一种用于治疗骨关节炎的透明质酸镁盐及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种治疗骨关节炎的药物及其制备方法，具体是一种用于治疗骨关节炎的透明质酸镁盐及其制备方法和应用。

技术背景

骨关节炎(osteoarthritis,oa)是一种以关节软骨退变、软骨下骨硬化和骨赘形成为主要特点的关节退行性疾病，并以活动后关节疼痛、活动受限和关节变形为其主要临床表现，常累及负重关节。我国流行病学调查研究显示，65岁以上人群中oa的患病率超过50％，约80％的oa患者存在一定程度的运动受限，25％的oa患者日常生活受到明显影响，而每年用于治疗oa的费用或高达1500亿元。美国50岁以上人群中，oa的致残率位居所有疾病中的第二位，仅次于心血管疾病。随着全球老龄化人口以及肥胖人口的增加，oa的患病率还将进一步提高。目前，国内外尚无治疗oa的有效药物，针对早中期oa的治疗往往只能起到缓解疼痛和改善功能的作用。由于oa患者多为中老年人，常伴有其它系统疾病，如消化系统以及心血管系统疾病，而oa的一线治疗药物(症状缓解)如非甾体类抗炎药(non‐steroidalantiinflammatorydrugs，nsaids)的使用易引起胃肠道副作用和心血管事件风险的增加，因此，亟待探索出针对早中期oa患者的安全有效的治疗药物。

透明质酸(hyaluronicacid,ha)是一种酸性粘多糖，广泛存在于人体结缔组织的细胞外基质内。ha以其独特的分子结构和理化性质在机体内起到重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性以及促进伤口愈合等。既往研究表明，oa患者的关节滑液中ha的分子量及浓度均降低，关节液的粘弹性下降(balazs等人，jrheumatolsuppl，1993，39:3‐9；dahl等人，annrheumdis，1985，44:817‐822)。从上世纪70年代起，关节腔注射透明质酸钠用于治疗oa的研究与临床应用已有数十年历史。作为一种局部治疗方式，关节腔注射透明质酸钠相较口服药物治疗oa最大的优势在于可以避免胃肠道以及心血管副作用等全身性的不良反应，最新的循证医学证据表明关节腔注射透明质酸制剂和安慰剂对比不会增加不良事件的发生率(bannuru等人，osteoarthritiscartilage，2016，epubaheadofprint)。如今透明质酸钠已被广泛应用于oa的治疗中。各种产品包括(作为举例)(按照ep138572b1由雄鸡冠纯化的ha)、(hylang‐f20，即与甲醛和二乙烯砜交联的ha，如专利us4713448中所述)和(mw为620至1200kda的ha)。然而，最新的循证医学证据表明关节腔注射透明质酸钠的疗效不确切，国际权威的三大oa指南对关节腔注射透明质酸钠均持不推荐态度(hochberg等人，arthritiscareres(hoboken)，2012，64:465‐474；mcalindon等人，osteoarthritiscartilage，2014，22:363‐388；brown等人，jamacadorthopsurg，2013，21:577‐579)。因此，开发针对早中期oa患者疗效更确切或更有效的药物显得尤为重要。

镁离子(magnesium²⁺,mg)是人体细胞内第二丰富、细胞外第四丰富的阳离子，作为体内300多种酶的辅酶，在机体的能量代谢、核酸和蛋白质合成以及炎症免疫反应等过程中起着重要的作用。近年来，mg对关节软骨炎症的抑制作用及其分子机制已经得到了证实。已有动物实验证明，给予口服mg的治疗方案可以有效减轻oa大鼠药物引起的关节炎症，减轻关节肿胀程度，和非甾体类抗炎药一起给药时对关节肿胀也有很好的治疗效果，并且通过检测血药浓度发现，mg并没有改变血清中非甾体类抗炎药的浓度，可以推断mg并没有影响非甾体类抗炎药的抗炎作用，而是通过其它途径发挥的作用(nagai等人，biolpharmbull，2007，30：1934‐1937)。此外，还有研究证实向oa大鼠关节腔内注射硫酸镁能调节关节软骨代谢，延缓oa进展(lee等人，osteoarthrandcartilage，2009，17：1485‐1493)。除此之外，mg还被证实在缓解疼痛、保护关节软骨以及抑制异常矿化等方面均起到重要作用(fioravanti等人，intjbiometeorol，2014，58：79‐86；pfister等人，antimicrobagentsch，2007，51：1022‐1027；calo等人，amjnephrol，2000，20：347‐350)。因此，mg作为药物用于oa的辅助治疗将是对oa预防与治疗的有益探索。

