本发明属于分子标记辅助选择及动物遗传育种技术领域，具体涉及一种影响杜洛克猪腰围性状的分子标记及应用。
背景技术：
在中国肉猪主要以活猪评定为主的市场环境下，体型表型的选择显得尤为重要。国外的种猪市场很少会根据体型来判断其价值，尽管如此，仍然会对猪的前肢、后肢、运动状态、姿态、背、腹线等体型外貌进行综合评估选择。在中国大部分生猪市场上，腹线(腹围、腰围)决定了肉猪的价值，直接影响了终端产品的销售利润。由于腹围大、腰围小，腹线不平直，俗称大肚子、大肚腩，这种猪由于肥肉较多，导致肉猪修整损失较大，影响了种猪最后售出的利润。另外，由于种猪肚腩较大从而导致商品猪场不愿意引种使得此类种猪利用率降低的情况屡见不鲜，为养猪企业带来了巨大的经济损失。因为体型的选择需要兼顾众多，很难在选择其他性状的同时兼顾腰围，为腰围改良带来了困难。腰围的表型选择和测定并没有系统和详尽的研究。通过国内的市场调查，不同区域对腰围的要求不同，这导致在种猪选育时，各终端父本品系腰围等体型外貌的育种目标略有差别。为此，开展针对市场要求对腰围表型进行更为详尽的测定和选择，另外，还可以通过这种表型测定以及基因组的分析鉴别控制种猪体型的基因和主效基因位点，利用分子育种的手段从根本上解决腰围改良难题。
杜洛克猪是世界上著名的瘦肉型猪种之一。在现代商品肉猪的繁育体系中，杜洛克一般作为终端父本使用，影响范围较大。因此，对杜洛克猪的腰围性状进行改良，可以有效地改良商品猪的体型，提高其销售价格。
技术实现要素：
为了克服现有技术中种猪体型选育存在的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种影响杜洛克猪腰围性状的分子标记。
本发明的另一目的在于提供上述影响杜洛克猪腰围性状的分子标记的应用。
本发明的再一目的在于提供一种鉴定上述影响杜洛克猪腰围性状的分子标记的引物对。
本发明的第四个目的在于提供上述引物对的应用。
本发明的第五个目的在于提供一种杜洛克猪的遗传改良方法。
一种影响杜洛克猪腰围性状的分子标记，其snp位点对应于国际猪参考基因组10.2版本4号染色体上第3400805bp处的t>c突变；
所述的影响杜洛克猪腰围性状的分子标记的snp位点为seqidno.1所示(位于该序列片段第306核酸单碱基突变，命名为：g.306t>c)，其中序列中的m是t或c，导致腰围性状的不同；
所述的影响杜洛克猪腰围性状的分子标记在鉴定杜洛克猪腰围性状和遗传育种中应用；
一种利用上述分子标记选育高瘦肉率的杜洛克种猪品系的方法，包含如下步骤：
检测猪4号染色体上上述影响杜洛克猪腰围性状的分子标记；所述的分子标记的snp位点是t还是c，淘汰t保留c；
所述种猪优选为纯种美系杜洛克及其合成系(广东温氏种猪科技有限公司)；
一种用于鉴定上述影响杜洛克猪腰围性状的分子标记的引物对，包含引物c-f和c-r，其核酸序列如下：
引物c-f：5’-gggtgagggtgggattag-3’；
引物c-r：5’-ttgcgttagtgattgtcctg-3’；
所述的引物对在鉴定影响杜洛克猪腰围性状中应用；
所述的引物对在杜洛克猪分子标记辅助选择育种中应用；
所述的引物对在培育高瘦肉的杜洛克种猪品系中应用；
一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：
确定种猪核心群中种猪的上述影响杜洛克猪腰围性状的分子标记，并根据猪的上述位点的基因型在种猪选种过程中做出相应的选择：种猪的继代选育国际猪参考基因组10.2版本4号染色体上3400805bp处的cc型个体，淘汰该点的tt型和ct型个体；以逐代提高该位点的等位基因c的频率，从而改良后代猪的腰围；
所述的种猪包括杜洛克及其合成系；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明研究并确定影响杜洛克猪腰围性状的分子标记，验证其对腰围性状的影响效应，最终建立对腰围性状进行快速改良的分子标记辅助选择育种技术，极大地改善了杜洛克及其合成系的体型选育进程，适应活猪市场的需求，提高了肉猪的价格，为企业增加了销售利润，提高核心竞争力。
(2)本发明提供一种用于鉴定影响杜洛克猪腰围性状的分子标记的引物对，通过该分子标记及引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确的对体型进行选育，加快育种进程。
(3)本发明通过优选该分子标记的优势等位基因，提供了一种体型选育的方法，能够加快杜洛克猪体型(腰围性状)的遗传进展，缩短了杜洛克体型改良的时间，从而有效提高种猪育种的经济效益，其中，通过该分子标记，本发明将tt型个体全部选育成cc型个体，则杜洛克群体的整体腰围将增加3cm，改良体型，提高产肉量。
附图说明
图1是杜洛克猪在4号染色体上关于腰围性状的全基因组关联(gwas)分析图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logp值；
图2是不同基因型猪的腰围相关性分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)实验动物
本实施例所使用的实验猪群群体为广东温氏种猪科技有限公司的纯种美系杜洛克627头，为种猪分公司核心群，群体系谱记录详细。
本实验共选取该资源群体中美系杜洛克种猪，猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。
杜洛克猪产仔数较少，大群平均仅为9～10头，但生长快，饲料转化率高，胴体瘦肉率高，肌内脂肪含量较高，抗逆性强。国内商品猪生产已建立起较为成熟的杂交配套体系。其中杜长大的杂交组合在我国的内销和外销市场中持续保持绝对的优势地位。由于体型是活体市场售价的唯一评估标准，而其腹围和腰围等对于猪体型评分影响巨大，所以杜洛克猪腰围性状的研究显得尤为重要。
(2)样本收集及表型记录
收集上述种猪断尾及耳组织浸泡于体积分数为75％的乙醇中置于-20℃冰箱备用。猪终测时，用软尺测量猪的腰围，并记录了627头杜洛克种猪腰围数据。
(3)猪全基因组50ksnp判型
