一种生物碱及其提取方法和应用与流程

本发明涉及生物碱制备领域，具体涉及一种生物碱及其提取方法和应用。

背景技术：

毛脉蓼(fallopiamultiflora(thunb.)harald.var.cillinerve(nakai)a.j.li)为蓼科何首乌属药用植物，其干燥块根除用作红药子外，在西北地区还作朱砂七或朱砂莲药用，产陕西秦岭和大巴山各县，湖北、四川、贵州也有少量分布。气微、味苦、微涩、性凉，有清热解毒、凉血止血、祛风湿、强腰膝等功能，用于胃肠炎、菌痢、扁桃体炎、月经不调、功能性子宫出血等。现代药理学研究证实其具有较强的抗菌、抗病毒等方面的活性。

根据报道，主要以毛脉蓼的干燥块根作为研究对象，毛脉蓼干燥块根中主要含有蒽醌类、黄酮类、多糖类、苷类等化合物，均具有一定的生物活性。然而未见植物毛脉蓼中有关生物碱的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种生物碱及其提取方法和应用，以克服上述现有技术存在的缺陷，本发明从毛脉蓼干燥块根中分离得到的结构新颖的化合物毛脉蓼新生物碱，且该生物碱有一定的抑菌活性。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种生物碱，该生物碱的化学结构式为：

一种生物碱的提取方法，包括以下步骤：

(1)将毛脉蓼干燥块根原料用乙醇浸提若干次，合并提取液并过滤，回收乙醇，滤液浓缩至无醇味，得到乙醇粗浸膏；

(2)将步骤(1)的得到的乙醇粗浸膏风干，得到干燥浸膏，然后向干燥浸膏加入水，混合成均匀的溶液a，溶液a中干燥浸膏和水的质量比为1:3，然后将溶液a先用乙酸乙酯萃取，再用正丁醇萃取，得到正丁醇浸膏；

(3)将步骤(2)得到的正丁醇浸膏在硅胶色谱柱上，分别用体积梯度为100:0、100:100、100:30、100:50、100:100、0:100的乙酸乙酯/甲醇洗脱剂进行洗脱，得到a-f六个组分，a组分继续在硅胶色谱柱上，用体积梯度为100:30、100:50、100:80、100:150、0:100的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂进行洗脱，得到a1-a5五个组分，将a1组分用甲醇进行重结晶，得到生物碱。

进一步地，还包括步骤(4)：取步骤(3)得的生物碱溶解于dmso后装入容器a中，将容器a放在盛有乙醚溶剂的容器b中，然后将容器b的口封好，静置待晶体析出，得到该生物碱的单晶。

进一步地，步骤(1)中的乙醇为体积分数为95％的工业乙醇。

进一步地，步骤(1)中将毛脉蓼干燥块根原料用乙醇浸提3次。

进一步地，步骤(4)中每50ml的dmso中溶解15mg生物碱。

生物碱在抑菌上的应用。

进一步地，所述抑菌指对细菌或真菌的抑制作用。

进一步地，所述抑菌指对油菜菌核病菌的抑制作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明的毛脉蓼生物碱是一种结构新颖的生物碱类化合物，其分子式为c18h23no3，另外本发明通过对毛脉蓼进行提取，得到此生物碱，通过对本发明生物碱的抑菌活性测试，发现该化合物有一定的抗真菌活性，尤其对油菜菌核病菌有很好的抑菌活性，为毛脉蓼干燥块根的抑菌活性成分，因此，可以用于农业防治和药剂防治技术。

附图说明

图1为本发明生物碱的¹h-nmr谱；

图2为本发明生物碱的¹³c-nmr谱；

图3为本发明生物碱的dept(135°)谱；

图4为本发明生物碱的谱cosy；

图5为本发明生物碱的noesy；

图6为本发明生物碱的谱hsqc；

图7为本发明生物碱的hmbc；

图8为本发明生物碱的hr-esi-m谱；

图9为本发明生物碱的x射线单晶结构图；

图10为本发明生物碱的结构片段；

图11为本发明生物碱的结构图。

具体实施方式

下面对本发明的实施方式做进一步详细描述：

一种生物碱类化合物，该化合物的化学结构式：

该化合物的提取方法如下：

(1)选用1.75kg毛脉蓼干燥块根原料药材用95％工业乙醇浸提3次，合并提取液并过滤，回收乙醇，滤液浓缩至无醇味，得到乙醇粗浸膏332.56g；

(2)将步骤(1)得到的乙醇粗浸膏风干得到干燥浸膏，按照干燥浸膏与水的重量比1.0:3.0往所述的干燥浸膏中加入水，混合成均匀溶液a，溶液a先用乙酸乙酯萃取，再用正丁醇萃取，得到乙酸乙酯浸膏33.72g，正丁醇浸膏169.54g；

