构建11.4重链cdr3区的饱和突变文库，并用elisa方法进行筛选。与原始克隆相比，单点突变使pcsk9亲和力提高的克隆被挑选出来(图1)。将挑选出的突变位点建成一个组合文库。根据elisa结合实验和sprkoff排序结果，挑选出亲和力提高的突变组合。cdr3区的3个位点的突变组合可以使亲和力提高10倍，如克隆b4g2和c1b4(见表3)。
表3.亲和力成熟后的抗体的亲和力
以11.4序列作为模板，构建2个随机突变文库。通过对该文库进行2轮淘选及筛选，得到5个能够提高亲和力的突变。将其中3个突变与b4g2中的突变组合，得到三个克隆40408、40409和40410，从而使亲和力进一步提高了2倍。最终亲和力成熟后的抗体40409的亲和力比参照抗体bmk.115高2倍(见表4)。
表4.亲和力成熟后的抗体的亲和力
3.4瞬转表达全人抗体
3.4.118.156.8(higg4)
全人抗体18.156.8-higg4)在还原条件下的sds-page上的表征分子量为25kda和55kda，分别对应抗体的轻链和重链。在非还原sds-page上的主条带对应了完整的igg分子，分子量约150kd。hplc-sec结果显示抗体纯度为99.6％(图3)。内毒素含量小于0.5eu/mg。
3.4.240409(higg4)
全人抗体wbp301-40409(higg4)在还原条件下的sds-page上的表征分子量为25kda和55kda，分别对应抗体的轻链和重链。在非还原sds-page上的主条带对应了完整的igg分子，分子量约150kd。hplc-sec结果显示抗体纯度为98％(图5)。内毒素含量小于0.5eu/mg。
3.4.315.14.2-uab-igg4l
全人抗体15.14.2-uab-igg4l在还原条件下的sds-page上的表征分子量为25kda和55kda，分别对应抗体的轻链和重链。在非还原sds-page上的主条带对应了完整的igg分子，分子量约150kd。hplc-sec结果显示抗体纯度为99.8％(图7)。内毒素含量小于0.5eu/mg。
3.4.417.72.3-uab2-igg4k
全人抗体17.72.3-uab2-igg4k在还原条件下的sds-page上的表征分子量为25kda和55kda，分别对应抗体的轻链和重链。在非还原sds-page上的主条带对应了完整的igg分子，分子量约150kd。hplc-sec结果显示抗体纯度为98.9％(图9)。内毒素含量小于0.5eu/mg。
3.4.518.136.7-igg4k
全人抗体18.136.7-igg4k在还原条件下的sds-page上的表征分子量为25kda和55kda，分别对应抗体的轻链和重链。在非还原sds-page上的主条带对应了完整的igg分子，分子量约150kd。hplc-sec结果显示抗体纯度为99.2％(图11)。内毒素含量小于0.5eu/mg。
3.4.619.3.8-uab1-igg4l
全人抗体19.3.8-uab1-igg4l在还原条件下的sds-page上的表征分子量为25kda和55kda，分别对应抗体的轻链和重链。在非还原sds-page上的主条带对应了完整的igg分子，分子量约150kd。hplc-sec结果显示抗体纯度为99.9％(图13)。内毒素含量小于0.5eu/mg。
实施例4：候选抗体表征
4.1全人抗体的结合与阻断活性
elisa方法验证全人抗体与pcsk9结合的活性以及阻断pcsk9与ldl-r结合的活性分别见图14和15。结合实验ec50与阻断实验的ic50结果见表5和表6。候选抗18.156.8(higg4)、40409(higg4)、15.14.2-uab-igg4l和17.72.3-uab2-igg4k显示了与参照抗体bmk.115和repatha相当的结合与阻断活性。
表5.抗体与pcsk9结合活性
表6.阻断活性
4.2ldl吸收实验：
