一种碱‑酶耦合技术处理竹粉制备羧甲基纤维素钠的方法与流程

本发明涉及羧甲基纤维素钠的制备方法技术领域，特别涉及一种碱-酶耦合技术处理竹粉制备羧甲基纤维素钠的方法。

背景技术：

羧甲基纤维素钠(sodiumcarboxymethylcellulose，cmc)是天然纤维素经改性后的衍生物，为离子型、直链、水溶性的羧甲基纤维素醚的钠盐，是种类繁多、应用领域宽广、生产量大、研究价值高的一种纤维素衍生产品。由于其具有优异的性能和广泛的用途，cmc被誉为“工业味精”。cmc目前已广泛应用于造纸工业、油田开采、食品工业、医药工业、日用化工、陶瓷制造、纺织工业等各经济领域。在食品加工业中，主要作为增稠剂、成膜剂、稳定剂、固化剂及增量剂等。作为成膜剂时，cmc溶液和水溶性抗菌剂处理食品表面，生成表面光泽同时具有柔软性和透明性的薄膜，保鲜效果好；作为增稠剂和稳定剂时，即可增加粘度，又起到稳定食品结构、延长食品保质期的作用，常用于各种果酱、调味酱、雪糕及各种奶制品中；也可作为固形剂和增量剂，应用于冰淇淋、面点食品等。

长期以来，制备羧甲基纤维素钠主要以精制棉短绒、木材浆粕等为原料，其原料成本较高，而市场上对cmc的需求量越来越大，所以开发其他资源丰富、来源广泛、廉价的纤维素原料，便成为当下的一种趋势。竹制品加工副产物便是一种具有较高研究价值和和应用前景的原材料。其纤维素含量达45％～52％。作为全球竹类资源最丰富的国家，我国竹林面积达520多万公顷，占全国有林地面积的21.87％，竹产业总产值达700亿元以上，但大部分原料未得到更好利用。

竹子中的纤维素和半纤维素、木质素组成木质纤维素，其中半纤维素与木质素共价结合形成木质素-碳水化合物结构，再将纤维素包裹，三者结合牢固，难以完全分离。此外，该类生物质中还含有果胶、蛋白质、灰分等成分。目前，分离木质纤维素中纤维素的基本方法有酸水解与碱处理等方式的化学法、汽爆法、热-机械耦合开纤法等物理方法，以及酶催化水解、微生物发酵等生物处理法。采用单一化学或物理法，虽然效率较高，但随之产生设备腐蚀、环境污染、纤维素降解或者高能耗、高成本等问题，不利于可持续发展。以复合型纤维素酶催化反应为主的生物处理法条件温和、节能环保，但存在预处理周期长、效率低等问题。而纯化学法虽然效率较好，但污染大，不利于可持续发展。

因此，现有技术有待进一步改进和提高。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种碱-酶耦合技术处理竹粉制备羧甲基纤维素钠的方法，先将竹粉样品经化学法初步处理，再通过酶法处理，能够将得到的竹纤维素中包裹的木质素和半纤维素等物质有效分离去除，从而得到羧甲基纤维素钠。

本发明是这样实现的，还提供一种碱-酶耦合技术处理竹粉制备羧甲基纤维素钠的方法，包括以下步骤：

s1、竹粉预处理，利用碱-酶耦合法将竹粉加工成干燥的竹纤维，所述碱-酶耦合法包括如下步骤：

s11、称取3g～5g竹粉放入锥形瓶中，加入35ml～45ml的5％氢氧化钠溶液，置于恒温水浴振荡器中，温度45℃～60℃，时间0.5h～1.5h；

s12、之后迅速冷却，减压过滤，再用约380ml～420ml蒸馏水分次洗涤试样，取滤渣；

s13、加入25ml～35ml的400u/ml纤维素酶溶液，置于恒温水浴振荡器中，温度45℃～55℃，时间25min～35min；

s14、然后，减压过滤；将吸干后的试样放入电热恒温鼓风干燥箱中在125℃～145℃下烘干2h～4h，得到干燥的竹纤维；

s2：在250ml锥形瓶中加入95％乙醇35ml～45ml和35％氢氧化钠溶液4.0ml～4.8ml，充分搅拌后加入步骤s1制成的竹纤维2g，20℃～45℃温度下振荡搅拌反应1.0h～2.0h；

