Dentisani链球菌及其应用和应用其的产品的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种dentisani链球菌及其应用和应用其的产品。

背景技术：

益生菌是一种能够通过改善肠道微生态菌群平衡，促进有益菌生长、抑制病原菌生长、增强免疫系统活的有机体。

目前，随着抗生素滥用所导致的耐药细菌的产生，造成抗生素有效作用种类的降低和使用寿命的减短，然而益生菌通过自身或其代谢产物有效地抑制病原菌的生长繁殖，可以很好的解决这些棘手问题，同时，益生菌还具有无毒、高效、无残留、无抗药性等优点。

因此，开发出能够有效抑菌的益生菌，并利用其制备为相应的可实际应用的产品，在医药领域中的应用潜能非常巨大。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种dentisani链球菌gdmcc60219，本发明的第二个目的在于提供上述dentisani链球菌在制备抑菌产品中的应用，本发明的第三个目的在于提供一种抑菌产品，包括上述dentisani链球菌、dentisani链球菌的发酵液或dentisani链球菌的代谢产物中的一种或多种，以缓解现有技术中存在的抗生素滥用情况严重，呼吸道益生菌研究空白的技术问题。

本发明提供了dentisani链球菌，保藏编号为gdmcc60219。

进一步地，所述dentisani链球菌具有广谱抗性和/或长期拮抗稳定性。

本发明还提供了上述的dentisani链球菌在制备抑菌产品中的应用。

进一步地，所述抑菌为抑制金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌或大肠埃希氏菌中的一种或更多种。

进一步地，所述产品为药物或清洁产品。

本发明还提供了一种抑菌产品，所述抑菌产品的活性成分包括上述的dentisani链球菌。

本发明还提供了一种抑菌产品，所述抑菌产品的活性成分包括上述的dentisani链球菌的发酵液。

本发明还提供了一种抑菌产品，所述抑菌产品的活性成分包括上述的dentisani链球菌的代谢产物。

进一步地，所述抑菌为抑制金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌或大肠埃希氏菌中的一种或更多种。

进一步地，所述产品为药物或清洁产品。

本发明通过实验证明，本发明提供的dentisani链球菌gdmcc60219，具有广谱抗性和长期拮抗稳定性，能够对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌或大肠埃希氏菌起到显著的抑制作用。应用本发明提供的dentisani链球菌gdmcc60219作为益生菌，并利用其制备为相应的可实际应用的产品，在医药领域中的应用潜能非常巨大。

附图说明

图1a为本发明实施例1提供的益生菌2-1、益生菌2-2、益生菌2-3、益生菌2-4、益生菌2-5和益生菌2-6对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果图；

图1b为本发明实施例1提供的益生菌2-7、益生菌2-8、益生菌2-9、益生菌2-10、益生菌2-11和益生菌2-12对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果图；

图1c为本发明实施例1提供的益生菌2-13、益生菌2-14、益生菌2-15、益生菌2-16、益生菌2-17和益生菌2-18对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果图；

图1d为本发明实施例1提供的益生菌2-19、益生菌2-20、益生菌2-21、益生菌2-22、益生菌2-23和益生菌2-24对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果图；

图1e为本发明实施例1提供的益生菌3-1、益生菌3-2、益生菌3-3、益生菌3-4、益生菌3-5和益生菌3-6对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果图；

图1f为本发明实施例1提供的益生菌3-13、益生菌3-14、益生菌3-15、益生菌3-16、益生菌3-17和益生菌3-18对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果图；

图1g为本发明实施例1提供的益生菌4-1、益生菌4-2、益生菌4-3、益生菌4-4、益生菌4-5和益生菌4-6对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果图；

图1h为本发明实施例1提供的益生菌4-7、益生菌4-8、益生菌4-9、益生菌4-10、益生菌4-11和益生菌4-12对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果图；

图1i为本发明实施例1提供的益生菌4-13、益生菌4-14、益生菌4-15、益生菌4-16、益生菌4-17和益生菌4-18对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果图；

图1j为本发明实施例1提供的益生菌4-19、益生菌4-20、益生菌4-21、益生菌4-22、益生菌4-23和益生菌4-24对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果图；

图1k为本发明实施例1提供的益生菌5-1、益生菌5-2、益生菌5-3、益生菌5-4、益生菌5-5和益生菌5-6对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果图；

图1l为本发明实施例1提供的益生菌5-7、益生菌5-8、益生菌5-9、益生菌5-10、益生菌5-11和益生菌5-12对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果图；