(3)对步骤(2)的正丁醇浸膏，在硅胶色谱柱上，用不同梯度的乙酸乙酯/甲醇洗脱剂(100:0,100:100,100:30,100:50,100:100,0:100,v/v)进行洗脱，得到a-f六个组分，a组分继续在硅胶色谱柱上，用不同梯度的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂(100:30,100:50,100:80，100:150,0:100,v/v)进行洗脱，得到a1-a5五个组分，将a1组分用甲醇进行重结晶，得到纯净的生物碱1.47g。

(4)取步骤(3)得到的生物碱15mg，溶解于50ml的dmso装入小瓶中，将小瓶放在盛有乙醚溶剂的大瓶中，然后将大瓶的口封好，静置待晶体慢慢析出，平行实验10组，得到该化合物的单晶。

本发明制备的毛脉蓼生物碱是一种结构新颖的生物碱类化合物，目前从植物毛脉蓼的干燥块根中还未见分离到该类化合物的报道，也未见从其他植物中分离得到此化合物报道，更未见有人工合成此化合物的方法。我们对毛脉蓼干燥块根采用硅胶柱层析和重结晶的方法分离鉴定了一个结构新颖的生物碱类化合物，该化合物为首次报道。

本发明的新化合物毛脉蓼生物碱为无色片状晶体，hr-esi-ms在m/z324.1582处给出[m+na]⁺峰，推算其分子式为c18h23no3，¹h和¹³c核磁共振数据如表1所示，生物碱的晶体学数据如表2所示。

表1毛脉蓼生物碱的¹h和¹³c核磁共振数据

表2毛脉蓼新生物碱a的晶体学数据

通过对本发明化合物的抑菌活性测试，发现该化合物有一定的抗真菌活性，尤其对油菜菌核病菌有很好的抑菌活性，为毛脉蓼干燥块根的抑菌活性成分，因此，可以用于农业防治和药剂防治技术。

如图1-8所示，本发明生物碱的¹h-nmr、¹³c-nmr、dept、2dnmr(cosy、noesy、hsqc、hmbc)谱，以及hr-esi-m谱得知化合物结构。具体地说：

¹h-nmr(400hz,dmso-d6)谱中，δh9.51(1h,s)和9.25(1h,s)，提示结构中存在两个活泼氢；δh6.68(2h,d,j＝8.4hz)和6.94(2h,d,j＝8.4hz)，提示结构中存在一个aa'xx'的苯酚对取代片段；δh7.01(1h,d,j＝4.0hz)和6.23(1h,d,j＝4.0hz)，提示结构中存在一个2，5-二取代的吡咯环片段；δh4.36(2h,t,j＝15.2hz)，4.26(2h,s)，3.38(2h,t)，2.81(2h,t,j＝15.2hz,h-2')，1.49(2h,m,h-8)，1.31(2h,m)，提示结构中存在六个亚甲基片段；δh0.85(3h,t,j＝14.7)提示结构中存在一个端位甲基-ch3片段。

¹³c-nmr(100hz，dmso-d6)谱中，给出18个碳信号，其中δc179.30为羰基碳信号；δc69.29、63.09和47.11，提示结构中存在三个与吸电子基相连的亚甲基；dept(135^°)谱，提示结构中还存在其中六个次甲基碳，分别为δc129.58，123.73，115.15和110.78，其中δc129.58和115.15为苯环上的次甲基，由于该化合物为苯环对二取代，因此有两对化学环境完全相同的氢和碳，123.73和110.78是吡咯环上的次甲基。

hsqc谱给出结构中所有氢碳直接相连的信息，如表1所示。δh4.26与δc63.09和δh3.38与δc69.29相关提示结构中可能存在-ch2-o-ch2-片段；δh436与δc47.11相关提示结构中可能存在-ch2-n-片段；

hmbc谱中δh4.26与δc110.78、139.43相关，提示存在结构片段a1(如图10所示)；δh4.36与δc36.20相关，提示结构中存在-ch2-ch2-片段；δh4.36与δc128.37和131.77、139.43相关，提示存在结构片段a2(如图10所示)；δh9.51与δc131.77相关，提示结构中存在结构片段a3(如图10所示)。

noesy谱中，δh3.38与1.49、1.31相关，δh1.49与1.31、0.85相关，提示结构中存在结构片段-o-ch2ch2ch2ch3，将该片段与a1、a2、a3部分连接在一起，最终确定了化合物a的结构。该化合物为未见文献报道的新生物碱类化合物，相关nmr数据归属如表1所示。