hepg2或huh-7细胞用含10％fbs的dmem培养液以每孔1×105的密度接种于96孔板，置于37℃培养箱中。次日将含10％fbs的dmem培养液换成无血清培养液，并将野生型pcsk9或变体pcsk9(d374y)与一系列浓度梯度稀释的抗体混合后加入相应的孔中，37℃孵育1小时。野生型pcsk9和变体pcsk9(d374y)的终浓度分别是20μg/ml和1.3μg/ml。向96孔板中加入bodipy荧光标记的ldl(invitrogenl-3483)，终浓度为1.5μg/ml。在37℃培养箱中孵育3小时后取出96孔板，弃去含有ldl的培养液，用胰酶消化收集细胞并洗涤两次。细胞内的荧光用facs检测，荧光强度表征了ldl的吸收量。ldl吸收的回复率由如下公式计算：ldl吸收回复率(％)＝(mfi样品-mfildl+ag1h)/(mfildl-mfildl+ag1h)×100％。
在野生型和突变体pcsk9存在情况下，在hepg2和huh-7细胞上对抗体18.156.8和40409进行ldl吸收活性的实验(见图16和17)，ic50值见表7。实验证明无论在有野生型或突变型pcsk9存在的条件下，抗体18.156.8和40409都能有效地恢复hepg2和huh-7细胞对ldl的吸收能力。在野生型pcsk9存在情况下，在hepg2细胞上对抗体15.14.2,17.72.3和19.3.8进行ldl吸收活性的实验(图18)，ic50值见表8.实验证明在有野生型pcsk9存在的条件下，抗体15.14.2,17.72.3和19.3.8能有效地恢复hepg2细胞对ldl的吸收能力。
表7.抗体恢复hepg2和huh-7细胞ldl吸收的ic50
表8.抗体恢复hepg2细胞ldl吸收的ic50
4.3动力学亲和力
4.3.1运用spr技术检测结合动力学常数
使用biacoret200(ge)检测抗体与人源pcsk9和恒河猴pcsk9的结合亲和力常数。使用proteina或抗iggfc抗体偶联的芯片补货待测抗体。然后将不同浓度的人源pcsk9或恒河猴pcsk9分别注入传感器芯片上，进样速度为30μl/min。样品结合时间为180s,解离时间为1200s。每次抗原结合后，用2mmgcl2再生芯片。
最终结合解离曲线是扣除参比通道fc1和缓冲液通道信号后的结果。实验数据用1：1langmiur模式进行拟合。计算pcsk9摩尔浓度时所用分子量为85kda。
4.3.2与恒河猴pcsk9蛋白结合反应
用ph值9.2的包被液将小鼠抗his标签的抗体(genscript)稀释至1μg/ml，加入到96孔酶标板中，4℃过夜孵育。洗板封闭后，加入恒河猴pcsk9-his(sinobiological)蛋白，浓度为1μg/ml，室温孵育1小时。洗板后加入待测抗体，室温孵育1小时。洗板后加入山羊抗大鼠igg1和山羊抗大鼠iggb的hrp酶标二抗(bethyl)混合物，室温孵育45分钟。最后加入tmb底物显色液，反应后用2m盐酸终止显色，然后使用酶标仪(moleculardevice)读取在450纳米处的吸光值。
用spr实验检测抗体的动力学结合常数。抗体与人源pcsk9和猴源pcsk9结合的亲和力见表9。
表9.抗体与人源pcsk9和猴源pcsk9结合的动力学常数
4.4抗体在血清中的稳定性检测
待测抗体用新鲜分离的人血清稀释(血清含量>95％)后，置于37℃培养箱中分别孵育0、1、3、7、14天。在每个时间终点处，从37℃培养箱中取出样品后，在乙醇-干冰浴中迅速冷冻并将样品置于-80℃冰箱保存。稳定性测试前取出样品迅速溶解。96孔酶标板用na2co3/nahco3(ph9.2)缓冲液稀释的链霉亲和素包被，置于4℃冰箱。次日，96孔板用0.1％pbst洗涤并用2％bsa/pbs封闭1小时后，加入生物素标记的pcsk9。在室温下孵育1小时后洗涤，加入一系列浓度梯度稀释的样品。在室温下孵育1小时后洗涤，加入hrp标记的羊抗人igg抗体。在室温下孵育1小时后洗涤，加入tmb底物，待显色后用2mhcl终止。用酶标仪(moleculardevice)读取波长450nm处的吸光度。
抗体在37度人血清中孵育后，用elisa检测其与pcsk9结合的活性(见图19)。抗体18.156.8和b4g2在血清中孵育1天，3天，7天和14天后，结合活性与未孵育的抗体相同，说明18.156.8和b4g2在37度可稳定存在于人血清中至少14天。抗体15.14.2,17.72.3和19.3.8在血清中孵育3天后，结合活性与未孵育的抗体相同。说明抗体可以稳定存在于血清中至少3天。
实施例5：动物实验
5.1食蟹猴中单次注射药效
