重组CHO细胞的贴壁微载体悬浮培养方法与流程

本发明涉及细胞培养领域，具体地说，涉及重组cho细胞的贴壁微载体悬浮培养方法。

背景技术：

乙型肝炎病毒感染是一种严重威胁健康的全球性问题。乙型肝炎是由病毒引起的疾病，全球至少2亿人感染过乙肝病毒，其中3500万至4000万人为慢性乙肝病毒携带者。亚洲、非洲、部分的东欧和南欧是乙肝病毒的高发区，西欧、南美及大洋洲各国的乙肝感染率较低。我国是乙肝高发地区，约有1.2亿人携带乙肝病毒，其中25％的感染者为慢性乙型肝炎，每年大约有50万至70万人死于急性乙型肝炎引发的肝硬化和肝癌。

肝癌是世界上第五大常见的癌症，癌症致死率排在第三位。乙肝的治愈至今在全球仍然是一个难题，所以乙肝的预防则更为重要。通过接种乙肝疫苗，95％的儿童和成人得到了有效的保护。

目前国内外普遍使用酵母或中国仓鼠卵巢细胞(cho)生产乙型肝炎疫苗。cho细胞表达疫苗的种类不多，多数处于研究阶段。目前只有cho表达乙肝疫苗已投入生产，这是除酵母乙肝疫苗以外，唯一已用于人类使用的基因工程亚单位疫苗。酵母表达乙肝疫苗由于生产工艺成熟简单(生物反应器悬浮培养)，使得酵母生产乙肝疫苗的成本比较低廉，所以目前市场上使用的乙肝疫苗大多数是酵母乙肝疫苗。但是酵母系统本身存在着许多缺陷，最重要的一点，酵母不能模拟蛋白在人体肝细胞中的翻译后修饰、蛋白折叠、大分子组装以及糖基化。这些特点正是抗原在动物细胞中引起免疫反应所必须的。而cho细胞表达的乙肝抗原决定簇与人体来源的乙肝表面抗原高度相似。在免疫原性方面，cho生产的乙肝疫苗的免疫原性与血源疫苗没有差异，明显优于酵母重组疫苗。调查显示，新生儿接种国产乙肝cho疫苗第1年的抗hbs阳性率为98.25％，抗体gmt为77.64，而血源疫苗免疫后第1年抗hbs阳性率在73.3％～93.5％之间。与酵母重组疫苗比较，更低剂量的cho乙肝重组疫苗在t细胞水平产生更高的免疫原性，这些疫苗刺激t细胞产生帮助引起更高的血清转化率和更高的抗hbs滴度。在安全性方面，根据现有的安全性记载，动物细胞表达的生物产品尤其cho表达的产物的安全性很好，在已批准进入临床或生产的动物细胞表达的乙肝疫苗的使用中，没有发现严重的副反应。其中我国主导研发的cho-c28细胞株，用于生产乙肝疫苗近30年，从未出现过安全事故。

由于传统的生产工艺是在有血清的情况下，采用大型转瓶贴壁培养重组cho细胞，生产效率低(1-5mg·l^-1·d^-1)，较重组酵母表达的疫苗成本要高，所以占市场份额相对较小。目前已有很多公司和机构试图对培养表达hbsag的重组cho细胞进行无血清驯化，并进一步对其进行悬浮培养驯化，希望实现生物反应器高密度悬浮培养，来提高重组蛋白产量和降低生产成本。滕小锘等(表达乙型肝炎表面抗原的重组cho细胞无血清培养基的优化及生物反应器培养，中国生物制品学杂志，2010年10月)在生物反应器培养过程中，灌注培养的重组cho细胞表达的hbsag产率为0.70mg·l^-1·d^-1，分批和流加培养时为0.30mg·l^-1·d^-1。但也许由于hbsag本身的特性，针对表达乙型肝炎表面抗原的重组cho细胞的悬浮优化或无血清优化，并无明显效果，仍低于传统生产工艺的产量。

此外，细胞无血清驯化过程中往往会造成基因工程细胞株不稳定，导致蛋白生产能力下降；悬浮驯化过程中，往往导致代次增多，细胞恶化或癌化概率增加；这些都增加了疫苗生产中的安全隐患。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种重组cho细胞的贴壁微载体悬浮培养方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种重组cho细胞的贴壁微载体悬浮培养方法，包括如下步骤：

