具有解钾、解磷和降解有机磷农药活性的黑曲霉JXJA01及其应用的制作方法

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种具有将难溶性钾、有机磷和无机磷转化为可溶性钾和磷的黑曲霉jxja01在微生物肥料方面的应用，以及涉及具有降解有机磷农药的黑曲霉jxja01在降低农田有机磷农药残留，改良和修复农田土壤方面的应用。

背景技术：

磷素是植物正常生长发育不可缺少的必需元素。土壤中95％以上的磷元素为植物难以直接吸收利用的不溶性磷，我国约74％的农田耕地土壤缺磷，施用有机和化学磷肥是土壤磷的主要来源。然而土壤矿物质对磷元素具有很强的反应性，往往容易形成难溶性无效磷酸盐，导致施入的磷肥当季利用率只有5％～25％。磷肥主要来自磷矿粉，但磷矿粉是不可再生资源，将在50～100年内耗完，因此，如何增加土壤中可溶性磷元素含量，提高磷肥利用效率，是农业亟需解决的问题。

钾素是植物生长发育必需的大量元素之一。一般生产条件下，作物需钾量与氮相当。虽然土壤中含有大量钾元素(地壳所有矿质营养元素中居第4位)，但90％以上为植物不能吸收利用的无效钾。虽然我国不溶性钾矿资源丰富，但可溶性钾矿资源相对匮乏，50-70％用量依赖于进口。农田亏缺有效钾已成为我国农业生产持续发展的限制因素之一。因此，如何将土壤中不溶性的无效钾转变为可溶性有效钾，在缓解我国可溶性钾矿资源匮乏，和促进农业可持续发展方面具有重要意义。许多微生物可溶解钾矿石，使不溶性无效钾变为可溶性有效钾，目前研究多为解钾细菌，丝状霉菌则较少报道。霉菌由于菌丝发达，可利用各种农业废弃物进行固体发酵，生长迅速，孢子产量高，适合用来快速生产微生物固体肥料。

在过去几十年，我国农业以使用大量化肥和有机磷农药为特征，导致土壤污染严重，特别是农药残留量高，严重影响农作物的品质和现代生态农业的发展。微生物对许多有毒物质都具有很强的钝化和降解作用，使可溶性镉和铅等有害重金属钝化为不溶性镉和铅，降低作物吸收，将农药等有毒物质降解为无毒物质，甚至降解为对植物生长有益的营养成分。因此，在土壤中施加相关微生物，可有效降低重金属污染，和农药在土壤中的残留量和残留期，改善土壤质量，提高农作物的品质，促进生态农业的发展。

技术实现要素：

本发明的目的是在于针对现代生态农业可持续发展的需要，提供一种能够高效降解难溶性钾、有机磷与无机磷为可溶性钾和磷的黑曲霉jxja01，该黑曲霉jxja01能够将有机磷农药降解为无毒的正磷酸盐，消除土壤中有机磷农药的残留，并为植物提供可吸收的有效磷。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种具有解钾、解磷和降解有机磷农药活性的黑曲霉jxja01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号cgmccno.13775，保藏日期为2017年04月20日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，电话：86-10-64807355。

本发明涉及的曲霉jxja01产生褐黑色放射状分生孢子头，分生孢子梗着生于球形顶囊上，成串黑色球形分生孢子着生于分生孢子梗上，与黑曲霉的典型形态学特征相符。菌株jxja01在多种农业废弃物培养基上生长良好，并产生大量黑色孢子；孢子能够在15-47℃条件下萌发生长，最佳萌发生长温度为28-37℃；孢子在65℃的湿热条件下处理30min后仍然能够萌发；孢子在ph2-12的条件下能够萌发生长，最适萌发生长ph值为4-8左右；孢子和菌丝体均对有机磷农药(如氧乐果)具有一定的耐受性和降解作用。经与genbank数据库中的its序列和18srrna基因序列比较分析发现，该菌its序列片段(591bp)与黑曲霉的相似性达100％，18srrna基因序列(1709bp)与黑曲霉的相似性为99％，结合上述形态学特征，将菌株jxja01鉴定为黑曲霉(aspergillusniger)，命名为黑曲霉jxja01，该菌株的18srrna基因序列和its序列在genbank中的登录号分别是mf145518和mf543023，具体请见seqidno:1和seqidno:2。

本发明提供的具有解钾、解磷和降解有机磷农药活性的黑曲霉jxja01，采用中华人民共和国国家标准gb/t8574-2010中的四苯硼酸钾重量法检测，在实验室条件下，接种该菌孢子和菌丝体并培养10d后，它们从难溶性钾矿粉中释放可溶性钾的量分别比空白对照组高158.08mg·l^-1和261.16mg·l^-1。

