一种用天然海水加味精发酵母液生产螺旋藻生物质的方法与流程

本发明涉及微藻生物技术领域，特别涉及一种用天然海水加味精发酵母液生产螺旋藻生物质的方法。

背景技术：

螺旋藻生物质营养丰富，富含蛋白质、不饱和脂肪酸和多种维生素，而且蛋白质品质极高，包含人体和动物所需的二十几种氨基酸。是目前已知的蛋白质含量高/营养丰富的食品资源，具有极高的营养价值和提高免疫力的功能，被联合国粮农组织(fao)列为21世纪人类的重要的蛋白源。另外据报导螺旋藻具有抑瘤抗癌、增强免疫和抗病毒感染的生物活性物质，其生长因子还具有增强细胞代谢、延缓细胞衰老的功效，有助于肿瘤的治疗。但是一般光自养条件下，培养螺旋藻获得生物质需要耗费大量淡水资源和化学营养元素。因此寻找营养物质丰富且廉价易得的培养基培养螺旋藻是降低螺旋藻产品生产成本的一种途径。

海水资源丰富，水量巨大，可以作为替代淡水资源生产螺旋藻的一个尝试方向。但是海水培养淡水藻存在一些制约因素：其一是相对淡水而言的高盐度对于微藻存活是一大挑战；其二是相对于微藻生理需要而言的低氮磷供给会抑制微藻的生长。

而在味精生产过程中，提取谷氨酸并去除菌体后的发酵母液富含各种氨基酸、糖分、硫酸铵等，但因其粘度较大，处理非常困难。目前常用的处理方法为制备家禽饲料、饲用微生物添加剂等，然而在制备上述饲料及添加剂时，又不可避免的产生废水废弃物等，形成二次污染。而发酵母液中含有的氮磷等元素是可被微生物吸收利用的营养物质，可作为补给海水培养基营养物质的合适选择。如能利用海水加味精发酵母液生产螺旋藻生物质，即减少环境污染，同时实现废物利用，无疑产生巨大的经济和生态效益。然而，迄今为止，尚未发现使用天然海水加味精发酵母液生产螺旋藻生物质的报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，发明人首次利用海水和味精发酵母液生产螺旋藻生物质，意外发现在二者共同作用下，螺旋藻的生物量产出有了提高，同时螺旋藻蛋白质含量也得以增加。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，公开了味精发酵母液在海水培养条件下对促进螺旋藻生物质产率和螺旋藻蛋白质含量中的应用。

优选的，所述味精发酵母液为提取谷氨酸并去除菌体后的味精生产废水，含有氨基酸、糖分、硫酸铵等成分；

优选的，所述海水为天然海水，盐度为(30±5)‰；

优选的，所述螺旋藻为盐泽螺旋藻，进一步优选的，所述盐泽螺旋藻(sprulinasubsalsa)购买自中国科学院淡水藻种库，保藏号为fachb-351；

优选的，海水与味精发酵母液添加体积比为50～800:1(优选为100:1)；发明人在实验中发现，通过在海水培养条件下向其中一定比例不含菌体的味精发酵母液，能够解除海水对螺旋藻的生长抑制效应，显著提高螺旋藻生物质产率，同时能够显著提高螺旋藻的单位蛋白质含量和产率，为人们提供一种优质蛋白源；

本发明的第二个方面，公开了一种用天然海水加味精发酵母液生产螺旋藻生物质的方法，具体的，将扩大培养至生长对数期的螺旋藻加入海水与味精发酵母液的混合液中培养；螺旋藻生长至对数期，此时螺旋藻活力强，具有较好的抗逆能力；

优选的，所述味精发酵母液为提取谷氨酸并去除菌体后的味精生产废水，含有氨基酸、糖分、硫酸铵等成分；发明人曾经利用提取谷氨酸后的离交母液培养普通小球藻，试验证明可以有效提高小球藻产率，并提高小球藻蛋白质含量及营养质量，因此在此研究前期，曾考虑同样使用提取谷氨酸后的离交母液，然而对螺旋藻生长和蛋白质产量并没有产生显著影响，无法解除天然海水对螺旋藻的生长抑制作用，然而，发明人意外发现，当使用分离去除谷氨酸杆菌菌体的味精发酵母液时，螺旋藻生长和蛋白质产量却得到显著提高，因此发明人推测谷氨酸杆菌菌体在本申请添加天然海水和味精发酵母液的螺旋藻培养体系中对解除天然海水对螺旋藻的生长抑制作用起到负面影响，而且，即使对味精离交母液进行高温灭菌处理后添加至本申请螺旋藻培养体系中，其提高螺旋藻产率和蛋白质含量效果依然不理想。