图2为本发明实施例1提供的dentisani链球菌革兰氏染色结果图；

图3为本发明实施例1提供的dentisani链球菌形态观察结果图；

图4a本发明实施例2提供的为培养一个月后dentisani链球菌对大肠杆菌致病菌拮抗结果图；

图4b为本发明实施例2提供的培养三个月后dentisani链球菌对大肠杆菌致病菌拮抗结果图；

图4c为本发明实施例2提供的培养六个月后dentisani链球菌对大肠杆菌致病菌拮抗结果图；

图4d为本发明实施例2提供的培养十二个月后dentisani链球菌对大肠杆菌致病菌拮抗结果图；

图5a为本发明实施例2提供的培养一个月后dentisani链球菌对铜绿假单胞菌致病菌拮抗结果图；

图5b为本发明实施例2提供的培养三个月后dentisani链球菌对铜绿假单胞菌致病菌拮抗结果图；

图5c为本发明实施例2提供的培养六个月后dentisani链球菌对铜绿假单胞菌致病菌拮抗结果图；

图5d为本发明实施例2提供的培养十二个月后dentisani链球菌对铜绿假单胞菌致病菌拮抗结果图；

图6a为本发明实施例2提供的培养一个月后dentisani链球菌对金葡菌致病菌致病菌拮抗结果图；

图6b为本发明实施例2提供的培养三个月后dentisani链球菌对金葡菌致病菌致病菌拮抗结果图；

图6c为本发明实施例2提供的培养六个月后dentisani链球菌对金葡菌致病菌致病菌拮抗结果图；

图6d为本发明实施例2提供的培养十二个月后dentisani链球菌对金葡菌致病菌致病菌拮抗结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

dentisani链球菌(streptococcus)，于2017年8月9日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc60219，该菌株的分类命名为streptococcusdentisani。

在本发明中，dentisani链球菌具有广谱抗性和/或长期拮抗稳定性。

本发明还提供了上述的dentisani链球菌在制备抑菌产品中的应用。

在本发明中，抑菌为抑制金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌或大肠埃希氏菌中的一种或更多种。

在本发明中，产品为药物或清洁产品。

其中，药物例如可以为，但不限于口服药或吸入药；清洁产品例如可以为，但不限于消毒液、洗涤液或皂类。

另外，本发明还提供了一种抑菌产品，该抑菌产品的活性成分包括如下(a)-(c)任一项所述的物质：

(a)本发明提供的dentisani链球菌；

(b)本发明提供的dentisani链球菌的发酵液；

(c)本发明提供的dentisani链球菌的代谢产物。

在本发明中，抑菌为抑制金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌或大肠埃希氏菌中的一种或更多种。

在本发明中，产品为药物或清洁产品。

其中，药物例如可以为，但不限于口服药或吸入药；清洁产品例如可以为，但不限于消毒液、洗涤液或皂类。

目前，呼吸道益生菌及其益生菌制剂国内外研究相对甚少，对于人源性的拮抗性益生菌菌株还没有发现，本发明提供了一种具有广谱抗性且拮抗效果很好并且长期拮抗稳定性较好的益生菌菌株dentisani链球菌gdmcc60219，对致病菌大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌均有拮抗作用。

为了有助于进一步理解本发明，现结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

如无特殊说明，本发明实施例中所用仪器或试剂如下：

的恒温培养摇床(上海一恒科学仪器有限公司)、恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)、无菌操作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)、羊血(solarbio)、营养琼脂(青岛高科园海博生物技术有限公司)、脑心浸液培养基(北京路桥技术有限责任公司)、血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、肉汤培养基(北京奥博星生物技术责任有限公司)。

实施例1dentisani链球菌的分离及鉴定

1、dentisani链球菌的分离培养

无菌咽试子采集4-6岁健康儿童咽后壁菌群，溶解于1mlbhi液体培养基后，将菌液稀释1×10³倍，取200μl菌液涂布在体积分数为15％的羊血培养基上，在37℃恒温培养箱培养24小时。

2、dentisani链球菌的保存

用无菌牙签，挑取针尖状带有草绿色溶血环的单菌落，于体积分数为15％的羊血培养基划线，在37℃恒温培养箱培养24小时；收集平板上的菌落于3ml的5％胎牛血清bhi培养基中过夜培养，按照体积比为1:1的比例与体积分数为40％的甘油混合，-80℃冻存。

3、dentisani链球菌的筛选

(1)致病菌培养

选取金黄色葡萄球菌作为致病菌，挑取致病菌单菌落，于5ml的肉汤培养基中培养，在37℃、220rpm的条件下过夜培养后，用新鲜培养液稀释菌液至浓度达到5-6×10⁶cfu/ml，备用。