s3、在搅拌完成后，加入75％氯乙酸乙醇溶液5.5ml～6.0ml进行醚化，所述醚化反应温度为50℃～75℃，醚化反应60min～120min后60℃～80℃保温5min～15min，再40℃～60℃保温5min～15min；

s4、用31％冰醋酸调ph值至中性，减压过滤，再用75％乙醇洗涤2次，60℃～80℃真空烘干，得到羧甲基纤维素钠产品。

进一步地，如前述的碱-酶耦合技术处理竹粉制备羧甲基纤维素钠的方法，还包括一种所述纤维素酶最适合温度试验条件的测定方法，其包括如下步骤：

s01、取四支比色管编号1～4号，各加入6ml的1％羧甲基纤维素钠溶液；

s02、再在1号管加2ml蒸馏水，其他三支管各加入2ml以hac-naac缓冲液配制ph为5.5的400u/ml纤维素酶溶液，摇匀放入低温恒温水浴槽中并控制低温恒温水浴槽温度为37℃，水浴30min后取出；

s03、向各管分别加入2ml的dns试剂，再沸水浴中加热8min，迅速放入在冰水浴中，冷却至室温后，加蒸馏水定容到10ml；

s04、以1号比色管试液作为对照，在530nm波长条件下测量2～4号试液的吸光度；

s05、重复上述步骤s01～s04，将s02步骤中的低温恒温水浴槽温度分别控制在41℃、45℃、49℃、53℃、57℃、61℃条件下继续试验，分别测量2～4号试液的吸光度测定；

s06、比较上述各个不同温度条件下试验得到的吸光度测定值的大小，得出吸光度最大的温度条件为纤维素酶酶促反应的最适温度。

进一步地，如前述的碱-酶耦合技术处理竹粉制备羧甲基纤维素钠的方法，还包括一种所述纤维素酶最适合ph值试验条件的测定方法，其包括如下步骤：

t01、取两支比色管各加入6ml的1％羧甲基纤维素钠溶液；

t02、再各加入2ml、ph为4.0的hac-naac缓冲液配制1mg/ml纤维素酶溶液，摇匀放入低温恒温水浴槽中并控制低温恒温水浴槽温度为49℃，水浴30min后取出；

t03、向各管分别加入2ml的dns试剂，再沸水浴中加热5min，迅速放入在冰水浴中，冷却至室温后，加蒸馏水定容到10ml；

t04、在540nm波长条件下分别测量两支比色管试液的吸光度，取其平均值得到ph值4.0的纤维素酶混合溶液的吸光度平均值；

t05、重复上述步骤t01～t04，将t02步骤中的纤维素酶溶液的ph值分别控制在4.5、5.0、5.5、6.0条件下继续试验，分别测量两支比色管试液的吸光度测定；

t06、比较上述各个试验得到的吸光度平均值的大小，从而得到hac-naac缓冲液体系中纤维素酶溶液的吸光度最大的ph值条件为纤维素酶酶促反应最适ph值。

与现有技术相比，本发明的碱-酶耦合技术处理竹粉制备羧甲基纤维素钠的方法，以竹制品副产物的竹粉为原料，先将竹粉样品经化学法初步处理，再通过酶法处理，能够将木质纤维素中的包裹纤维素的木质素和半纤维素等物质有效分离去除，获得较高纯度的纤维素，制备羧甲基纤维素钠。利用本发明方法制备的羧甲基纤维素钠的取代度为0.95-1.07，1％的水溶液在25℃下的粘度可达到81mpa·s～220mpa·s，其技术指标符合中低粘度cmc的产品要求。本项目在原料预处理上采用生物-化学耦合方法，对环境污染少，成本相对较低，促进了绿色经济的发展，也为制备羧甲基纤维素钠提供新的途径。