技术实现要素：

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种用于治疗骨关节炎的透明质酸镁盐及其制备方法和应用。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述用于治疗骨关节炎的透明质酸镁盐的结构如式(ⅰ)所示：

上述透明质酸镁盐的制备方法包括如下步骤：

(1)配制浓度为50—70mg/ml，优选60mg/ml的乙酸镁溶液；

(2)向乙酸镁溶液中加入乙醇，搅拌均匀后加热至35—45℃，优选40℃；所述乙酸镁溶液与乙醇的体积比为1:25至1:15，优选为1:20；

(3)向加入了乙醇的乙酸镁溶液中加入透明质酸钠，在35—45℃，优选40℃条件下反应55—65min，优选60min，反应结束后静置15min、离心，得a沉淀物；所述乙酸镁与透明质酸钠的重量比为1:2至1:1，优选为3:5；

(4)将a沉淀物加入乙醇(沉淀物a和乙醇的比例1:2‐10)中，搅拌后再离心，得b沉淀物；将b沉淀物按步骤(4)重复多次，优选5次，得最终沉淀物；

(5)将最终沉淀物真空干燥后，即得透明质酸镁；有选地，真空干燥温度为60℃。

上述透明质酸镁盐可用于制备治疗骨关节炎药物。所述治疗骨关节炎的药物组合物中除了透明质酸镁为主要组分外，还含有用于增强细胞外基质的分子，比如胶原蛋白或糖胺聚糖，所述透明质酸镁与增强细胞外基质的分子的重量比为1:0.2至1:1；所述治疗骨关节炎的药物组合物中除了透明质酸镁为主要组分外，还含有药理学和/或生物活性物质，比如生长因子、激素和/或维生素，所述透明质酸镁与药理学和/或生物活性物质的重量比为1:0.2至1:1。另外，所述治疗骨关节炎的药物组合物中还含有赋形剂，将药物组合物做成任何剂型。药物组合物中透明质酸镁与赋形剂重量比为1:10至1:100。

下面对本发明作进一步说明：

本发明合成透明质酸的镁盐，配制成适用于关节腔注射和其他局部施用的剂型，应用于骨关节炎的治疗。其在减少软骨基质降解、降低软骨表面磨损程度和延缓软骨退变中是有效的，并将其效力与透明质酸钠相比，清楚证明了透明质酸镁药理作用优于透明质酸钠。可将本发明制备的透明质酸镁与其他一种或多种可药用的载体/赋形剂制备成治疗治疗骨关节炎的药物组合物，优选适于局部施用的液体和半固体药用形式诸如溶液剂、凝胶剂、霜剂或透皮贴剂；特别优选适于关节内注射的形式诸如溶液剂和凝胶剂。药用形式还可由以下的形式构成，其中一些或所有组分是干燥形式(如冻干)，在使用前用水溶液或其他适合的溶媒将其重新配制。

所述制剂能使用已知的赋形剂诸如粘合剂、崩解剂、填充剂、稳定剂、稀释剂和着色剂通过本领域所公知的方法而制备。它们还包括用制药技术中已知的适合的聚合物制备的延迟释放或缓释制剂。

对于制备适于注射的液体形式而言，优选水作为溶剂。

如果需要的话，有可能将透明质酸镁与其他可用于增强细胞外基质的分子，如胶原蛋白或糖胺聚糖联合，或者与其他药理学和/或生物活性物质如生长因子、激素和/或维生素联合。

本发明的药物透明质酸镁利用镁离子对传统oa治疗药物进行了改良，充分利用镁离子的软骨保护作用，使镁和透明质酸协同发挥对关节的保护作用。体外实验表明：透明质酸镁对于软骨细胞无细胞毒性。体内实验证明：相比于透明质酸钠，透明质酸镁能更高程度地降低软骨基质降解和延缓软骨退变。可用于治疗骨关节炎，包括创伤性关节炎和年龄相关退变性骨关节炎。

总之，本发明利用镁离子可与ha中含氧的供体集团结合形成透明质酸镁，从而改良了传统oa治疗药物透明质酸钠，从而达到更有效治疗oa的可能性。

附图说明

图1为软骨组织改良mankin病理评分统计结果；

图2为大鼠右膝关节切片番红固绿染色结果。

具体实施方式

实施例1制备透明质酸镁

1、取300mg乙酸镁，使之完全溶解于5ml蒸馏水中。

2、向该乙酸镁溶液中投入100ml乙醇中，搅均匀，加热以使之达到40℃。

3、搅拌中，加入500mg透明质酸钠，在40℃的温度条件下反应60分钟。

4、反应结束后，静置15分钟，倾去上清液，离心，得沉淀物。

5、取沉淀物，加入沉淀物5倍质量的90％(v/v)乙醇，搅拌10分钟，静置15分钟后，离心，得沉淀物。

6、将步骤5重复进行5次，所得沉淀物在60℃下真空干燥，得到透明质酸镁450mg，透明质酸镁的收率(％)＝450/500＝90％。结构如式(ⅰ)：

实施例2透明质酸镁对于软骨细胞的体外细胞毒性评价

1实验材料和方法

1.1药品与试剂

透明质酸镁，透明质酸钠，生理盐水

cellcountingkit(cck-8试剂盒)

