用于降解烟叶中淀粉的XC‑3菌株及其应用的制作方法

本发明属于烟草微生物发酵技术领域，具体涉及一株用于降解烟叶中淀粉的苏云金芽孢杆菌xc-3菌株及其在烟叶发酵方面的应用。

背景技术：

淀粉是烟草生长过程中积累的重要碳水化合物，广泛存在于烟草的茎叶中，其含量的高低与烟叶品质密切相关。但是，淀粉含量过高对于烟草制品的抽吸品质是不利的，一方面会影响燃吸的速度和完全性，另一方面淀粉在燃烧时会产生焦糊气味以及多种有害成分，对烟草的色、香、味产生不良影响。一般认为，国外优质烟叶淀粉含量为l%~2%，而中国的为4%~6%，烤烟淀粉含量普遍偏高，已成为制约国内烟叶质量提高的重要因素之一。因此，利用合适的方法将烟叶中的淀粉降解成还原糖等小分子物质，是提高烟叶品质的有效途径之一。而单纯依赖烟草自身酶类的水解作用远不能满足卷烟工业对高品质烟叶原料的需求，如何利用生物技术降低烟叶中的淀粉含量，从而提高烟叶品质，已成为科技工作者普遍关注的问题。

生物法降解烟叶淀粉的研究主要为酶制剂法和微生物法，后者以其成本低廉、操作简单等优势成为研究热点，因此筛选特异性微生物应用于烟叶发酵，对有效降解烟叶中大分子物质、快速改善烟叶品质具有十分重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明目的在于提供了一株能够高效降解烟叶中淀粉物质的苏云金芽孢杆菌xc-3菌株，从而能够有效促进烟叶中大分子淀粉的降解，提高烟叶整体品质。

本申请所采取的详细技术方案如下。

一株用于降解烟叶中淀粉的xc-3菌株，该菌株为苏云金芽孢杆菌bacillusthuringiensi），最初是由2013年河南许昌c2f烟叶中分离而来，其保藏名称为：苏云金芽孢杆菌xc-3，分类学名称为bacillusthuringiensixc-3，已于2017年6月19日保藏于武汉中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏编号为cctccno：m2017352。

利用所述用于降解烟叶中淀粉的xc-3菌株所制备的菌剂，通过如下步骤制备而成：

（1）活化菌种，将xc-3菌株置于初筛固体培养基上，活化培养，具体而言：37℃条件下活化培养72h；

（2）制备种子液，挑取步骤（1）中所培养的菌落，接种于液体种子培养基中，37℃摇床培养；

（3）扩大培养，将步骤（2）中种子液转接液体复筛培养基，培养至od600=1.8~2.0；

（4）制备菌剂，将步骤（3）中发酵液离心，弃上清，然后加入无菌水进行悬浮，调整活菌数为（9~10）×10⁷个/ml。

上述制备过程中，培养基成分单位以g/l计，

所述初筛固体培养基组成为：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，nacl5.0，可溶性淀粉20.0，琼脂粉15.0，ph7.0～7.2；

所述液体种子培养基组成为：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，nacl5.0，ph7.0～7.2；

所述液体复筛培养基组成为：可溶性淀粉20.0，豆粕粉20.0，ph7.0～7.2。

所述利用xc-3菌株所制备的菌剂在降解烟叶淀粉中的应用，按烟叶2~4%的质量比例，将制备好的菌剂均匀喷洒于烟叶表面，在温度35℃~40℃条件下，发酵处理36h~72h（优选在3%施加比例条件下，37℃处理48h），发酵完成后，再将烟叶加热处理使细菌及其产生的淀粉酶失活即可（70~100℃加热处理10~30min，优选80℃加热处理20min）。

一种降低烟叶中淀粉含量的方法，包括如下步骤：

（1）制备处理菌剂，具体而言，以苏云金芽孢杆菌xc-3发酵培养，制备成活菌数为（9~10）×10⁷个/ml的水剂；

（2）将步骤（1）中所制备处理菌剂均匀喷施于待处理烟叶表面，35℃~40℃条件下，发酵处理36h~72h，发酵完成后，再将烟叶加热处理使细菌及其产生的淀粉酶失活。

本发明中以烟叶中含量较高的淀粉为作用目标，通过特定菌株筛选，以及特定剂量使用，在较短时间内较好地降低了烟叶中的淀粉含量。初步测定结果表明，烟叶中淀粉的降解率可达30%左右，烟叶整体感官质量也提升较为明显，表现出较好的技术效果。

总体而言，本发明通过特定菌株的筛选，设计了较为简便的菌剂处理烟叶的技术方案，使得本发明具有：工艺流程较为简便，烟叶处理成本较低，且处理周期较短，可明显降低烟叶中的淀粉含量并改善烟叶品质等技术优点，因而在卷烟制造技术领域具有较好地推广应用价值。

附图说明

图1为苏云金芽孢杆菌xc-3菌株在油镜下的形态图；

图2为基于苏云金芽孢杆菌xc-3菌株16srdna基因序列构建的系统发育进化树。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前就下述实施例中涉及部分物料、实验设备等情况简要介绍如下。

烟草物料：

菌株筛选所用烟叶为2013年河南许昌c2f烟叶；菌株作用效果考察所用烟叶为2013年河南平顶山c3f，均由河南中烟工业有限责任公司提供。

实施例1

本实施例仅就xc-3菌株的筛选及鉴定过程简要介绍如下。

xc-3菌株，最初是由2013年河南许昌c2f烟叶中分离获得。其菌落圆形，透明，湿润，表面黏状，直径约3mm，边缘整齐。油镜下形态如图1所示，可观察到菌株呈杆状，革兰氏染色显示为阳性。

