用于PCR扩增的标本及其制备方法、保存方法和使用方法与流程

本发明涉及pcr
技术领域：
，具体涉及一种用于pcr扩增的标本及其制备方法、保存方法和使用方法。
背景技术：
：pcr是分子生物学的重要平台，通过对“核酸信号的放大”，进行遗传物质进行分析。传统pcr方法提取核酸是必不可少的步骤，这样必然经过一个繁琐的过程，而且对核酸的完整性有较大的伤害，含量上的损失也大。现有技术中的试剂可以对血液、细胞等标本直接进行pcr，但效果不确定，试剂间差别较大，通用性不强。因此，还需要开发简单且标本可长期保存的制备用于pcr扩增的标本的方法。技术实现要素：针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种用于pcr扩增的标本及其制备方法、保存方法和使用方法，制备方法操作简单，试剂便宜易得，易于开展，且对基因组dna损伤小；制备得到的标本可在甲醇和冰醋酸中长期-30℃保存，通过对细胞的长期保存，实现了对rna的长期保存，使用时干燥后提取，而后进行下游实验即可。为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：第一方面，本发明提供了一种用于pcr扩增的标本的制备方法，包括如下步骤：s1：将有核细胞的标本置于第一离心管中，加入预混液后颠倒混匀，然后室温静置预设时间；s2：将经过步骤s1处理的第一离心管离心，去除第一离心管内的上清液；s3：在经过步骤s2处理的第一离心管内加入固定液，重悬细胞后，将得到的混合物转移至第二离心管，室温静置预设时间；s4：将经过步骤s3处理的第二离心管离心，去除第二离心管内的上清液；s5：在经过步骤s4处理的第二离心管内加入固定液，重悬细胞，得到用于pcr扩增的标本。在本发明的进一步实施方式中，步骤s1中，预混液的原料组分包括第一溶液和第二溶液，第一溶液和第二溶液的体积比为8：1；第一溶液为低渗液，低渗液为摩尔浓度为0.075mmol/l的氯化钾溶液，第二溶液是体积比为3：1的甲醇和冰乙酸的混合溶液；预混液的制备方法包括步骤：将第一溶液预热至37℃，然后和第二溶液混合均匀。需要说明的是，第一溶液的配制方法可以是：称取5.6gkcl，加纯水溶解后，定溶至1000ml，室温保存；第二溶液为carnoy固定液，甲醇和冰乙酸按体积比3：l混合，现用现配，室温保存；预混液的制备方法可以是：12ml37℃第一溶液+1.5ml第二溶液，现用现配；破红细胞后，溶液呈暗黑色。本发明中，第一溶液具有低渗作用，可以使细胞膨胀、染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开。第二溶液中的甲醇可迅速穿透组织，沉淀蛋白质，具有脱水性，可使蛋白质的不可逆转的变性；乙酸可使核酸沉淀，组蛋白溶解；在染色体结构的研究中，乙酸的主要用途是阻止染色体收缩，使染色体结构免于破坏；经乙酸固定的物质，还能抵消甲醇的硬化作用；并且乙酸溶液还可以起破碎红细胞的作用。在本发明的进一步实施方式中，步骤s3和步骤s5中，固定液是体积比为3：1的甲醇和冰乙酸的混合溶液。在本发明的进一步实施方式中，步骤s1中，有核细胞的标本是经过edta和/或肝素抗凝的有核细胞的标本，有核细胞的标本包含(1～3)×107个有核细胞；第一离心管的体积为15ml，加入预混液后得到的混合物的体积为12ml，预设时间为9～11min。在本发明的进一步实施方式中，步骤s2中，离心的转速为1900～2100rpm，离心的时间为4～6min。在本发明的进一步实施方式中，步骤s3中，固定液的加入量为1ml，第二离心管的体积为1.5ml，预设时间为4～6min；步骤s4中，离心的转速为1900～2000rpm，离心的时间为4～6min，去除第二离心管内的上清液是采用纸巾和/或纱布吸弃上清液。在本发明的进一步实施方式中，步骤s5中，固定液的加入量为1ml，重悬为盖管手动摇动重悬。第二方面，本发明还保护采用上述的方法制备得到的用于pcr扩增的标本。第三方面，本发明提供了用于pcr扩增的标本的保存方法：若临时备用，可将用于pcr扩增的标本放置于4℃保存；若长期储存，可将用于pcr扩增的标本放置于-30℃保存。