1.2细胞

小鼠软骨细胞

1.3实验方法

1.3.1取对数期生长的小鼠软骨细胞，以5000/孔细胞接种于96孔培养板中，每孔体积约100μl，于5％co2，37℃培养箱培养约24h至细胞长至单层。然后，吸弃孔中上清液，用磷酸缓冲液(pbs)洗1～2遍，加入完全培养基(dmem/f12+10％胎牛血清)和不同浓度药物得到的一系列浓度药液(100μl)，共分5组，每组设3个复孔。将细胞板继续置于培养箱中孵育48h。分组如下：

1)5ng/ml透明质酸镁组；2)2.5ng/ml透明质酸镁组；3)5ng/ml透明质酸钠组；4)2.5ng/ml透明质酸钠组；5)对照组：生理盐水。

1.3.2每孔加入cck-8试剂10μl，培养箱中孵育4h。选择450nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔od值，记录结果。计算各组的od均值。以对照组的od均值作为l00％细胞增值率，各药物浓度组的细胞增殖率依据下式求出：p％＝各组od均值/对照组od均值×100％。然后根据细胞增值率评价细胞毒性，细胞毒性评级标准见表1。

表1细胞增殖百分率与细胞毒性等级的对应关系

2.实验结果

不同药物浓度的各组细胞增殖率见表2

表2不同药物浓度的各组细胞增殖率

实验结果显示：透明质酸镁和透明质酸钠均无软骨细胞毒性。

实施例3透明质酸镁关节腔注射液制备

常温下，将按实施例1合成的透明质酸镁用生理盐水溶解，并稀释至相应浓度1％，用0.22μm的滤膜过滤后，灌封、灭菌、检查和包装，即可。

实施例4透明质酸镁治疗骨关节炎疗效的动物实验验证

1实验材料和方法

1.1药品与试剂

实施例3中制备所得的透明质酸镁

透明质酸钠(0.1ml，山东正大福瑞达制药有限公司)

生理盐水

1.2实验动物

成年雄性sprague-dawley(sd)大鼠

1.3实验方法

1.3.1手术建模

通过行右膝内侧副韧带、前交叉韧带切断术和内侧半月板切除术构建膝oa模型。该模型已经被验证可诱发膝骨关节炎，代表了实验性退行性骨关节炎的良好实例，可用于对所测的药物进行药理学评价。

1.3.2分组和给药方法

造模后依据体重采取随机区组设计将大鼠随机分成3组：

1)关节腔注射生理盐水组，术后6天予以关节腔注射生理盐水0.1ml，每周一次，连续5周；

2)关节腔注射透明质酸钠组，术后6天予以关节腔注射1000ug透明质酸钠(0.1ml，山东正大福瑞达制药有限公司)，每周一次，连续5周；

3)关节腔注射透明质酸镁组，术后6天予以关节腔注射1000ug透明质酸镁(0.1ml，按照实施例3中制备方法所制)，每周一次，连续5周。

术后1周各组大鼠开始在跑步机上进行跑步(1.0km/h，20min/d，每2天1次，持续5周)。

1.3.3评价方法

术后第6周取右侧膝关节软骨标本制作病理切片，行番红固绿染色，采用改良mankin评分(表3)对各组大鼠膝关节软骨退变程度进行评估。该方法可对软骨表面磨损、软骨细胞增殖、软骨基质降解进行综合评价，反应软骨的退变程度。评分越高反应软骨退变程度越重。

表3：改良mankin评分

2.实验结果

各组大鼠右膝关节mankin评分结果如表4。

表4：软骨组织改良mankin病理评分

统计分析显示关节腔注射透明质酸钠组和透明质酸钠镁右膝关节mankin评分均较生理盐水组降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)；关节腔注射透明质酸镁组mankin评分低于透明质酸钠组(p＝0.064)。

以上结果表明实施例3中制备所得的透明质酸镁比透明质酸钠具有更好的缓解软骨退变的作用。因此，本发明的药物透明质酸镁治疗骨关节炎的疗效优于传统oa治疗药物透明质酸钠。