因此，本发明还涉及上述具有解钾、解磷和降解有机磷农药活性的黑曲霉jxja01在将土壤中难溶性钾转化为植物可吸收的可溶性钾的应用。

本发明提供的具有解钾、解磷和降解有机磷农药活性的黑曲霉jxja01，按照中国农业部行业标准ny/t1847-2010的方法检测，接种孢子并培养4-10d后，磷酸钙(20g/l)、磷酸镁(20g/l)、磷酸铝(10g/l)、磷酸铁(10g/l)、植酸钙(20g/l)、卵磷脂(2g/l)和磷矿粉(10g/l，p2o5含量约为25％)培养基的培养液中可溶性磷元素最高含量分别比未接菌的对照组高3784mg/l、4698mg/l、813mg/l、168mg/l、3082mg/l、81mg/l、509mg/l，对这7种磷源的降解率分别为94.66％、100％、32.72％、15.42％、59.68％、100％、46.61％。

因此，本发明还涉及上述具有解钾、解磷和降解有机磷农药活性的黑曲霉jxja01在将土壤中各难溶性有机磷和无机磷转化为植物可吸收的可溶性磷的应用。

本发明提供的具有解钾、解磷和降解有机磷农药活性的黑曲霉jxja01，其孢子和菌丝体接种于体积浓度为0.1％的40％氧乐果乳油解磷培养基中，5d后培养液中可溶性磷酸盐浓度分别比对照组高11.77mg·l^-1和6.79mg·l^-1。

因此，本发明还涉及上述具有解钾、解磷和降解有机磷农药活性的黑曲霉jxja01在消除土壤中有机磷农药，改良和修复有机磷农药污染土壤的应用。

本发明提供的具有解钾、解磷和降解有机磷农药活性的黑曲霉jxja01，将菌株jxja01接种无菌麦麸上并培养，待形成大量黑色孢子后，再加入饲料，连续饲喂昆明小鼠4周，小鼠生长正常，未出现死亡现象，说明该菌及其代谢产物对小鼠等动物没有致病性或毒性。

本发明还提供两种黑曲霉jxja01固体多功能菌肥和土壤改良修复剂的制备方法。

方法一：将黑曲霉jxja01的孢子接种于无菌的pda液体培养基或其它无菌液体培养基(包括食品加工厂等产生的高bod值的废液等)，28℃、160rpm的条件下培养1-2d后，喷洒接种到经高温堆积发酵处理(或高温蒸汽灭菌处理)的各种农业废弃物(或废弃食用菌菌糠等)、禽畜粪便、磷矿粉和钾矿粉的混合物，于30℃左右、相对湿度85％～90％条件下培养3-6d，长出大量黑色孢子后，通过自然通风干燥或热空气干燥等方法干燥后，根据植物生长需要，加入适量微量元素，混合均匀即可用造粒机制成颗粒，即得到含有大量可溶性磷钾等矿物质元素、丰富的n和有机质、高密度的黑曲霉活孢子的高效、环保的多功能黑曲霉菌肥。

方法二：将各种农业废弃物(或废弃食用菌菌糠等)、禽畜粪便、磷矿粉和钾矿粉等固体混合物(质量比为60:20:10:10)接入黑曲霉jxja01液体菌种，并堆积高温发酵5-10d，再晒干或自然风干或热空气干燥，备用。将黑曲霉jxja01的孢子接种于无菌的pda液体培养基或其它无菌液体培养基(包括食品加工厂等产生的高bod值的废液等)，28℃、160rpm的条件下培养2d后，喷洒接种到无菌的麦麸和秸秆混合(质量比为1:1)固体培养基上，培养3-6d，待长出大量黑色孢子后，按照一定的比例，与堆积高温发酵处理的干燥固体混合物混合均匀，再利用造粒机对混合物进行造粒，即得到含有大量可溶性磷钾等矿物质元素、丰富的n和有机质、高密度的黑曲霉活孢子的高效、环保的多功能黑曲霉菌肥。

本发明的技术效果：该黑曲霉jxja01无毒，具有将难溶性钾、有机磷和无机磷转化为可溶性钾和磷作用，可降低农田有机磷农药残留，改良和修复农田土壤，可配置黑曲霉jxja01固体多功能菌肥和土壤改良修复剂，用作肥料和土壤修复剂。

说明书附图

图1菌株jxja01在磷酸钙和植酸钙平板上形成的溶磷圈。

图2菌株jxja01对难溶性解钾矿石的降解能力。

图3接种菌株jxja01菌丝体后有机磷农药氧乐果培养基中可溶性磷含量的变化。其中，a为40％氧乐果乳油含量为0.1％(v/v)；b为40％氧乐果乳油含量为0.2％(v/v)；c为40％氧乐果乳油含量为0.3％(v/v)；d为40％氧乐果乳油含量为0.4％(v/v)；e为40％氧乐果乳油含量为0.5％(v/v)。