优选的，所述海水为天然海水，盐度为(30±5)‰；

优选的，所述螺旋藻为盐泽螺旋藻，进一步优选的，所述盐泽螺旋藻(sprulinasubsalsa)购买自中国科学院淡水藻种库，保藏号为fachb-351；盐泽螺旋藻细胞体积和藻丝宽度较小，且能很快结成团块，成片浮于水面，极易捞取，尽管有研究指出其可在咸水中生长，但是不可避免地生长作用受限，蛋白质产量降低，而采用本申请技术方案，则能显著提高盐泽螺旋藻的生物质含量及蛋白质单位产量和产率，需要说明的是，并非所有螺旋藻均适用于本申请技术方案，发明人在前期使用极大螺旋藻、钝顶螺旋藻等常用螺旋藻品种，也未达到本申请技术效果。由此可见，天然海水培养条件下添加味精发酵母液对螺旋藻生长及蛋白质产量和含量影响的作用机制是十分复杂的，有待进一步进行深入研究。

优选的，所述扩大培养选用zarrouk培养基，所述zarrouk培养基成分如下(g.l^-1)：

nano3,2.5；nacl,0.5；mgso4·7h2o,0.15；cacl2·2h2o,0.04；过磷酸钙(ca(h2po4)2·caso4·h2o),1.25；kcl,0.898；nahco3,16.8；

优选的，一种用天然海水加味精发酵母液生产螺旋藻生物质的方法，方法包括：

(1)盐泽螺旋藻(sprulinasubsalsa，fachb-351)藻种接种于zarrouk培养基中进行活化培养3d，得活化藻细胞；

(2)将步骤(1)制得的活化藻细胞接种于zarrouk培养基中扩大培养至对数生长期；接种前过筛富集藻细胞并用去离子水清洗，获得螺旋藻待接种藻泥；

(3)向海水中添加味精发酵母液，搅拌均匀制得微藻培养液；使用所述微藻培养液重悬接种藻泥，使培养液中初始od680为0.15～0.25(优选为0.20)，在人工气候室中恒温光照静置培养至藻液生长至稳定期；取藻液分离冷冻干燥后得螺旋藻藻粉。

优选的，所述zarrouk培养基成分如下(g.l^-1)：

nano3,2.5；nacl,0.5；mgso4·7h2o,0.15；cacl2·2h2o,0.04；过磷酸钙(ca(h2po4)2·caso4·h2o),1.25；kcl,0.898；nahco3,16.8；

优选的，所述海水与味精发酵母液添加体积比为50～800:1(优选为100:1)，其中，所述海水为天然海水，盐度为(30±5)‰；所述味精发酵母液为提取谷氨酸并去除菌体后的味精生产废水，含有氨基酸、糖分、硫酸铵等成分；

优选的，所述步骤(3)中具体静置培养条件为：

温度为25℃，光照强度为120μmol.m^-2s^-2；

本发明的有益效果：

本发明首次提出在天然海水条件下添加味精发酵母液从而得到一种不消耗淡水培养螺旋藻的新方法，能够有效解除天然海水对螺旋藻的生长抑制作用，显著提高螺旋藻生物质产率，同时能够显著提高螺旋藻的单位蛋白质含量和产率，为人们提供一种优质蛋白源；

本发明操作简单、耗时短、效率高、成本低，易于实现，具有良好的应用价值，为螺旋藻大规模开发利用提供有效的技术方案。

附图说明

图1为盐泽螺旋藻(sprulinasubsalsa)在海水中添加不同浓度味精发酵母液时的最大生物质浓度；

图2为添加不同浓度味精发酵母液的海水培养的盐泽螺旋藻(sprulinasubsalsa)的蛋白质含量与产率。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明的一种具体实施方式中，公开了味精发酵母液在海水培养条件下对促进螺旋藻生物质产率和螺旋藻蛋白质含量中的应用。