(1)使用细胞生长液对重组cho细胞进行传代培养，将传代培养后的重组cho细胞，按照1～5×10⁵个细胞/ml的接种量接种至带有微载体的生物反应器；

(2)进行重组cho细胞的扩增培养；

(3)当重组cho细胞表达的目的蛋白含量≥0.5mg/l时，每天流加细胞生长液；1周后，每天流加细胞维持液；培养时间为25～30天；

其中，所述细胞生长液为含有10％～16％新生牛血清的dmem培养基；所述细胞维持液为含有4％～8％新生牛血清的dmem培养基。

本发明经过试验研究发现，采用贴壁微载体悬浮培养方法，并使用所述细胞生长液和细胞维持液对重组cho细胞进行培养，表达目的蛋白，可显著提高目的蛋白的产量。

其中，步骤(1)具体为：复苏重组cho细胞株，复苏后细胞存活率应不低于85％，24h后置换细胞生长液，然后放于37℃继续培养2-3天，待方瓶细胞成致密单层后，用胰蛋白酶消化传代，传代比例为1:3～1:4，2～3天换生长液一次；传代培养所得细胞经消化后可作为种子接种到生物反应器中。接种后细胞密度为1～5×10⁵个细胞/ml。

步骤(2)具体为：在温度37℃、气体压力10psi、ph6.8-7.2、do50-60％条件下进行cho细胞的扩增培养，培养过程中保持葡萄糖含量为2-3g/l。

作为优选，步骤(2)扩增培养开始时，转速为30rpm，3小时后转速调至50rpm，1天后调至70rpm。

步骤(3)具体为：当重组cho细胞表达的目的蛋白含量≥0.5mg/l时，每天流加30％培养体积的细胞生长液；1周后，每天流加50％培养体积的细胞维持液；保持葡萄糖含量为0.7-1.2g/l。

作为优选步骤(3)中流加细胞维持液时：第1～4天流加的细胞维持液中新生牛血清含量分别为8％、5％、4％和4％；从第5天起，按照新生牛血清含量分别为5％、4％和4％的循环，流加细胞维持液。

进一步优选，步骤(3)流加细胞维持液后，调低培养温度为35℃，下调do到40-50％，维持ph为7.0-7.4。

本发明所述的方法中，所述微载体优选为聚酯圆片。

在本发明的具体实施方式中，所述重组cho细胞为表达乙肝抗原的cho细胞，因此，本发明所述重组cho细胞优选为表达乙肝抗原的cho细胞。其他可表达目的蛋白的cho重组细胞同样可使用本发明所提供的方法进行培养，并生产目的蛋白。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明经过大量试验研发出一种适用于表达hbsag的重组cho细胞的培养基，在此基础上进一步通过微载体和培养工艺模拟转瓶贴壁培养，在尽力保留cho细胞传统贴壁培养特性和不改变cho-c28安全性同时，引入生物反应器操作简单易控、可实现较高的传质传氧效率、可不断补充新鲜培养液、排出代谢废物、延长细胞表达时间等，从而提高重组蛋白产量，降低人力成本，最终降低疫苗成本。

附图说明

图1为细胞存活率检测。

图2为贴壁时细胞汇合图，t25、t75方瓶培养时致密细胞单层图。

图3为hbsag含量标准曲线(elisa检测)。

图4为整个周期中hbsag产量曲线。

图5为纯化后样品蛋白电泳后银染图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一、设备和培养基

1.1实验材料

cho-c28(北京华尔盾生物技术有限公司)。

1.2实验设备及试剂

bioflo4500细胞培养罐(nbs)，酶标仪dnm-9602(北京普朗新技术有限公司)，乙肝抗原诊断试剂盒(北京北方生物技术研究所)，胰蛋白酶(amresco)，庆大霉素(河北国泰药业公司)，dmem(无锡市美迪生物制品有限公司)。

1.3培养基及相关

1.3.1细胞生长液的配制

以50l规格为例：取dmem干粉培养基，按说明书上配方要求称取50l所需重量，加入碳酸氢钠185g、庆大霉素4g，溶解后定容至50l。向配制好的dmem培养基中加入新生牛血清，使新生牛血清终浓度为10％～16％。加12mhcl10ml，再用1mhcl调ph值至6.4～6.8。在无菌条件下经0.22μm除菌过滤器过滤后使用。

1.3.2细胞维持液的配制

以50l规格为例：取dmem干粉培养基，按说明书上配方要求称取50l所需重量，加入碳酸氢钠185g、庆大霉素4g，溶解后定容至50l。向配制好的dmem培养基中加入新生牛血清，使新生牛血清终浓度为4％～8％。加12mhcl10ml，用7.5％碳酸氢钠溶液调ph值至7.2～7.8。在无菌条件下经0.22μm除菌过滤器过滤后使用。

二、培养方法

cho-c28大规模、高密度、载体贴附灌注培养，主要包括细胞的接种，细胞扩增阶段，改变培养条件，细胞维持生长阶段。具体步骤如下：

1、细胞的接种

从工作细胞库中复苏一支cho-c28细胞株，复苏后细胞存活率应不低于85％。24h后置换细胞生长液(dmem培养基加10-16％胎牛血清)，然后放于37℃继续培养2-3天，待方瓶细胞成致密单层后，用胰蛋白酶消化传代，传代比例为1:3～1:4，2～3天换生长液一次。