附图说明

图1为本发明的7种竹粉预处理方法得到的竹纤维产物中α-纤维素含量的示意图；

图2为本发明的a：竹粉、b：碱-酶耦合法预处理竹粉、c：cmc产物、d：市售食品级cmc的红外光谱示意图；

图3为本发明的a：竹粉、b：碱解后的竹纤维、c：酶解后的竹纤维、d：碱-酶耦合法处理后的竹纤维及e：cmc产物的电镜扫描示意图；

图4为温度对纤维素酶的活性的影响曲线示意图；

图5为ph值对纤维素酶的活性的影响曲线示意图。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

本实施例的一种碱-酶耦合技术处理竹粉制备羧甲基纤维素钠的方法，包括以下步骤：

s1、竹粉预处理，利用碱-酶耦合法将竹粉加工成干燥的竹纤维，所述碱-酶耦合法包括如下步骤：

s11、称取4g竹粉放入锥形瓶中，加入40ml的5％氢氧化钠(naoh)溶液，置于恒温水浴振荡器中，温度50℃，时间1.0h；

s12、之后迅速冷却，减压过滤，再用约400ml蒸馏水分次洗涤试样，取滤渣；

s13、加入30ml的400u/ml纤维素酶溶液，置于恒温水浴振荡器中，温度49℃，时间30min；

s14、然后，减压过滤；将吸干后的试样放入电热恒温鼓风干燥箱中在135℃下烘干3h，得到干燥的竹纤维。

s2：在250ml锥形瓶中加入95％乙醇40ml和35％氢氧化钠(naoh)溶液4.4ml，充分搅拌后加入步骤s1制成的竹纤维2g，35℃温度下振荡搅拌反应2.0h。

s3、在搅拌完成后，加入75％氯乙酸乙醇溶液5.9ml进行醚化，所述醚化反应温度为70℃，醚化反应120min后70℃保温10min，再50℃保温10min。

s4、用31％冰醋酸调ph值至中性，减压过滤，再用75％乙醇洗涤2次，70℃真空烘干，得到羧甲基纤维素钠(cmc)产品。

其中，竹粉为竹或者竹废料去皮，加工成碎屑状，经水洗、烘干后用粉碎机粉碎，60目过筛备用，经检测其α-纤维素含量为43.2％(干重)，半纤维素含量为25.1％，木质素含量为15.2％。