其中，所述味精发酵母液为提取谷氨酸并去除菌体后的味精生产废水，含有氨基酸、糖分、硫酸铵等成分，经检测，废水中含有的物质为：codcr780-820mg.l^-1，nh3-n550-575mg.l^-1，tn62-72g.l^-1，tp657-686mg.l^-1；

所述海水为天然海水，盐度为(30±5)‰；

所述螺旋藻为盐泽螺旋藻，进一步优选的，所述盐泽螺旋藻(sprulinasubsalsa)购买自中国科学院淡水藻种库，保藏号为fachb-351；

海水与味精发酵母液添加体积比为50～800:1(优选为100:1)；

本发明的又一种具体实施方式中，公开了一种用天然海水加味精发酵母液生产螺旋藻生物质的方法，具体的，将扩大培养至生长对数期的螺旋藻加入海水与味精发酵母液的混合液中培养；螺旋藻生长至对数期，此时螺旋藻活力强，具有较好的抗逆能力；

具体的，所述味精发酵母液为提取谷氨酸并去除菌体后的味精生产废水，含有氨基酸、糖分、硫酸铵等成分；经检测，废水中含有的物质为：codcr780-820mg.l^-1，nh3-n550-575mg.l^-1，tn62-72g.l^-1，tp657-686mg.l^-1；

所述海水为天然海水，盐度为(30±5)‰；

所述螺旋藻为盐泽螺旋藻，所述盐泽螺旋藻(sprulinasubsalsa)购买自中国科学院淡水藻种库，保藏号为fachb-351；

所述扩大培养选用zarrouk培养基，所述zarrouk培养基成分如下(g.l^-1)：

nano3,2.5；nacl,0.5；mgso4·7h2o,0.15；cacl2·2h2o,0.04；过磷酸钙(ca(h2po4)2·caso4·h2o),1.25；kcl,0.898；nahco3,16.8；

本发明的又一具体实施方式中，公开了一种用天然海水加味精发酵母液生产螺旋藻生物质的方法，方法包括：

(1)盐泽螺旋藻(sprulinasubsalsa，fachb-351)藻种接种于zarrouk培养基中进行活化培养3d，得活化藻细胞；

(2)将步骤(1)制得的活化藻细胞接种于zarrouk培养基中扩大培养至对数生长期；接种前过筛富集藻细胞并用去离子水清洗，获得螺旋藻待接种藻泥；

(3)向海水中添加味精发酵母液，搅拌均匀制得微藻培养液；使用所述微藻培养液重悬接种藻泥，使培养液中初始od680为0.15～0.25(优选为0.20)，在人工气候室中恒温光照静置培养至藻液生长至稳定期；取藻液分离冷冻干燥后得螺旋藻藻粉。

其中，所述zarrouk培养基成分如下(g.l^-1)：

nano3,2.5；nacl,0.5；mgso4·7h2o,0.15；cacl2·2h2o,0.04；过磷酸钙(ca(h2po4)2·caso4·h2o),1.25；kcl,0.898；nahco3,16.8；

所述海水与味精发酵母液添加体积比为50～800:1(优选为100:1)，其中，所述海水为天然海水，盐度为(30±5)‰；所述味精发酵母液为提取谷氨酸并去除菌体后的味精生产废水，含有氨基酸、糖分、硫酸铵等成分；

所述步骤(3)中具体静置培养条件为：温度为25℃，光照强度为120μmol.m^-2s^-2；

以下通过实施例的方式对本发明做进一步阐述。需要说明的是，盐泽螺旋藻(sprulinasubsalsa，fachb-351)购于中国科学院淡水藻种库；味精母液为取自提取谷氨酸并去除菌体后的发酵母液，经检测，废水中含有的物质为：codcr780-820mg.l^-1，nh3-n550-575mg.l^-1，tn62-72g.l^-1，tp657-686mg.l^-1。本发明施实例所述的培养均在三角瓶中恒温静置培养，光照为日光灯。