使用ldlc和hdlc3试剂盒(roche)在roche/hitachicobasc系统上检测猴子血清中低密度脂蛋白胆固醇ldl-c和高密度脂蛋白胆固醇hdl-c的浓度。总胆固醇tcho用cholesterolfs试剂盒(diasys)检测。
5.1.1实验1:6只3-4岁的雌性食蟹猴，体重在2.6到2.9公斤之间，被随机分为6组(每组1只)。6组猴子分别进行单次静脉注射10mg/kg或30mg/kg剂量的bmk.115或18.156.8(higg4)或40409(higg4)抗体。给药当天被定义为第一天。每组猴子给药后观测36天。
备注：在本实验中，“剂量水平”和“剂量”互换使用。
a除非另有说明书，否则剂量代表活性成分。
抗体18.156.8和40409在食蟹猴中降低低密度胆固醇的疗效。食蟹猴分别按10mg/kg和30mg/kg的剂量给药后，抗体bmk.115和w301-18.156.8可以快速并持久地降低低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇含量。
在10mg/kg和30mg/kg的剂量组中，与注射前相比，bmk.115分别使低密度胆固醇降低至83.4％和89.6％；18.156.8分别使低密度胆固醇降低至79.5％和83.5％。最大降低量在第8天达到。直至检测结束，无论是10mg/kg还是30mg/kg剂量组，注射了18.156.8的猴子的低密度胆固醇一直维持在很低水平；对照抗体bmk.115只在30mg/kg剂量组中可以使低密度脂蛋白水平维持在低水平至36天，但在10mg/kg剂量组中，低密度脂蛋白水平从第24天开始回升，到第28天已恢复至给药前水平(图20a和20b)。所以与参照抗体bmk.115相比，18.156.8可以更长时间地将低密度脂蛋白维持在较低水平。
在10mg/kg和30mg/kg的剂量组中，与注射前相比，40409(higg4)分别使低密度胆固醇降低至32.2％和38.1％(图20a和20b)。
18.156.8(higg4)和40409(higg4)抗体给药的猴子中，无论是10mg/kg还是30mg/kg剂量组，高密度脂蛋白胆固醇水平在实验过程中都没有明显变化。参照抗体bmk.115给药的猴子中，10mg/kg剂量组的猴子的高密度胆固醇水平没有明显变化，但30mg/kg剂量组的高密度胆固醇水平与给要前相比降低了30％(图21a和21b)。
5.1.2实验2：10只3-4岁的雌性食蟹猴，体重在2.5到3.5公斤之间，被随机分为10组(每组1只)。10组猴子分别进行单次静脉注射3mg/kg或10mg/kg剂量的repatha或15.14.2、17.72.3、18.136.7或19.3.8抗体。给药当天被定义为第一天。每组猴子给药后观测36天。
备注：在本实验中，“剂量水平”和“剂量”互换使用。
a除非另有说明书，否则剂量代表活性成分。
抗体15.14.2、17.72.3、18.136.7和19.3.8在食蟹猴中降低低密度胆固醇疗效。
食蟹猴分别按3mg/kg和10mg/kg的剂量给药后，抗体15.14.2和repatha可以快速并持久地降低低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇含量(图22a和22b)。抗体18.136.7在3mg/kg和10mg/kg剂量组中，也使低密度胆固醇有显著降低(～50％)。17.72.3和19.3.8在10mg/kg剂量组中使低密度胆固醇有少量降低。
在3mg/kg和10mg/kg的剂量组中，与给药前相比，repatha分别使低密度胆固醇降低至80％和77％；15.14.2在两个剂量组均使低密度胆固醇降低至77％。最大降低量在第8-16天到达。在10mg/kg剂量组中，注射了15.14.2的猴子的低密度胆固醇一直维持在很低水平，直至检测结束。而对照抗体repatha给药的猴子的低密度脂蛋白水平从第24天开始回升，到第36天已恢复至给药前水平(图22a和22b)。在3mg/kg剂量组中，repatha给药的猴子的低密度脂蛋白水平第12天开始回升至80％，到第20天已恢复至给药前水平。15.14.2给药的猴子到第28天低密度胆固醇水平仍维持在给药前50％以下。所以与repatha相比，在3mg/kg和10mg/kg两个剂量组中，15.14.2均可以更长时间地将低密度脂蛋白维持在较低水平。
