一株草鱼胸鳍细胞系的构建方法与流程

本发明涉及生物细胞构建领域，特别涉及一种利用草鱼胸鳍细胞建立细胞系的方法。

背景技术：

草鱼(ctenopharyngodonidellus)作为我国淡水养殖鱼类中最为重要的养殖品种，在水产养殖产业有着极其重要的价值，2015年其产量超过500万吨，其产量约占我国淡水养殖总产量的20％以上。当前水产行业正快速向集约化和规模化发展，使得高密度、集约化养殖模式得以大范围推行，从而造成水生动物疾病的爆发，造成了极大的经济损失，并且对该产业的发展造成巨大的阻力。高密度的养殖环境下很容易使细菌、病毒和寄生虫等病原感染宿主，并大量繁殖，对水产动物造成极大的危害，与此同时带来巨大的经济损失。在感染草鱼的所有病原中，草鱼呼肠孤病毒(grasscarpreovims，gcrv)，俗称草鱼出血病病毒(gchv)，感染导致的草鱼出血病危害最大，成为我国淡水水产养殖中最为突出的问题之一。该病防治困难，发病期长，传染性强，死亡率高达90％，一旦爆发，给我国草鱼养殖业造成巨大的损失，据不完全统计，我国每年由草鱼出血病导致的经济损失在10亿以上。2008年农业部将草鱼出血病规定为水生动物二类疫病。

由于草鱼出血病对草鱼养殖造成巨大危害，国内众多研究机构从病原、宿主和环境的各方面对草鱼抗呼肠孤病毒展开积极研究，试图寻求控制该病的有效方法。到目前为止草鱼出血病还没有特效药物治疗，免疫预防是控制草鱼出血病最有效的防治方法。建立病毒的敏感细胞系是研发疫苗的第一步，也是研究病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗的重要体系。因此，建立草鱼细胞系，是进行草鱼呼肠孤病毒的分离与鉴定，研究其致病机理，疫苗制备和免疫预防技术的重要基础。鱼类原代细胞系的建立技术目前是一种较为成熟的技术，但是要获得针对病毒敏感的细胞系仍存着很大的偶然性和困难性，所以建立一株需要鱼类细胞系有效的途径是以数量对质量，即制备大批量的原代细胞株，从而筛选出敏感的细胞系。

在感染gcrv的患病草鱼中，临床症状经常发现草鱼胸鳍及其基底部位出血，取部分胸鳍检测，检出有gcrv感染，故推测草鱼胸鳍细胞会对草鱼呼长孤病毒敏感。本发明用草鱼的胸鳍组织进行细胞培养初步确定了草鱼胸鳍细胞的培养条件，建立了草鱼胸鳍细胞系(命名为cpf,ctenopharyngodonidelluspectoralfin)并检测了细胞对草鱼出血病病毒(gcrv)的敏感性，为后期草鱼呼长孤病毒的研究奠定了基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于公开一种利用草鱼胸鳍细胞建立细胞系的方法。

本发明所采取的技术方案是：一种草鱼胸鳍细胞系的构建方法，其包括以下步骤：1)原代培养：取草鱼胸鳍组织，去除表皮膜组织，pbs漂洗干净后剪碎；加入消化液a，混合均匀；将混合消化酶的碎组织块均匀涂布到培养瓶中；将培养瓶倒置培养箱中，倒置干贴6～8h后，加入完全培养液正置继续培养10～15h，添加完全培养液继续培养5-10天，得到生长至80％～90％汇合的原代细胞；2)传代培养：原代胸鳍细胞铺满单层后，除去旧培养液，用pbs清洗两遍，加入胰酶消化细胞，待细胞变圆后，加入完全培养液，吹打，悬起细胞，进行传代培养。

优选的，消化液a含有胶原酶ⅰ和牛血清白蛋白。

优选的，消化液a的成分是0.1％的胶原酶ⅰ加5％牛血清白蛋白。

优选的，完全培养液是含有胎牛血清、草鱼血清、碱性成纤维样生长因子、表皮生长因子、青霉素、链霉素、两性霉素b，m199培养液。

进一步优选的，完全培养液是含有20％胎牛血清、0.5％～1％草鱼血清、20ng/l碱性成纤维样生长因子、1ng/ml的表皮生长因子、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素b，ph值为7.2-7.4的m199培养液。

草鱼血清的制备方法是：取1～2龄的健康鲜活草鱼，从鱼的尾静脉采血，在室温下放置半个小时，待血凝固收缩后，再转入4℃的冰箱中，静置过夜，使血块进一步收缩和析出血清；第二天在4℃下，转速5000-6000rpm/min离心5～10min，取上清过滤膜，-20℃保存备用。

优选的，原代培养的培养方法是：取体长10±0.5cm的鲜活草鱼于75％酒精中浸泡30～60秒，置于超净台中无菌取下胸鳍组织，用手术刀轻刮掉表皮膜组织，pbs漂洗干净后，置于5ml的无菌青霉素小瓶中，瓶中含200ulpbs，用手术剪将其剪碎；加入2倍体积的消化液a，混合均匀；用将混合消化酶的碎组织块均匀涂布到预先用0.1％明胶包被的培养瓶中；将培养瓶倒置放入饱和湿度的27℃培养箱中，倒置干贴6～8h后，缓慢加入2ml完全培养基正置继续培养10～15h，添加培养基至5ml，继续培养5～10天，得到生长至80％～90％汇合的原代细胞。

优选的，传代培养的培养方法是：原代胸鳍细胞铺满单层后，用吸管除去旧培养液，用pbs清洗两遍，加入0.25％胰酶1ml消化细胞，待镜下观察细胞变圆后，加入10ml完全培养液，吹打悬起细胞，以1:2进行传代，加入完全培养液至5ml/瓶，放入27℃培养箱中进行传代培养；以后约3～5天传代一次；传至第10代时，细胞培养液中胎牛血清含量减为总体积的10％，培养液中不再添加草鱼血清、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子。