图4接种菌株jxja01孢子后有机磷农药氧乐果培养基中可溶性磷含量的变化。其中，a为40％氧乐果乳油含量为0.1％(v/v)；b为40％氧乐果乳油含量为0.2％(v/v)。

具体实施方式

1解磷曲霉的筛选

固体平板筛选：将采自江西省九江市的森林土壤用无菌水进行梯度稀释，取适当梯度的稀释液0.2ml，涂布于中国农业部行业标准ny/t1847-2010的解磷固体培养基上(葡萄糖10g，(nh4)2so40.5g，nacl0.3g，mgso4·7h2o0.3g，kcl0.3g，feso4·4h2o0.036g，mnso4·4h2o0.03g，磷酸钙或植酸钙10g，琼脂18g，蒸馏水1000ml，ph7.0)，并于28℃培养箱中培养1-7d后，观察菌的生长情况，及各菌落周围是否出现解磷圈，选择解磷圈明显的菌株jxja01(图1)进行后续研究。

2黑曲霉jxja01的鉴定

根据培养特征、形态特征、18srrna基因序列和its序列分析等方法，对解磷活性很强的霉菌jxja01进行鉴定。该菌菌丝发达、分枝多，初期为灰白色，后变为褐黑色，并产生褐黑色放射状分生孢子头，分生孢子梗着生于球形顶囊上，成串黑色球形分生孢子着生于分生孢子梗上，这些均属于黑曲霉的典型形态学特征。经与genbank数据库中的its序列和18srrna基因序列比较分析发现，该菌its序列片段(591bp)与黑曲霉的相似性达100％，18srrna基因序列(1709bp)与黑曲霉的相似性为99％，综合形态学特征、its序列和18srrna基因序列分析结果，将菌株jxja01鉴定为曲霉(aspergillussp.)，命名为黑曲霉jxja01，该菌株的18srrna基因序列和its序列在genbank数据库中的登录号分别是mf145518和mf543023，具体请见seqidno：1和seqidno：2。该菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号cgmccno.13775，保藏日期为2017年04月20日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，电话：86-10-64807355。

3黑曲霉jxja01的解钾活性

将菌株jxja01孢子悬液或菌丝体接入液体解钾培养基(10g葡萄糖，0.3gnacl，1gnano3，0.5gna2hpo4，0.5gmgso4·7h2o，0.01gfeso4·7h2o，钾矿石粉末10g，1000ml蒸馏水，ph7.4～7.6，121℃灭菌30min)中，28℃、160rpm条件下培养，每2d取样一次，样品在4500rpm条件下离心，采用中华人民共和国国家标准gb/t8574-2010中的四苯硼酸钾重量法测定上清液中的可溶性钾元素含量。随着培养时间的延长，培养基中的钾矿粉逐渐消失，培养液中可溶性钾元素含量迅速增加，10d后接入孢子和菌丝体的培养液中的可溶性钾元素含量分别比对照组高(158.08±12.43)mg·l^-1和(261.16±20.53)mg·l^-1(图2)，同时培养液的ph下降到2.4左右，因此，该菌具有很强的解钾活性，产生有机酸是其解钾的机制之一。

4黑曲霉jxja01的解磷活性

将黑曲霉jxja01孢子悬液接入液体解磷培养基(葡萄糖10g，(nh4)2so40.5g，nacl0.3g，mgso4·7h2o0.3g，kcl0.3g，feso4·4h2o0.036g，mnso4·4h2o0.03g，蒸馏水1000ml，调ph7.0后加入磷源，其中磷酸铁、磷酸铝和磷矿粉均为10g/l，卵磷脂2g)或者(葡萄糖20g，(nh4)2so41g，nacl0.6g，mgso4·7h2o0.6g，kcl0.6g，feso4·4h2o0.072g，mnso4·4h2o0.06g，蒸馏水1000ml，调ph7.0后加入磷源，磷酸钙、植酸钙和磷酸镁均为20g/l)中，使孢子最终浓度为10⁵～10⁶cfu·ml^-1，于28℃、160rpm条件下培养，每24h取样一次，样品在4500rpm条件下离心，上清液按照中国农业部行业标准ny/t1847-2010的方法检测其可溶性有效磷元素的浓度，以去离子水为参比调零，以不接菌的空白培养基作为对照组。结果发现，培养4-10d后，在磷酸钙、磷酸镁、磷酸铝、磷酸铁、植酸钙、卵磷脂和磷矿粉培养液中可溶性磷元素最高含量分别比未接菌的对照组高3784mg/l、4683.2mg/l、813mg/l、168mg/l、3082mg/l、94mg/l和512mg/l(表1)，对这7种磷源的降解率分别为94.66％、100％、32.72％、15.42％、59.68％、100％、47.23％，同时培养液的ph下降(表1)，说明产生有机酸是该菌的解磷机制之一。