实施例2：

本实施例的一种碱-酶耦合技术处理竹粉制备羧甲基纤维素钠的方法，包括以下步骤：

s1、竹粉预处理，利用碱-酶耦合法将竹粉加工成干燥的竹纤维，所述碱-酶耦合法包括如下步骤：

s11、称取3g竹粉放入锥形瓶中，加入35ml的5％氢氧化钠溶液，置于恒温水浴振荡器中，温度45℃，时间0.5h；

s12、之后迅速冷却，减压过滤，再用约380ml蒸馏水分次洗涤试样，取滤渣；

s13、加入25ml的400u/ml纤维素酶溶液，置于恒温水浴振荡器中，温度45℃，时间25min；

s14、然后，减压过滤；将吸干后的试样放入电热恒温鼓风干燥箱中在125℃下烘干2h，得到干燥的竹纤维。

s2：在250ml锥形瓶中加入95％乙醇35ml和35％氢氧化钠溶液4.0ml，充分搅拌后加入步骤s1制成的竹纤维2g，20℃温度下振荡搅拌反应1.0h。

s3、在搅拌完成后，加入75％氯乙酸乙醇溶液5.5ml进行醚化，所述醚化反应温度为50℃，醚化反应60min后60℃保温5min，再40℃保温5min。

s4、用31％冰醋酸调ph值至中性，减压过滤，再用75％乙醇洗涤2次，60℃真空烘干，得到羧甲基纤维素钠产品。

实施例3

一种碱-酶耦合技术处理竹粉制备羧甲基纤维素钠的方法，其特征在于，包括以下步骤：

s1、竹粉预处理，利用碱-酶耦合法将竹粉加工成干燥的竹纤维，所述碱-酶耦合法包括如下步骤：

s11、称取5g竹粉放入锥形瓶中，加入45ml的5％氢氧化钠溶液，置于恒温水浴振荡器中，温度60℃，时间1.5h；

s12、之后迅速冷却，减压过滤，再用约420ml蒸馏水分次洗涤试样，取滤渣；

s13、加入35ml的400u/ml纤维素酶溶液，置于恒温水浴振荡器中，温度55℃，时间35min：

s14、然后，减压过滤；将吸干后的试样放入电热恒温鼓风干燥箱中在145℃下烘干4h，得到干燥的竹纤维。

s2：在250ml锥形瓶中加入95％乙醇45ml和35％氢氧化钠溶液4.8ml，充分搅拌后加入步骤s1制成的竹纤维2g，45℃温度下振荡搅拌反应2.0h。

s3、在搅拌完成后，加入75％氯乙酸乙醇溶液6.0ml进行醚化，所述醚化反应温度为75℃，醚化反应120min后80℃保温15min，再60℃保温15min。

s4、用31％冰醋酸调ph值至中性，减压过滤，再用75％乙醇洗涤2次，80℃真空烘干，得到羧甲基纤维素钠产品。

对于竹粉预处理，还可以利用以下方法将竹粉加工成干燥的竹纤维，具体包括有水煮法、弱酸法、碱液法、酶解法、弱酸-酶解耦合法以及水煮-酶解耦合法。

竹粉预处理的水煮法包括以下步骤：称取4g竹粉3份，分别加入40ml蒸馏水，置于恒温水浴振荡器中，50℃反应1h后迅速冷却，减压过滤，用400ml蒸馏水分次洗涤试样，将滤渣放入135℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干3h。将烘干后的产物放入密封袋避光储存。

竹粉预处理的弱酸法包括以下步骤：称取4g竹粉3份，分别加入0.1mol/l盐酸溶液，置于恒温水浴振荡器中，50℃反应1h后迅速冷却，减压过滤，用400ml蒸馏水分次洗涤试样，将滤渣放入135℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干3h。将烘干后的产物放入密封袋避光储存。

竹粉预处理的碱液法包括以下步骤：称取4g竹粉3份，分别加入5％naoh溶液，置于恒温水浴振荡器中，50℃反应1h后迅速冷却，减压过滤，用400ml蒸馏水分次洗涤试样，将滤渣放入135℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干3h。将烘干后的产物放入密封袋避光储存。

竹粉预处理的酶解法包括以下步骤：称取4g竹粉，加入40ml400u/ml纤维素酶溶液，置于恒温水浴振荡器中，49℃反应30min后迅速冷却，减压过滤，用400ml蒸馏水分次洗涤试样，取滤渣于135℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干3h。将烘干后的产物放入密封袋避光储存。

竹粉预处理的弱酸-酶解耦合法包括以下步骤：称取4g竹粉3份，分别加入40ml0.1mol/l的盐酸溶液，置于恒温水浴振荡器中，50℃反应1h后迅速冷却，减压过滤，用400ml蒸馏水分次洗涤试样，取滤渣，加入30ml400u/ml纤维素酶溶液，置于恒温水浴振荡器中，49℃反应30min后减压过滤，取滤渣于135℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干3h，将烘干后的产物放入密封袋避光储存。

竹粉预处理的水煮-酶解耦合法包括以下步骤：称取4g竹粉3份，分别加入蒸馏水，置于恒温水浴振荡器中，50℃反应1h后迅速冷却，减压过滤，用400ml蒸馏水分次洗涤试样，取滤渣，加入30ml400u/ml纤维素酶溶液，置于恒温水浴振荡器中，49℃反应30min后减压过滤，取滤渣于135℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干3h，将烘干后的产物放入密封袋避光储存。

采用α-纤维素含量作为评判标准，将上述各种对竹粉预处理方法所获得的干燥的竹纤维产物进行α-纤维素含量测定和比较，发现各种预处理方法获得竹粉预处理后的竹纤维的α-纤维素含量均能达到≥70％，请参照图1所示。其中，采用碱-酶耦合法所得到竹纤维产物的α-纤维素含量明显高于其它处理方法，达87.7％～90.6％，分别比单独酶解法所得竹纤维产物的α-纤维素含量(75.5％)提高了16.2％～20.0％，比单独用碱液法处理所得竹纤维产物的α-纤维素含量(77.8％)提高了12.7％～16.5％。由此可见本发明的碱-酶耦合法具有明显的优势。图中*表示碱-酶耦合法所得到产物的α-纤维素含量与其他方法所得α-纤维素含量存在显著性差异(p＜0.05)。