本发明的有益效果是：草鱼的胸鳍组织进行细胞培养初步确定了草鱼胸鳍细胞的培养条件，建立了草鱼胸鳍细胞系并检测了细胞对草鱼出血病病毒的敏感性，为后期草鱼呼长孤病毒的研究奠定了基础。

附图说明

图1为草鱼胸鳍细胞形态观察，其中a为原代细胞；b为15代细胞；c为50代细胞；d为100代细胞。

图2为草鱼胸鳍细胞原代培养贴壁观察，其中a为组织块法15d细胞迁出情况；b为胰蛋白酶被消化法培养13d细胞贴壁情况；c为胶原酶组织块联合培养法3d细胞迁出情况。

图3为第60代草鱼胸鳍细胞的生长曲线。

图4为gcrv-ⅰ的琼脂糖凝胶电泳图片。m:marker1，2：目的条带

图5为草鱼胸鳍细胞系感染草鱼呼肠孤病毒gcrv图片，其中a为对照；b为细胞感染病毒gcrv2天后；c、d为感染病毒gcrv的细胞电镜切片图。

具体实施方式

实施例

1.制备细胞培养液：

取gibco公司m199培养基，加入占所用总体积10～20％的胎牛血清，0.5～1％草鱼血清，20ng/ml的碱性成纤维生长因子(bfgf)，1ng/ml的表皮生长因子(egf)，4℃存放，备用；

2原代培养:

取体长10±0.5cm的鲜活草鱼于75％酒精中浸泡30～60秒，置于超净台中无菌取下胸鳍组织，用手术刀轻刮掉表皮膜组织，pbs漂洗干净后，置于5ml的无菌青霉素小瓶中(含200ulpbs)，用手术剪将其剪碎；加入约2倍体积的消化液a，混合均匀。用灭菌的不锈钢压舌板将混合消化酶的碎组织块均匀涂布到预先用0.1％明胶包被的25cm²培养瓶中；将培养瓶倒置放入饱和湿度的27℃培养箱中，倒置干贴6～8h后，缓慢加入2ml完全培养基正置继续培养10～15h，添加培养基至5ml，继续培养5-10天，得到生长至80％～90％汇合的原代细胞。其中，消化液a的成分是0.1％的胶原酶ⅰ加5％牛血清白蛋白。

本方法与胰蛋白酶消化法和组织块法做了对比实验，结果如表1，图2。

表1草鱼胸鳍细胞三种原代培养方法对比

3.传代培养:

原代胸鳍细胞铺满单层后，用吸管除去旧培养液，用pbs清洗两遍，加入0.25％胰酶-edta(1:1)1ml消化细胞，待镜下观察细胞变圆后，加入10ml完全培养液，吹打，悬起细胞，以1:2进行传代，加入完全培养液至5ml/瓶，放入27℃培养箱中进行传代培养；以后约3～5天传代一次；传至第10代时，细胞培养液中胎牛血清含量减为总体积的10％，培养液中不再添加草鱼血清、碱性成纤维生长因子(bfgf)和表皮生长因子(egf)。

完全培养基配方为所述的培养基配方为含有20％胎牛血清、0.5％～1％草鱼血清、20ng/l碱性成纤维样生长因子(bfgf)、1ng/ml的表皮生长因子(egf)、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素b，ph值为7.2-7.4的m199培养液。

草鱼血清的制备：取1～2龄的健康鲜活草鱼，用注射器从鱼的尾静脉采血,轻轻挤压入1.5ml的离心管，在室温下放置半个小时，待血凝固收缩后，再转入4℃的冰箱中，静置过夜，使血块进一步收缩和析出血清，离心时也不易形成溶血现象。第二天在4℃下，转速5000-6000rpm/min，离心5-10min。取上清，先后过0.45μm和0.22μm滤膜，-20℃保存备用。

自接种组织至今，细胞已传代100代，细胞系建系成功。

4细胞的冻存与复苏

4.1细胞的冻存：用胰酶消化法收集2瓶处于对数生长期的草鱼胸鳍细胞，1000g离心5min后弃去上清，用1ml冻存保护液(含20％fbs和10％dmso的m199培养液)将细胞重悬后置于冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中于-80℃过夜，最后投入液氮(-196℃)中长期保存，并做好记录。

4.2细胞的复苏：复苏细胞时，从液氮中取出冻存管，于37℃水浴中迅速解冻，1000g离心5min收集细胞后接种于25cm²的培养瓶中，放置于培养箱中27℃培养，待细胞贴壁后弃上清，更换培养液，继续培养。

将复苏后的细胞进行台盼蓝染色，用细胞计数仪测定细胞的成活率＞95％。

5病毒感染实验:

草鱼胸鳍细胞对草鱼出血病病毒(gcrv)的敏感性：

细胞接种于25cm²培养瓶中细胞单层达到80％～90％时，用pbs清洗细胞2次加入草鱼呼肠孤病毒(gcrv-873)悬液1ml，静置吸附1h，吸弃病毒悬液用无血清的培养基清洗细胞表面2次，加入含3％fbs的培养基置于27℃培养箱培养，每日在倒置显微镜下观察细胞变化并拍照记录。当cpe(细胞致病作用)出现作为病毒敏感性指标，表明细胞对该病毒敏感(图5b)。取200μl细胞液提取rna，并用gcrv-ⅰ的引物进行pcr扩增，得到532bp的目的条带(图4)。电镜下可观察到gcrv呈晶格状排列的病毒粒子(图5c,d)。