高密度脂蛋白胆固醇在所有给药的猴子中都没有明显变化(图23a和23b)。
5.2药代动力学
通过测定动物血清中的bmk.115、18.156.8、40409、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8浓度以获得体内药物暴露水平。从所有存活的食蟹猴采集0小时(给药前),和给药后0.5、1、2、4、24、48、96、168、336、504、672、744和840小时的血样。
从动物的头静脉或股静脉采集约2ml全血，置于无抗凝剂的采血管中。血样采集后常温静置至少30分钟。约4℃下2000g离心10分钟获取血清(血样采集后2小时内完成)。血清转移至贴有标签的聚丙烯样品管中。立即垂直放入干冰中速冻，然后保存在≤-60°的超低温冰箱中。
在药代动力学检测前，将血清样品迅速解冻。用na2co3/nahco3缓冲液稀释山羊抗人多克隆抗体后，包被酶标检测板，4℃过夜孵育。用0.1％tween-pbs洗板后，加入2％bsa/pbs封闭。将稀释后的食蟹猴血清样品加入酶标板中，于室温下孵育一小时。洗板后，先后于酶标板中加入生物素标记的山羊抗人igg抗体和链霉亲和素-hrp，分别于室温下孵育一小时。加入tmb底物，待显色后用2mhcl终止。在450nm波长下读取每孔吸光值。通过标准曲线计算血清中抗体的浓度。
药代动力学参数包括但不局限于初始血清浓度(c0)及从0小时到给药后840小时的血药浓度-时间曲线下的面积(auc0-840h)，用验证过的winnonlin程序(pharsightversion6.2.1)进行计算。用非房室法的线性上升/对数下降梯形法则，计算auc0-840h，限于对供试品处理的动物。在计算平均值的时候，blq(低于定量值)被当成0来计算。
血清中抗体的浓度用elisa检测(图24和25)。由0到840小时血清中抗体浓度计算得到的bmk.115,18.156.8(higg4)、40409(higg4)的c0值和auc0-840h，以及抗体半衰期见表10。
剂量从10mg/kg增加到30mg/kg时，18.156.8和40409的药物暴露水平(auc0-840h和/或c0)成比例增加，但bmk.115的药物暴露水平增加与剂量的增加不成正比。
表10.药代动力学数据i
由0到840小时血清中抗体浓度计算得到的repatha、15.14.2、17.72.3、18.136.7和19.3.8的c0值和auc0-840h，以及抗体半衰期见表11。在3mg/kg和10mg/kg两个剂量组，抗体15.14.2、17.72.3、18.136.7和19.3.8的半衰期均长于repatha。
剂量从10mg/kg增加到30mg/kg时，repatha、15.14.2、17.72.3、18.136.7和19.3.8的药物暴露水平(auc0-840h和/或c0)均成比例增加。
表11.药代动力学数据ii
5.3免疫原性
从动物的头静脉或股静脉采集0小时(给药前),和给药后336、672、840小时的血样。
用na2co3/nahco3缓冲液稀释抗体115、18.156.8和40409后铺板(nunc)，4度孵育过夜。用0.1％tween-pbs洗板后加入2％bsa/pbs封闭。将pbs稀释的猴子血清加入酶标板中室温孵育1小时。洗板后加入山羊抗食蟹猴igg-hrp(与人igg无交叉反应)孵育。洗板后加入tmb底物，待显色后用2mhcl终止。在450nm波长下读取每孔吸光值。
抗体bmk.115,18.156.8(higg4)和40409(higg4)的免疫原性检测结果见图26。在给药后336、672、840小时的猴子血清中，针对bmk.115、18.156.8(higg4)、40409(higg4)的抗抗体的滴度与给药前没有明显差异，说明单次注射10mg/ml或30mg/ml剂量的bmk.115、18.156.8(higg4)或40409(higg4)抗体引起的免疫原性很低。