x射线单晶结构图最终确定了该化合物的立体结构。

下面结合实施例对本发明做进一步说明：

毛脉蓼(fallopiamultiflora(thunb.)harald.var.cillinerve(nakai)a.j.li)干燥块根1.75kg，用95％工业乙醇浸提3次，合并提取液并过滤，回收乙醇，滤液浓缩至无醇味，得到乙醇粗浸膏332.56g；得到的上述乙醇粗浸膏干燥得到干燥浸膏，按照干燥浸膏与水的重量比1.0:3.0混合成均匀水溶液后，得到的水溶液先用乙酸乙酯萃取，再用正丁醇萃取，得到乙酸乙酯浸膏33.72g，正丁醇浸膏169.54g；将上述的正丁醇相浸膏用甲醇溶解后与170g二次硅胶混合拌样，应用硅胶柱层析，以不同梯度的乙酸乙酯/甲醇洗脱剂(100:0,100:100,100:30,100:50,100:100,0:100,v/v)进行洗脱，得到a-f六个组分，a组分继续在硅胶色谱柱上，用不同梯度的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂(100:30,100:50,100:80,100:150,0:100,v/v)进行洗脱，得到a1-a5五个组分，将a1组分用甲醇进行重结晶，得到纯净的生物碱化合物1.47g；取上述的化合物15mg，溶解于50ml的dmso装入小瓶中，将小瓶放在盛有乙醚溶剂的大瓶中，然后将大瓶的口封好，静置待晶体慢慢析出，平行实验10组，得到该化合物的单晶。

生物碱化合物毛脉蓼新生物碱a的抗细菌活性实验：

1、实验材料

1.1、受试样品

毛脉蓼生物碱用dmso溶解，配成500μg/ml的溶液。

1.2、菌株

两株革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、乳酸链球菌)、两株革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌)。

1.3、培养基

牛肉膏3.0g/l、nacl5.0g/l、蛋白胨10.0g/l、ph7.2-7.4。

1.4、其他材料

96孔板。

2、实验方法

96孔板每孔加入100μl上述培养基，100μl浓度为1×10⁶cfu/ml的细胞悬液，第一孔中加500μg/ml的样品溶液，利用二倍稀释法使样品浓度从第一孔到第十孔依次为500，250，125，62.5，31.2，15.6，7.81，3.91，1.95和0.975μg/ml，第十一孔和第十二孔分别加入100μl上述培养基和dmso作为对照。选用青霉素钠作为革兰式阳性菌的阳性对照，硫酸链霉素作为格兰是个阴性菌的阳性对照。上述每组进行3次平行实验，将96孔板置于37℃培养箱内孵育一天。

3、实验结果

结果见表3，结果显示，毛脉蓼生物碱对大肠杆菌和绿脓杆菌有一定的抑制活性，mic(最小抑菌浓度)为62.5μg/ml。

生物碱化合物毛脉蓼新生物碱a的抗真菌活性实验：

1、实验材料

1.1、受试样品

毛脉蓼生物碱用dmso溶解，配成500μg/ml的溶液。

1.2、菌株

七株植物病原真菌(苹果树腐烂病菌、玉米大斑病菌、番茄灰霉病菌、烟草赤星病菌、油菜菌核病菌、芍药炭疽病菌、小麦赤霉菌)。

1.3、培养基

200g马铃薯浸汁，葡萄糖20g、水1l。

1.4、其他材料

96孔板。

2、实验方法

96孔板每孔加入100μl上述培养基，100μl浓度为1×106cfu/ml的细胞悬液，第一孔中加500μg/ml的样品溶液，利用二倍稀释法使样品浓度从第一孔到第十孔依次为500，250，125，62.5，31.2，15.6，7.81，3.91，1.95和0.975μg/ml，第十一孔和第十二孔分别加入100μl上述培养基和dmso作为对照。选用多菌灵作为植物病原真菌的阳性对照。上述每组进行3次平行实验，将96孔板置于28℃培养箱内孵育两天。

结果见表3，结果显示，毛脉蓼生物碱对玉米大斑病菌和烟草赤星病菌有一定的抑制活性，mic(最小抑菌浓度)为62.5μg/ml，对油菜菌核病菌有相当的抑制活性，mic(最小抑菌浓度)为31.2μg/ml。

表3毛脉蓼生物碱的抑菌活性

其中：a:大肠杆菌；b:绿脓杆菌；c：金黄色葡萄球菌；d：乳酸链球菌；e：苹果树腐烂病菌；f：小麦赤霉菌；g：玉米大斑病菌；h：烟草赤星病菌；i：油菜菌核病菌；j：番茄灰霉病菌；k：芍药炭疽病菌；-：未设置实验。