本发明提到的α-纤维素含量测定方法，其测定样品的制备过程包括：量取30ml17.5％氢氧化钠加入瓷杯中，称取2.00g制备的竹纤维样品放入瓷杯中，搅拌均匀，盖上盖子；放置30min。每隔10min搅拌一次，每次搅拌约1min。30min后，加入30ml蒸馏水，搅拌，减压过滤，再将滤渣多次洗涤。加30ml体积分数为10％的冰乙酸溶液浸泡5min，再减压过滤，并用热蒸馏水洗涤至中性。将洗净的滤渣置135℃烘箱中烘3h，得到干燥的待测竹纤维样品。

利用红外光谱中羧甲基纤维素钠(cmc)的特征峰来对制成的cmc产物进行鉴定。红外光谱检测方法是：先取一些溴化钾和待测cmc样品混合，放入碾磨器中碾磨，碾磨到一定程度后放入烘干机中烘干，5min后取出，制压片，放入红外光谱仪中进行检测。

竹粉预处理前后样品a和b，和cmc产物c及标准品市售食品级cmc产物d的红外光图谱如图2所示。其中，cmc产物c是经本发明的碱-酶耦合技术处理竹粉制备羧甲基纤维素钠的方法所制备的。据文献报道，羧甲基纤维素钠(cmc)分别在1423cm^-1和1620cm^-1处具有特征峰。本发明所制备的cmc产物中能找到羧甲基纤维素钠(cmc)的特征峰的归属符合此特征，如图2中小箭头所指部位。可以得出，上述所制备的产物符合羧甲基纤维素钠(cmc)产品特性。

cmc产物的粘度测定方法：称取2gcmc产物，放入烧杯中，加入98ml蒸馏水，用磁力搅拌机搅拌2.5h，减压过滤，烘干，得到滤渣质量m1，得到cmc产物中纯cmc含量为w，根据比例，按所需2g纯cmc称取m2cmc产物，重复上述溶解步骤，并测粘度。

式中：w为cmc产物中纯cmc的含量(％)，m1为cmc产物中未溶杂质的质量(g)，m2为cmc产物的质量。

经测定，利用本发明的方法制备的cmc产物其1％水溶液在25℃下的粘度达到81mpa·s～220mpa·s，高于其它处理方法原料所制备cmc的粘度，符合中低粘度cmc的技术指标。ph7.2，取代度0.95-1.07之间。

利用扫描电子显微镜检测cmc的方法：所测cmc样品喷金粉进行导电处理，使用tm-1000扫描电子显微镜进行检测。

利用扫描电子显微镜分别对竹粉预处理前样品a、竹粉经碱解预处理后样品b、竹粉经酶解预处理后样品c、竹粉经碱-酶耦合法预处理后样品d以及cmc产物e进行检测，得到如图3所示的电镜扫描图。其中，cmc产物是利用本发明方法制备的。从图上可以看出，竹屑的纤维成束，表面光滑，结构致密，如图3-a所示。经碱解法或酶解法预处理后，纤维素分成小束，其结构松散，如图3-b和3-c所示。而碱-酶耦合法得到的纤维素结构更加松散，有利于下一步的处理，如图3-d所示。cmc产物的表面被破坏，结构变得更加松散，并显示出盐的特征，如图3-e所示。

在本发明中，使用到纤维素酶，为了使得在加工过程中纤维素酶的酶活性最强，使用纤维素酶时有最适合的温度和ph值条件。纤维素酶在一定条件下能将羧甲基纤维素钠水解，产生还原糖，利用dns法测定反应产生的还原糖，从而获得纤维素酶的最适反应条件。利用纤维素酶适度酶解可使纤维素聚合度下降，松解木质纤维素结构，使纤维素与木质素、半纤维素解离，获得较高纯度的纤维素制品。