(2)dentisani链球菌拮抗性筛选

用打孔器在含有益生菌的体积分数为15％的羊血培养基上打孔，将益生菌菌饼置于涂布有200μl的上述制得的致病菌液的营养琼脂培养基上，37℃培养24小时，观察抑菌情况，结果如图1a-1l所示，其中，图1a为益生菌2-1、益生菌2-2、益生菌2-3、益生菌2-4、益生菌2-5和益生菌2-6对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果。图1b为益生菌2-7、益生菌2-8、益生菌2-9、益生菌2-10、益生菌2-11和益生菌2-12对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果。图1c为益生菌2-13、益生菌2-14、益生菌2-15、益生菌2-16、益生菌2-17和益生菌2-18对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果。图1d为益生菌2-19、益生菌2-20、益生菌2-21、益生菌2-22、益生菌2-23和益生菌2-24对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果。图1e为益生菌3-1、益生菌3-2、益生菌3-3、益生菌3-4、益生菌3-5和益生菌3-6对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果。图1f为益生菌3-13、益生菌3-14、益生菌3-15、益生菌3-16、益生菌3-17和益生菌3-18对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果。图1g为益生菌4-1、益生菌4-2、益生菌4-3、益生菌4-4、益生菌4-5和益生菌4-6对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果。图1h为益生菌4-7、益生菌4-8、益生菌4-9、益生菌4-10、益生菌4-11和益生菌4-12对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果。图1i为益生菌4-13、益生菌4-14、益生菌4-15、益生菌4-16、益生菌4-17和益生菌4-18对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果。图1j为益生菌4-19、益生菌4-20、益生菌4-21、益生菌4-22、益生菌4-23和益生菌4-24对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果。图1k为益生菌5-1、益生菌5-2、益生菌5-3、益生菌5-4、益生菌5-5和益生菌5-6对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果。图1l为益生菌5-7、益生菌5-8、益生菌5-9、益生菌5-10、益生菌5-11和益生菌5-12对金黄色葡萄球菌拮抗性的筛选结果。从结果图中可以看出，益生菌4-19对金黄色葡萄球菌的拮抗作用最显著，因此，选做后续实验。

4、dentisani链球菌的鉴定

(1)16srdna分析

益生菌4-19基因组提取和16srdna片段扩增，根据takara公司基因提取试剂盒和16srdna序列扩增试剂盒说明书操作。

①用1.5mltube收集0.5～2.0e+09的细胞(对于细胞壁结构特殊和生长状态较老的gram-positivebacteria，建议起始量不要超过1.0e+09的细胞)，12,000rpm离心2分钟，弃上清(细胞培养液)。

②加入500μl的bufferbs重悬细胞、加入50μl的lysozyme(20mg/ml)，充分吸打混匀，于37℃水浴温育60分钟(温育期间可每隔20分钟颠倒混匀一次)。

③12,000rpm离心5分钟，弃上清。

④加入180μl的buffergl、20μl的proteinasek(20mg/ml)和10μl的rnasea(10mg/ml)，充分吸打混匀，于56℃水浴温育10分钟，此时溶液应呈透明、澄清状(如果此时溶液未透明澄清，可延长裂解时间至30分钟，并每隔5分钟吸打混匀一次)。加入200μl的buffergb和200μl的100％乙醇，充分混匀。

处理好的细胞按如下操作进行：

1.将spincolumn安装在collectiontube上，溶液移至spincolumn中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液。

2.将500μl的bufferwa加入至spincolumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

3.将700μl的bufferwb加入至spincolumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。注：bufferwb中已经加入了指定体积的100％乙醇。沿spincolumn管壁四周加入bufferwb，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。

4.重复操作步骤3。

5.将spincolumn安置于collectiontube上，12,000rpm离心2分钟。

6.将spincolumn安置于新的1.5ml离心管上，在spincolumn膜的中央处加入50～200μl的灭菌蒸馏水或elutionbuffer，室温静置5分钟。注：将灭菌蒸馏水或elutionbuffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。

7.12,000rpm离心2分钟洗脱dna。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到spincolumn膜的中央或再加入50～200μl的灭菌水或elutionbuffer，室温静置5分钟后，12,000rpm离心2分钟洗脱dna。

前引物：5′-gagcggataacaatttcacacagg-3′(seqidno.1)，相反引物5′-cgccagggttttcccagtcacgac-3′(seqidno.2)，扩增出其益生菌4-19的16srdna片段，送检测序结果：ggaagtggcggggtgctatacatgcagtagaacgctgaaggaggagcttgcttctccggatgagttgcgaacgggtgagtaacgcgtaggtaacctgcctggtagtgggggataactattggaaacgatagctaataccgcataatagcagttgttgcatgacaactgtttgaaaggtgcaattgcaccactaccagatggacctgcgttgtattagctagttggtggggtaacggctcaccaaggcgacgatacatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatggacggaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttgtaagagaagaacgagtgtgagagtggaaagttcacactgtgacggtatcttaccagaaagggacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtcccgagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttagataagtctgaagttaaaggctgtggcttaaccatagtacgctttggaaactgtttaacttgagtgcaagaggggagagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaggaacaccggtggcgaaagcggctctctggcttgtaactgacgctgaggctcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaggtgttagaccctttccggggtttagtgccgtagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatccctctgaccgctctagagatagagctttcctttcgggacagaggtgacagtggtgcatgggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatggttgggttaagtcccgcacgagcgcaacccctattgttagtgccatcattagtgggcacctctagcgagactgcgtaataaccggagaaaggtggggatgacgtcaatcatcatgccccttatgacctggctaacacgtgctacattgctgggtacacgagtcgccaagttcggggtgaccgaccag(seqidno.3)。通过与genbank进行比对鉴定为streptococcusdentisani。