从上述资源群体中选取的627头杜洛克种公猪中的每个个体采集的耳组织或者断尾组织，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组dna，经nanodrop2000/2000c核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的dna的浓度和od比值(od260/280、od260/230)。经nanodrop2000/2000c核酸蛋白检测仪检测合格的dna样品，按照检测的浓度将dna稀释至50ng/μl左右。再将6μl已提取好的待测dna样品与2μlloadingbuffer混合，上样到质量分数为1％的琼脂糖凝胶中，150v电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察dna的完整性。
dna样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在illuminabeadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50ksnp芯片(illumina，美国)基因型判定。利用r语言genabel包中checkmarker对所有样本50k芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10-6的snp，最终得到42642个snp的有效基因型数据。
(4)全基因组关联(gwas)分析
为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合r语言genabel软件包进行gwas分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用bonferrini法确定snp与腰围性状关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效snp位点数量，即基因组显著水平阈值为1.17×10-6，即0.05/42642(有效snp数量)；染色体水平显著阈值为1除以有效snp位点数量，即染色体显著水平阈值为2.35×10-5，即1/42642(有效snp数量)。
gwas分析结果如图1所示。从图1可知，在杜洛克中，在4号染色体中存在显著影响猪腰围的位点，最强关联的snp为g.306t>c(p＝7.70e-8)。
(5)不同基因型与腰围表型的关联性分析
根据表1可知，分子标记的snp位点g.306t>c与腰围性状极显著相关，可以通过对杜洛克猪的此snp位点的辅助选择，从而改良该群体腰围，进而加快育种进程。
另外根据表1还可知，tt型比cc和ct型的平均腰围低，说明纯合子tt对平均腰围是最不利的。通过图2进一步得知，纯合子tt与cc和ct基因型显著差异，而cc与tt基因型更是差异极显著，这进一步说明t等位基因为劣势等位基因。腰围是猪体型外貌的重要指标，腰围长说明猪的体型粗壮。因此，淘汰tt型和ct型的猪可带来更多的经济效益，我们在进行育种的过程中需要淘汰tt型和ct型的种猪，保留cc的种猪，以逐代提高该位点的等位基因c的频率。
表1分子标记的snp位点g.306t>c与腰围的相关性
实施例2目的dna序列扩增及测序
(1)引物设计
通过ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的4号染色体上seqidno.1的dna序列。并利用引物设计软件primerpremier6.0设计引物。设计的引物的dna序列如下所示：
引物c-f：5’-gggtgagggtgggattag-3’；
引物c-r：5’-ttgcgttagtgattgtcctg-3’；
(2)pcr扩增
10μl的反应体系中加入dna模板1μl，双蒸水3.4μl，2×tagpcrstanmixwithloadingdye5μl，引物c-f和c-r各0.3μl。pcr反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、54.3℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min。
(3)dna序列测定
最后对pcr扩增后的产物进行测序，序列测定由华大科技公司完成，基因片段测序要求为双向测通。测序结果如下所示：
注：序列表中标注的m为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。
本发明通过对seqidno.1序列中的第306个位碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与猪的腰围性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>广东温氏食品集团股份有限公司；华南农业大学
<120>一种影响杜洛克猪腰围性状的分子标记及应用
<130>1
<160>3
<170>patentinversion3.3
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<223>影响杜洛克猪腰围性状的分子标记
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acggaaagcagaaagatcttttatttactcctttcttagttgggcaacatttctgggcca180
cttgtcatgttttcgtcagtgtactaagcatggagatagccggatgaacaatgaagagtg240
tatgcccttcaggagtttgcagatgaaggagcacacagactcagacaccaacgcctagag300
cgtcgmgtgataagtgctttttgtggagatgcagagaagagggctcctaccagagcttcc360
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