采用16srdna基因片段为通用引物，对该菌株进行pcr以及克隆测序，可获得1414bp序列，进行系统进化分析，显示菌株xc-3与苏云金芽孢杆菌（bacillusthuringiensi）的同源性高达99%，即与苏云金芽孢杆菌的亲缘关系最近（如图2所示）。

进一步对菌株进行生理生化分析，结果如表1所示。

表1xc-3生理生化实验结果

注：+表示阳性、是或能利用，-表示阴性、否或不能利用。

最终，鉴定认为xc-3菌株属芽孢杆菌属（bacillus），其分类学名称为bacillusthuringiensixc-3，于2017年6月19日提交武汉中国典型培养物保藏中心（cctcc）保藏（地址：武汉大学），2017年6月30日保藏鉴定为存活，其保藏编号为cctccno：m2017352。

实施例2

为将实施例1中筛选所得xc-3菌株用于降解烟叶中淀粉，需首先将该菌株制备成易于使用的菌剂，具体制备过程如下。

（1）活化菌种，将xc-3菌株置于初筛固体培养基上，37℃条件下培养72h；

（2）制备种子液，挑取步骤（1）中所培养的菌落，接种于液体种子培养基中，37℃摇床培养过夜；

（3）扩大培养，将步骤（2）中种子液转接液体复筛培养基，培养至od600=2.0左右；

（4）制备菌剂，将步骤（3）中发酵液离心，弃上清，然后加入无菌水进行悬浮，调整活菌数为10×10⁷个/ml左右。

实施例3

利用实施例2中所制备菌剂处理烟叶时，具体步骤为：

处理烟叶时，按照烟叶2~4%的质量比例（接种量），将上述菌剂用喷雾器均匀喷洒于烟叶表面，然后调整烟叶水分含量为25%；置于特定温度条件下发酵一定时间后，80℃处理20min，使细菌及其产生的淀粉酶失活。

为确定菌剂的最佳作用条件（发酵时间、温度、接种量），发明人进行了正交实验设计，相关实验过程简要介绍如下。

烟叶样品：取抽取烟梗后的烟叶，分割成片状，然后均匀分成多份，每份100g。

发酵时间、发酵温度、接种量：分别以发酵时间、发酵温度、接种量为影响因素，进行了3因素3水平设计，具体设计如下：

表2因素水平表l9（3³）

注：a为发酵时间；b为发酵温度；c为接种量。

依据表2，进行了三因素三水平正交实验设计（表3）：

表3正交设计表l9（3³）：

注：a为发酵时间；b为发酵温度；c为接种量；同时设置空白对照ck。

烟叶淀粉含量的检测采用烟草行业标准：《烟草及烟草制品淀粉的测定连续流动法》（yc/t216-2013）；

烟叶感官质量评价：将烟叶切丝，制成烟支规格（20+64）mm×24.5mm的烟支样品，在（22±1）℃、相对湿度（60±2）%的恒温恒湿箱中平衡48h后待评。将待测样品送至河南中烟技术中心，由中心内部11名专业评吸员对香气质（a）、香气量（b）、浓度（c）、柔细度（d）、余味（e）、杂气（f）、刺激性（g）等指标进行评定，每项指标均按9分制打分，结果取其平均值。感官评吸总分（t）=（a+b）×2.3+c×1.5+d+e+f+g。

实施例4

根据实施例3中的烟叶淀粉含量测定结果，进一步进行极差分析，结果如表4：

表4极差分析表

注：a为发酵时间；b为发酵温度；c为接种量。

从表4可知，最优水平组合为a2b3c3，即时间为48h、发酵温度为37℃、接种量为3%。通过r值比较可知：ra>rc>rb，即发酵时间对整个作用条件的影响最大，其次是施加比例，而发酵温度的影响最小。

由于最优化组合并不在9组正交处理方案中，因此对优化处理方案进行了验证实验。结果表明，发酵后烟叶淀粉含量为4.68%，与对照（淀粉含量为6.67%）相比，降解率达29.83%。

实施例5

按照上述最优方案处理烟叶，之后评价烟叶感官质量，结果见表5所示。

表5烟叶感官质量评价(分)

。

由表5可知，烟叶经过菌液处理后，香气质、香气量、烟气浓度等明显提高，杂气、刺激性等明显减轻，余味、柔细度等改善明显，烟叶整体质量明显提高（总分提高1.81分）。

综上所述，将菌液均匀喷洒于烟叶表面进行发酵，在菌液接种量3%，温度为37℃的条件下发酵48h，烟叶中的淀粉降解率可达29.83%；烟叶整体感官质量也得到较为明显的提升，因而本发明在降低烟叶中淀粉含量，从而提升烟叶品质方面具有较好地应用前景。

总体而言，本申请中筛选获得的xc-3菌株，其来源于烟叶中原有菌株，当利用其所制备菌剂处理烟叶时，在确保对于烟叶中淀粉降解同时，不具有明显的副作用，可较为有效的促进烟草中大分子物质降解形成各类有利于提高烟草品质的小分子物质，进而达到降低卷烟烟气中的有害成分，改善烟叶的内在品质的目的。同时，之前的研究中用于烟叶淀粉降解的菌株大多为枯草芽孢杆菌、米根霉菌等，鲜有苏云金芽孢杆菌用于烟叶淀粉降解的报道，本发明无疑为烟草微生物发酵工艺的优化提升提供了一个新的思路。