因为ph过高或过低可导致酶高级结构的改变，使酶失活，又称为酸变性或碱变性。再者，酶具许多可解离的集团，在不同的ph环境中，这些基团的解离状态不同，所带电荷不同，它们的解离状态对酶与底物的结合能力以及酶的催化能力都有重要作用，因此溶液ph的改变可通过影响这些基团的解离状态来影响酶活性。而且，ph通过影响底物的解离状态以及中间复合物es的解离状态影响酶促反应速率。若其他条件不变，酶只有在一定的ph范围内才能表现催化活性，且在某一ph下，酶促反应速率最大，此ph称为酶的最适ph值。在本发明的纤维素酶最适合试验条件采用如下方法得出的。

本发明还公开了一种所述纤维素酶最适合温度试验条件中的温度测定方法，其包括如下步骤：

s01、取四支比色管编号1～4号，各加入6ml的1％羧甲基纤维素钠(cmc)溶液。

s02、再在1号管加2ml蒸馏水，其他三支管各加入2ml以hac-naac缓冲液配制ph为5.5的400u/ml纤维素酶溶液，摇匀放入低温恒温水浴槽中并控制低温恒温水浴槽温度为37℃，水浴30min后取出。

s03、向各管分别加入2ml的dns试剂，再沸水浴中加热8min，迅速放入在冰水浴中，冷却至室温后，加蒸馏水定容到10ml。

s04、以1号比色管试液作为对照，在530nm波长条件下测量2～4号比色管试液的吸光度。

s05、重复上述步骤s01～s04，将s02步骤中的低温恒温水浴槽温度分别控制在41℃、45℃、49℃、53℃、57℃、61℃条件下继续试验，分别测量2～4号试液的吸光度测定。

s06、比较上述各个不同温度条件下试验得到的吸光度测定值的大小，得出吸光度最大的温度条件为纤维素酶酶促反应的最适温度。

上述试验得到如图4所示的温度-相对酶活力的对应曲线。当温度低于49℃时，纤维素酶活性随温度的升高而增加；当温度高于49℃时，纤维素酶活性随温度的降低而减小。

本发明还公开了一种所述纤维素酶最适合ph值试验条件中的ph值测定方法，其包括如下步骤：

t01、取两支比色管各加入6ml的1％羧甲基纤维素钠(cmc)溶液。

t02、再各加入2ml、ph为4.0的hac-naac缓冲液配制1mg/ml纤维素酶溶液，摇匀放入低温恒温水浴槽中并控制低温恒温水浴槽温度为49℃，水浴30min后取出。

t03、向各管分别加入2ml的dns试剂，再沸水浴中加热5min，迅速放入在冰水浴中，冷却至室温后，加蒸馏水定容到10ml。

t04、在530nm波长条件下测量两支比色管试液的吸光度，取其平均值得到ph值4.0的纤维素酶混合溶液的吸光度平均值。

t05、重复上述步骤t01～t04，将t02步骤中的纤维素酶溶液的ph值分别控制在4.5、5.0、5.5、6.0条件下继续试验，分别测量两支比色管试液的吸光度测定。

t06、比较上述各个试验得到的吸光度平均值的大小，从而得到hac-naac缓冲液体系中纤维素酶溶液的吸光度最大的ph值条件为纤维素酶酶促反应最适ph值。

上述试验得到试验数据如下：

表1、不同ph值条件下，纤维素酶溶液的吸光度测量数据及平均值

以ph为横坐标，od540nm为纵坐标，可得到一条ph-od值曲线，由于od值与纤维素酶活力成正比，从中可确定纤维素酶的最适ph值。将最高od值定义为相对酶活力100％，则纵坐标数值可转换为相对酶活力，请参照图5所示。当ph值小于5.5时，纤维素酶活性随ph值的增大而增加；当ph值大于5.5时，纤维素酶活性随ph值的增大而降低。

综合上述实验结果，所用的纤维素酶最适反应温度为49℃、ph值为5.5。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。