抗体repatha、15.14.2、17.72.3、18.136.7和19.3.8的免疫原性检测结果见图27。在给药后336、672、840小时的猴子血清中，针对repatha、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8的抗抗体的滴度与给药前没有明显差异，说明单次注射10mg/ml或30mg/ml剂量的repatha、15.14.2、17.72.3、18.136.7或19.3.8抗体引起的免疫原性很低。
5.4毒性
死亡/濒死:实验期间每天2次报告每只动物的健康状态，上午1次下午1次，除动物到达设施和解剖当天动物检查1次。
在整个实验过程中动物无计划外死亡。
详细临床观察：对所有动物(包括替代动物)在实验前进行1次详细临床观察，对所有实验动物在给药日(约给药后2±0.5小时)进行1次观察，此后实验过程中每周进行1次详细临床观察。
整个实验过程中未观察到药物相关的临床症状。
笼边观察：在实验前期，从给药前2天开始对所有动物(包括替代动物)每天进行1次笼边观察。在实验第一天进行1次，在给药日进行每天2次笼边观察(给药后30分钟以内和给药后约6±0.5小时)，恢复期每天进行1次笼边观察。在相同时间段安排了详细临床观察，未进行笼边观察。
体重：每只动物实验前期称重1次。对实验动物，在实验第一天给药前进行1次体重称量，随后实验过程中每周称重一次。
未观察到药物相关的体重变化，所有体重变化都在正常生物学差异范围内。
摄食量：对所有动物，在实验给药前2天和整个实验给药和观察过程中，评估动物的摄食量。通过监视所有动物的食欲(动物是否进食构成评估文件)来评估每天的摄食量。
无药物相关的摄食量变化。
实施例6：抗体18.156.8与参照抗体之间的活性比较
1.参照抗体的产生
用实施例1和实施例2中所述的方法，基于专利cn101932607中12h11.1和24b9.1的序列产生参照抗体12h11.1.uigg4k和24b9.1.uigg4l。
抗体12h11.1.uigg4k和24b9.1.uigg4l在还原条件下的sds-page上的表征分子量为25kda和55kda，分别对应抗体的轻链和重链(图28a)。在非还原sds-page上的主条带对应了完整的igg分子，分子量约150kd。hplc-sec结果显示24b9.1.uigg4l的抗体纯度为96.8％(图28b)。hplc-sec结果显示12h11.1.uigg4k的抗体纯度为95.3％(图28c)。
2.elisa测定的与人pcsk9的结合
根据实施例2第2.4节杂交瘤筛选中所述的方法，用elisa方法验证参照抗体12h11.1.uigg4k和24b9.1.uigg4l与人pcsk9结合的活性(图29)。结合ec50值见表12。参照抗体12h11.1.uigg4k显示了低于抗体18.156.8和bmk.115的结合活性。参照抗体24b9.1.uigg4l不与人pcsk9结合。
表12.结合活性
3.elisa法检测阻断
根据实施例2第2.4节杂交瘤筛选中所述的方法，通过竞争elisa检测参照抗体12h11.1.uigg4k和24b9.1.uigg4l阻断pcsk9与ldlr结合的活性(图30)。ic50值见表13。抗体24b9.1.uigg4l未显示出阻断活性。抗体12h11.1.uigg4k显示与抗体18.156.8近似的ic50，但无法完全阻断pcsk9与ldlr的结合。
表13.阻断活性
4.运用spr技术检测亲和力
通过使用实施例4第4.3.1节运用spr技术检测结合动力学常数中所述的同一方法测定，抗体12h11.1.uigg4k的动力学亲和力远低于抗体18.156.8。结果示于表14。
表14.与人pcsk9结合的动力学亲和力
5.ldl吸收实验
根据实施例4第4.2节全人抗体的ldl吸收实验中所述的方法，在hepg2细胞上对抗体18.156.8和12h11.1.uigg4k进行ldl吸收活性的实验(参见表15和图31)。12h11.1.uigg4k在hepg2细胞中显示较低的恢复细胞ldl吸收的活性。
表15.ldl吸收实验
虽然本公开已经具体示出并参考具体实施方式(其中一些是优选的实施方式)进行了描述，但本领域的技术人员应理解如本申请所示可以在不脱离本发明的精神和范围内，可以进行各种形式上和细节上的改变。
序列表
<110>上海药明生物技术有限公司
<120>新型抗-pcsk9抗体
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