(2)形态特征及生理生化鉴定

将上述筛选得到的dentisani链球菌进行革兰氏染色，为阳性，如图2所示。平板菌落形态结果如图3所示。分析上述形态、生理生化结果，并结合16srdna基因在genbank的分类位置，可以得到dentisani链球菌为streptococcusdentisani。

将菌株dentisani链球菌于2017年8月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，保藏号为gdmcc60219，分类命名为streptococcusdentisani。

实施例2dentisani链球菌的抑菌功能验证

1、病原菌培养

分别挑取致病菌大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌单菌落，于5ml的肉汤培养，37℃、220rpm过夜培养后，用新鲜肉汤培养液稀释菌液至5-6×10⁶cfu/ml浓度，备用。

2、dentisani链球菌拮抗作用测定

(1)dentisani链球菌菌体富集

挑取dentisani链球菌gdmcc60219单菌落划线接种于羊血平板，37℃培养24小时后，将纯种链球菌于羊血平板进一步富集扩增。

(2)dentisani链球菌拮抗性及长期拮抗性的测定

刮取生长在血平板dentisani链球菌gdmcc60219，于800μl的含5％胎牛血清的bhi培养基中，充分涡旋振荡，备用。将上述三种稀释好的病原菌菌悬液分别涂布于营养琼脂平板，放置牛津杯，取200μldentisani链球菌于牛津杯中，37℃培养24小时，观察抑菌情况，并测量抑菌直径。将dentisani链球菌gdmcc60219每天传代一次，分别在1个月、3个月、6个月及1年时间内进行dentisani链球菌拮抗性测定。对致病菌大肠埃希氏菌的拮抗结果如图4a-4d所示，其中，图4a为培养一个月后dentisani链球菌对大肠杆菌致病菌拮抗结果，图4b为培养三个月后dentisani链球菌对大肠杆菌致病菌拮抗结果，图4c为培养六个月后dentisani链球菌对大肠杆菌致病菌拮抗结果，图4d为培养十二个月后dentisani链球菌对大肠杆菌致病菌拮抗结果。从结果图中可以看出，传代不同时间里，即0、3、6及12月，对大肠杆菌致病菌抑菌效果没有变化，传代12个月后，仍具有良好的拮抗性，抑菌直径约为21.5mm。对铜绿假单胞菌的拮抗结果如图5a-5d所示，其中，图5a为培养一个月后dentisani链球菌对铜绿假单胞菌致病菌拮抗结果，图5b为培养三个月后dentisani链球菌对铜绿假单胞菌致病菌拮抗结果，图5c为培养六个月后dentisani链球菌对铜绿假单胞菌致病菌拮抗结果，图5d为培养十二个月后dentisani链球菌对铜绿假单胞菌致病菌拮抗结果。从结果图中可以看出，传代不同时间里，即0、3、6及12月，对铜绿假单胞菌致病菌抑菌效果没有变化，传代12个月后，仍具有良好的拮抗性，抑菌直径约为20.0mm。对金黄色葡萄球菌的拮抗结果如图6a-6d所示，其中，图6a为培养一个月后dentisani链球菌对金葡菌致病菌致病菌拮抗结果，图6b为培养三个月后dentisani链球菌对金葡菌致病菌拮抗结果，图6c为培养六个月后dentisani链球菌对金葡菌致病菌拮抗结果，图6d为培养十二个月后dentisani链球菌对金葡菌致病菌拮抗结果。从结果图中可以看出，传代不同时间里，即0、3、6及12月，对金黄色葡萄球菌致病菌抑菌效果没有变化，传代12个月后，仍具有良好的拮抗性，抑菌直径约为23.5mm。

综上所述，本发明通过实验证明，本发明提供的dentisani链球菌gdmcc60219，具有广谱抗性和长期拮抗稳定性，能够对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌或大肠埃希氏菌起到显著的抑制作用。应用本发明提供的dentisani链球菌gdmcc60219作为益生菌，并利用其制备为相应的可实际应用的产品，在医药领域中的应用潜能非常巨大。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>沈阳医学院

<120>dentisani链球菌4-19及其应用和应用其的产品

<160>3

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<213>dentisani链球菌4-19

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