第四方面，本发明还提供了用于pcr扩增的标本的使用方法，包括如下步骤：取1μl用于pcr扩增的标本于pcr管中，室温干燥后，在pcr管中加入反应液，然后进行pcr扩增；其中，干燥的时间为5～10min。需要说明的是，取1～2μl用于pcr扩增的标本为模板前，轻轻摇动或吹吸重悬细胞，不要剧烈震荡；放有标本的pcr管一定要充分干燥，否则影响下游实验。本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本发明提供的用于pcr扩增的标本的制备方法操作简单，试剂便宜易得，易于开展；制备得到的标本可在甲醇和冰醋酸中长期-30℃保存，通过对细胞的长期保存，实现了对rna的长期保存，使用时干燥后提取，而后进行下游实验即可；(2)本发明提供的用于pcr扩增的标本的制备方法，对基因组dna损伤小：因为该方法在改进前就用于染色体核型分析的标本制备，目的是在显微镜下观察染色体形态，即得到的染色体是完整的，那么用该方法也就顺理成章的得到了最完整的基因组dna；因此，使用该方法可以很方便的、有效的对基因组dna进行pcr扩增实验，也可以经过重新提取后gdna后进行下游实验；(3)本发明提供的用于pcr扩增的标本的制备方法，可以对肝素抗凝标本进行后续实验，操作改进后仍然不影响细胞遗传学分析。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明图1为本发明实施例一中验证固定液的残留是否对扩增产生影响的结果图；图2为本发明实施例二中制备得到的用于pcr扩增的标本的示意图；图3为本发明实施例三中不同模板量下对gdna直接扩增的结果图；图4为本发明实施例四中用不同基因片段的引物直接对基因组dna进行扩增的结果图；图5为本发明实施例五中不同酶直接对基因组dna进行扩增的第一结果图；图6为本发明实施例五中不同酶直接对基因组dna进行扩增的第二结果图；图7为本发明实施例六中留存一年半后的两个标本的基因组dna进行扩增的结果图；图8为本发明实施例八中提取rna并且反转录的结果图；图9为本发明实施例九中b3标本基因组dna进行扩增的结果图；图10为本发明实施例九中d3标本基因组dna进行扩增的结果图；图11为本发明实施例九中核型分析的结果图；图12为本发明实施例九中fish检测的结果图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。实施例一：验证固定液的残留是否对扩增产生影响用cepba基因某一段的引物及kitexon11的引物扩增dna样本(50ng)，在此过程中，分别加入不同量的固定液(分别加入0.2μl、0.5μl、1μl)以及不加作为对照，扩增试剂采用高保真且本身耐受能力很强的q52xmastermix(可以直接扩增全血样本)，实验固定液扩增有没有影响。实验条件：20μl体系，引物2μl。9℃2min→(98℃10sec→68℃10sec→72℃20sec)×35cycles→72℃2min→4℃。实验结果：结果如图1所示，说明固定液会抑制pcr反应，处理过程中必须挥发干净。实施例二：用于pcr扩增的标本的制备本实施例用日常工作中有剩余的血，采用本发明提供的于pcr扩增的标本的制备方法进行标本制备，包括如下步骤：s1：将含有约2×107个核细胞的标本置于15ml离心管中，加入预混液至12ml后颠倒混匀(此时溶液呈暗黑色，不透光)，然后室温静置10min(低渗和裂解红细胞，此时溶液呈暗黑色、透光)；其中，预混液的配制方法如下：称取5.6gkcl，加纯水溶解后，定溶至1000ml，室温保存，得到第一溶液；将甲醇和冰乙酸按体积比3：l混合，得到第二溶液；将预热至37℃的12ml第一溶液与1.5ml第二溶液混合均匀，得到预混液。s2：将经过步骤s1处理的15ml离心管2000rpm离心5min，去除15ml离心管内的上清液。s3：在经过步骤s2处理的15ml离心管内，用塑料吸管加入1ml固定液，重悬细胞后，将得到的混合物转移至1.5ml离心管，室温静置5min；其中，固定液是体积比为3：1的甲醇和冰乙酸的混合溶液。s4：将经过步骤s3处理的1.5ml离心管2000rpm离心5min，用纸巾或纱布吸除1.5ml离心管内的上清液。