种子制备按照t25-t75-克氏瓶-三层转瓶的顺序逐级传代。转瓶培养的细胞经消化后可作为种子接种到生物反应器中。接种后细胞密度为1-5×10⁵个细胞/ml。

2、细胞扩增阶段

称取微载体聚酯圆片400g，并预先高压灭菌一次后加入生物反应器的提篮内。高压灭菌完毕后，将前述种子接入生物反应器后，进气模式调到4gas，系统进入自动控制ph-d0模式(ph由1mhcl和7.5％nahco3进行调节)设定各项培养参数：

各气体(n2，o2，co2，空气)压力10psi；

温度37℃；

ph6.8-7.0；

do50-60％；

转速30rpm，接种后3小时转速可调到50rpm，1天后可调到70rpm，2天后检测取样抗原含量，每天无菌取样，检测葡萄糖和乳酸含量，并保持葡萄糖含量为2-3g/l。

3、改变培养条件

当抗原含量达到标准后(≥0.5mg/l)可以进行流加细胞生长液(每天流加相当于培养体系30％体积分数的细胞生长液)，达到标准1周后可以更换为细胞维持液(dmem培养基加4-8％胎牛血清)(每天流加相当于培养体系50％体积分数的细胞生长液)，并调低培养温度为35℃，维持ph设定为7.0-7.4，并将do下调到40-50％。保持葡萄糖含量0.7-1.2g/l。

4、细胞维持生长阶段

(1)维持培养阶段(从流加液体切换成细胞维持液开始)的第1～4天血清含量8％-5％-4％-4％流加细胞维持液(第一天加8％，第二天加5％，第三天加4％，第四天加4％)，每个浓度梯度流加相当于培养体系100％体积分数的细胞维持液。

(2)从第5天开始血清含量5％-4％-4％流加细胞维持液，每个浓度梯度流加相当于培养体系100％体积分数的细胞维持液。之后以此浓度梯度轮回往复。

以悬液细胞存活率为周期震荡时血清浓度检测点。细胞维持生长阶段为25-30天。

三、hbsag含量监测和蛋白电泳检测

hbsag含量监测遵照乙肝抗原诊断试剂盒的操作说明。并使用hbsag标准品0.2ng/ml、0.6ng/ml、1.8ng/ml、5.4ng/ml建立含量测定曲线(图3)。

每天按照乙肝抗原诊断试剂盒的操作说明检测收液中的hbsag含量，并带入hbsag含量标准曲线计算收液中的hbsag浓度，结果见图4。从图4可知，从第11天开始，每天平均的抗原hbsag产量约为6mg·l^-1·d^-1，超过了传统工艺3层转瓶每两天收液的平均抗原水平，而且更为省时省力。

将表达产物经传统的cho-hbsag纯化工艺纯化分离，进行蛋白电泳，并采用银染法进行染色，确定蛋白条带，如图5所示，其含有药典中提及的三条目的条带，23kd的目的条带，27kd的糖基化条带及30kd的高度糖基化条带。说明新工艺及培养条件并未改变cho表达hbsag高度糖基化的特性，对蛋白质的糖基化形式并无产生影响。

对比例1

本对比例与实施例1的区别仅在于：a培养方法中，维持培养阶段一直按血清含量5％流加细胞维持液；b培养方法中，维持培养阶段一直按血清含量4％流加细胞维持液。对本对比例培养方法得到的hbsag含量进行监测，结果为：趋近稳定后，a培养方法每天平均的抗原hbsag产量约为4.5mg·l^-1·d^-1；b每天平均的抗原hbsag产量约为2.0mg·l^-1·d^-1。而实例1每天平均的抗原hbsag产量约为6mg·l^-1·d^-1。

对比例2

本对比例与实施例1的区别仅在于：a培养方法中，维持培养阶段使用无血清培养基(以dmem基础培养基，添加胰岛素、柠檬酸铁、微量元素等多种成分)；b培养方法中，种子接入发酵罐后，一直流加的都无血清培养基。对本对比例培养方法得到的hbsag含量进行监测，结果为：趋近稳定后，a培养方法每天平均的抗原hbsag产量约为1.2mg·l^-1·d^-1；b每天平均的抗原hbsag产量约为0.2mg·l^-1·d^-1。而实例1每天平均的抗原hbsag产量约为6mg·l^-1·d^-1。

对比例3

本对比例与实施例1的区别仅在于：(1)流加速度：当抗原含量达到标准后(≥0.5mg/l)每天流加细胞生长液的量相当于培养体系50％体积分数的细胞生长液时，需要9-10天每天抗原产量达到6mg/l；(2)维持培养阶段时的流加速度：每天流加细胞生长液的量相当于培养体系100％、200％体积分数的细胞生长液时，达到稳定后每天平均抗原产量分别为2.5、1.1mg/l。

应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。