实施例

1、藻体培养过程：

(1)将螺旋藻藻种接种于zarrouk培养基中进行活化培养3d，得活化藻细胞，zarrouk培养基组分如下(g.l^-1)：nano3,2.5；nacl,0.5；mgso4·7h2o,0.15；cacl2·2h2o,0.04；过磷酸钙(ca(h2po4)2·caso4·h2o),1.25；kcl,0.898；nahco3,16.8；

(2)将步骤(1)制得的活化细胞接种于zarrouk培养基中扩大培养至对数生长期；接种前过筛富集藻细胞并用去离子水清洗，获得螺旋藻待接种藻泥；

(3)向海水中添加不同比例的味精发酵母液(50:1到800:1，v海水:v味精发酵母液)，制得微藻培养液；用培养液重悬适量接种藻泥，使培养液中初始od680为0.2，在人工气候室中恒温光照静置培养，培养过程中每天取样测定生物量；培养条件为温度为25℃，光照强度为120μmol.m^-2s^-2；藻液生长至稳定期；

2、藻体生物量测定：

取藻液15ml用0.45μm醋酸纤维滤膜低压过滤，然后将带有螺旋藻的滤膜放入60℃烘箱烘干至恒重。冷却至室温后称量带有藻体的滤膜，带有藻体的滤膜减去滤膜的重量得出藻体干重。藻体干重除以藻液体积为生物量浓度(g.l^-1)；

取藻液用200目的筛绢分离得到湿藻体，将湿藻体在-50℃冷冻干燥后得到螺旋藻藻粉；采用分光光度法(gb50095-2010)测定藻粉蛋白含量(w/w，％)。

3、结果分析：

在海水与发酵母液混和的培养液中，藻粉蛋白含量亦可高达60％以上，满足国家标准(gb/t16919-1997)中关于食用螺旋藻粉蛋白含量大于等于55％的规定。其中蛋白质产率为176-262mg.l^-1d^-1。

与zarrouk培养基对照中藻体生物量1.12g.l^-1、蛋白含量63％、蛋白质产率143mg.l^-1d^-1，海水中添加合适比例的味精发酵母液作为培养基极大地促进了小球藻生物质和蛋白质的积累。

本发明对获得的藻粉进行生物量及蛋白质检测分析，发现使用海水与发酵母液比例为100:1到500:1的培养液培养出的盐泽螺旋藻富含蛋白质，含量大于60％，而且积累速率较快。

如图1所示，本发明给出了盐泽螺旋藻(sprulinasubsalsa)在由海水中与味精发酵母液(5:1到1000:1，v海水:v味精发酵母液)混合的培养液中的最大生物质浓度；给出了上述培养液培养的盐泽螺旋藻(sprulinasubsalsa)的蛋白质含量与产率。

实验表明海水与发酵母液比例为25:1到100:1之间时，螺旋藻均有较高的生物量积累，最佳稀释比例为100:1到500:1之间(如图1所示)；最适稀释倍数条件下，螺旋藻均有较高的生物量积累和有较高的蛋白质含量及产率(如图2所示)。

需要说明的是，发明人曾经利用提取谷氨酸后的离交母液用以培养普通小球藻，试验证明可以有效提高小球藻产率，并提高小球藻蛋白质含量及营养质量，因此在此研究前期，曾考虑同样使用提取谷氨酸后的离交母液，然而对螺旋藻生长和蛋白质产量并没有产生显著影响，无法解除天然海水对螺旋藻的生长抑制作用，然而，发明人意外发现，当使用分离去除谷氨酸杆菌菌体的味精发酵母液时，螺旋藻生长和蛋白质产量却得到显著提高；而且，更换微藻种类后，如使用极大螺旋藻、钝顶螺旋藻等常用螺旋藻品种，也未达到本申请技术效果。由此可见，天然海水培养条件下添加味精发酵母液对螺旋藻生长及蛋白质产量和含量影响的作用机制是十分复杂的，有待进一步进行深入研究。但是从目前结果来看，天然海水储存量极大，容易获取，降低了培养成本，这不失为一种经济实用的螺旋藻生物质的商业化生产方法，有必要进行推广应用。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。