表1接入黑曲霉孢子培养后培养液中可溶性磷元素含量(mg·l^-1)和ph变化

5黑曲霉jxja01对有机磷农药的耐受性及降解效果

将中国农业部行业标准ny/t1847-2010的解磷培养基配方中的磷源去除，灭菌后加入0.1％～0.5％(v/v)的40％氧乐果乳油，接种菌丝体或孢子，在28℃、160rpm的条件下培养，每24h取样一次，观察菌丝生长状况和孢子萌发情况，样品在4500rpm条件下离心，上清液按照中国农业部行业标准ny/t1847-2010的方法检测其可溶性有效磷元素的浓度，以不接菌的空白培养基作参比调零，结果发现，黑曲霉jxja01的菌丝体在含0.3％(v/v)的40％氧乐果乳油解磷培养基中能够存活，虽然在含0.4％～0.5％(v/v)的40％氧乐果乳油解磷培养基中菌丝体死亡，但接入的菌丝体依然能够将氧乐果农药降解为可溶性磷(图3)，这说明黑曲霉jxja01菌丝体中含有降解氧乐果的酶；黑曲霉jxja01的孢子在含0.3％(v/v)的40％氧乐果乳油解磷培养基中不能萌发，但40％氧乐果乳油体积浓度降低到0.2％时，该菌的孢子第4d能够萌发，当40％氧乐果乳油体积浓度降低到0.1％时，对孢子的萌发抑制作用很小，1d后孢子萌发并形成大量菌丝体，孢子萌发后即开始发挥降解氧乐果的作用，导致氧乐果培养基中的可溶性磷含量迅速增加(图4)，而且孢子萌发后生长形成的菌丝体对氧乐果的降解作用更强。

6黑曲霉jxja01对昆明小鼠的毒性

将黑曲霉jxja01培养液接种于无菌麦麸并培养，待菌丝生长形成大量黑色孢子后再按照1:2(质量比，培养物:饲料)混入饲料，用混合物连续饲喂昆明小鼠4周，小鼠生长正常，说明该菌菌丝体、孢子及其代谢产物对小鼠等动物没有毒性。

7黑曲霉jxja01菌肥的生产

方法一：将干燥的各种农业废弃物(或废弃食用菌菌糠等)、禽畜粪便、磷矿粉和钾矿粉等固体，按照质量比为60:20:10:10进行混合，混合均匀后进行堆积高温发酵处理5-10d或高温蒸汽灭菌处理，备用。将黑曲霉jxja01的孢子接种于无菌的pda液体培养基或其它无菌液体培养基(包括食品加工厂等产生的高bod值的废液等)，28℃、160rpm的条件下培养2d后，喷洒接种到上述处理过的固体混合培养基上(固体培养基厚度约10-15cm)，于30℃左右、相对湿度85％～90％条件下培养3-6d，长出大量黑色孢子后，通过自然通风或热空气等方法干燥后，根据植物生长需要，加入适量的硼、硒等微量元素，混合均匀后用造粒机制成颗粒，即得到含有大量可溶性磷钾等矿物质元素、丰富的n和有机质、高密度的黑曲霉活孢子的高效、环保的多功能黑曲霉菌肥。

方法二：将各种农业废弃物(或废弃食用菌菌糠等)、禽畜粪便、磷矿粉和钾矿粉等固体混合物(质量比为60:20:10:10)接入黑曲霉jxja01液体菌种，并堆积高温发酵5-10d，再晒干或自然风干或热空气干燥至含水量约为10％-15％左右，备用。将黑曲霉jxja01的孢子接种于无菌的pda液体培养基或其它无菌液体培养基(包括食品加工厂等产生的高bod值的废液等)，28℃、160rpm的条件下培养2d后，喷洒接种到无菌的麦麸和秸秆混合(质量比为1:1)固体培养基上，培养3-6d，待长出大量黑色孢子后，按照一定的比例，与堆积发酵并干燥的农业废弃物(或废弃食用菌菌糠等)、禽畜粪便、磷矿粉和钾矿粉的固体堆积发酵物混合，调节混合物的黑曲霉活孢子数达到0.2亿个/g以上，再利用造粒机对混合物进行造粒，即得到含有大量可溶性磷钾等矿物质元素、丰富的n和有机质、高密度的黑曲霉活孢子的高效、环保的多功能黑曲霉菌肥。

序列表

<110>张炳火

<120>具有解钾、解磷和降解有机磷农药活性的黑曲霉jxja01及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1709

<212>dna

<213>黑曲霉(aspergillusniger)

<400>1

agaaagcatgtctagtataagcactttatactgtgaaactgcgaatgggctcattaaatc60

agttatcgtttatttgatagtaccttactacatggatacctgtggtaattctagagctaa120

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<213>黑曲霉(aspergillusniger)

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