s5：在经过步骤s4处理的1.5ml离心管内加入1ml固定液，重悬细胞(无需吹打，盖管手摇即可)，得到所述用于pcr扩增的标本；其中，固定液是体积比为3：1的甲醇和冰乙酸的混合溶液。制备得到的用于pcr扩增的标本的示意图如图2所示。将制备得到的标本放置于-30℃长期储存。储存后的标本经白细胞计数，得到的结果分别如下表1所示。表1制备得到的标本的白细胞计数1、分别采用上述表1中的2×106个细胞，进行dna提取(天根公司试剂盒)，提取得到的dna浓度如下表2所示。表2提取得到的dna浓度样品编号样品类型260/280260/230浓度(ng/μl)a1dsdna1.832.0147.75a2dsdna1.861.8635.24a3dsdna1.851.9838.81b1dsdna1.86271.31b2dsdna1.842.03143.64b3dsdna1.812.19188.31c1dsdna1.862.1391.52c2dsdna1.831.9254.16c3dsdna1.822.18167.91d1dsdna1.862.11105.87d2dsdna1.871.9447.7d3dsdna1.831.8869.322、分别采用上述表1中的2×106个细胞，进行rna提取(天根公司试剂盒)，然后反转录成cdna，并且用abl1(内参基因)引物做定量分析。浓度及定量ct值结果如下表3所示。其中浓度的单位为ng/μl。表3反转录得到的cdna浓度实施例三：不同模板量条件下，对gdna直接扩增本发明制备得到的用于pcr扩增的标本的使用方法，包括如下步骤：取1～2μl所述用于pcr扩增的标本(轻轻摇动或吹吸重悬细胞，不要剧烈震荡)于pcr管中，室温干燥10min后，在pcr管中加入反应液，然后进行pcr扩增。本实施例选取实施例二的a1和a2两个标本，取用不同模板量，对cebpa基因(因其gc含量高而难以扩增)的两个片断扩增，结果如图3所示：line1：a1细胞悬液为模板，模板量分别为0.2、0.5、1、2、5μl，室温干燥后分别扩增cebpa-1和cebpa-3两个片段；line2：a2细胞悬液为模板，模板量分别为0.2、0.5、1、2、5μl，室温干燥后分别扩增cebpa-1和cebpa-3两个片段；实验结果：可以对制备样本中的基因组dna进行直接扩增，标本量取1-2μl即可。实施例四：用不同基因片段的引物直接对基因组dna进行扩增选实施例二的b1和b2两个样本进行实验，结果如图4所示。1-4：b1悬液1μl为模板；5-8：b2悬液1μl为模板；1&5：jak2v617f位点引物(arms法)；2&6：cyp2c19＊2引物；3&7：kitexon11引物；4&8：unc13dg863d位点引物(hrm法，片段小于100bp)。实验结果：该方法制备的标本可以被多种方法，多种引物进行扩增。实施例五：用不同的试剂(酶)直接对基因组dna进行扩增选实施例二的b1和b2两个样本进行实验。反应条件：20μl体系，引物2μl。国产tag酶(天根)扩增条件：95℃5min→(95℃30sec→58℃30sec→72℃1min)×35cycles→72℃3min→4℃q5扩增条件：98℃2min→(98℃10sec→68℃10sec→72℃20sec)×35cycles→72℃2min→4℃。fusion扩增条件：98℃2min→(98℃10sec→68℃10sec→72℃15sec)×35cycles→72℃1min→4℃。国产高保真酶(t6)扩增条件：98℃2min→(98℃10sec→60℃10sec→72℃25sec)×35cycles→72℃1min→4℃。实验结果(如图5和图6所示)：1-4&9-12：国产tag酶，q5，fusion，国产高保真酶试剂分别扩增cebpa基因片段(难扩)。5-8&13-16：国产tag酶，q5，fusion，国产高保真酶试剂分别扩增flt3基因片段(易扩)。结论：该方法制备的样本的适应性强，可以被多种试剂扩增。实施例六：选取实施例二的留存了一年半的两个标本d1和d2，1μl为模板，重复“实施例五”的步骤，分别以国产tag酶，q5，fusion，kapa试剂(试剂)，扩增cebpa和flt3基因片段。结果如图7所示。1-8：1μl标本a悬液为模板；9-16：1μl标本b悬液为模板；1-4&9-12：国产tag酶，q5，fusion，kapa分别扩增cebpa片段；5-8&13-16：国产tag酶，q5，fusion，kapa分别扩增flt3片段。结果：扩增良好，且与新制备的标本扩增效果不差。实施例七：选取实施例二的a1悬液0.5μl(5000个细胞)，以及b1悬液0.5μl(10000个细胞)，分别做嵌合率检测。使用abiidentifilerkit进行实验，试剂配制和实验体系如下表4和表5所示。表4试剂配制表5实验体系pcrmix试剂用量(μl)mastermix6dna(0.05-0.125ng/μl)4总体积10μlpcr循环条件：95℃11min→(94℃1min→59℃1min→72℃1min)×26→60℃60min→4℃。实验结果：实验结果良好，并与常规柱式法提取的dna结果无差别。实施例八：选取实施例二的a2和c2悬液各100μl，烘干甲醇、冰乙酸后(2.0ml离心管，大概15min)，用柱式试剂盒(天根公司)抽提rna，a2悬液所提rna浓度：35.24ng/μl，c2悬液所提rna浓度：54.16ng/μl，全部做反转录为cdna。(1)定性：使用phusion2xmastermix，以e2a内参基因和bcr-abl1p21o基因引物分别扩增，以常规方法处理a2pb标本(bcr-abl1p21o阳性)得到的cdna，以及用悬液提取rna后逆转录得到的a2和c2的cdna。实验条件：20μl体系，引物2μl；98℃2min→(98℃10sec→68℃10sec→72℃15sec)×35cycles→72℃1min→4℃。实验结果：如图8所示。其中，1&2：常规制备方法处理的a2(pb)cdna，内参和p21o均阳性；3&4：c2悬液提取rna后逆转录所得cdna，e2a内参(+)，p210(-)；5&6：a2悬液提取rna后逆转录所得cdna，e2a内参(+)，p210(+)。(2)定量：a2悬液和c2悬液用柱式法提取rna(天根公司)后逆转录得到的cdna，使用kapaprobe2xmastermix做bcr-abl1定量(条件为试剂默认)，结果：cdna的ct值均为26-27左右(手动取阈值)，c2结果为阴性，a2结果为阳性，定量值35.47％(此份标本常规法所得cdna的bcr-abl1定量为50％)。实施例九：选取实施例二的肝素抗凝血2个制备标本(b3和d3)：1μl为模板，使用q5mix，做髓系相关的基因或片段引物(32个反应)。实验条件：20μl体系，引物2μl；98℃2min→(98℃10sec→68℃10sec→72℃20sec)×35cycles→72℃2min→4℃。实验结果：肝素抗凝也可以操作，而且效果与留存时间无关。具体结果如图9和图10所示；其中，图9为b3标本；图10为d3标本。将上述两份标本(b3和d3)交由染色体室做核型分析，一份做fish检测，得到的结果分别如图11和图12所示。结果显示标本依然可以做细胞遗传学分析。本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本发明提供的用于pcr扩增的标本的制备方法操作简单，试剂便宜易得，易于开展；制备得到的标本可在甲醇和冰醋酸中长期-30℃保存，通过对细胞的长期保存，实现了对rna的长期保存，使用时干燥后提取，而后进行下游实验即可；(2)本发明提供的用于pcr扩增的标本的制备方法，对基因组dna损伤小：因为该方法在改进前就用于染色体核型分析的标本制备，目的是在显微镜下观察染色体形态，即得到的染色体是完整的，那么用该方法也就顺理成章的得到了最完整的基因组dna；因此，使用该方法可以很方便的、有效的对基因组dna进行pcr扩增实验，也可以经过重新提取后gdna后进行下游实验；(3)本发明提供的用于pcr扩增的标本的制备方法，可以对肝素抗凝标本进行后续实验，操作改进后仍然不影响细胞遗传学分析。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。当前第1页12