基于Nectin4受体的犬瘟热敏感细胞系建立方法及应用与流程

本发明属于用于病毒培养的敏感细胞系构建技术领域，具体涉及一种基于nectin4受体的犬瘟热敏感细胞系建立方法及应用。

背景技术：

犬瘟热(caninedistemper,cd)是由犬瘟热病毒(caninedistempervirus，cdv)引起的急性、高度接触性传染病。cdv为副粘病毒科、麻疹病毒属，主要感染对象为犬科及鼬科动物，近年来也有感染猴、狮和熊猫等野生动物的报道，宿主感染范围有扩大趋势。cdv具有较高的发病率及致死率，是宠物犬、毛皮经济动物主要传染病，易造成重大经济损失。cdv按照基因组差异可分为亚洲型及美洲型，但有且仅有一个血清型。

cdv为单股负链rna病毒，在目前普遍免疫的环境下，加快了其进化速度，及时对病毒分离鉴定及疫苗更新尤为重要。mdck细胞及vero细胞是分离cdv常用的传代细胞。mdck细胞虽为病毒靶动物细胞，但cdv在传代mdck细胞中生长周期过长或不生长，而且不产生明显的细胞病变。vero细胞缺乏病毒吸附所需要的细胞表面受体，cdv需要适应细胞生长，降低病毒毒力，与母本病毒产生差异。因此构建一种对cdv野毒株敏感，适于病毒增殖的细胞系极为重要。

nectin4是cdv的上皮细胞受体，属免疫蛋白超家族，具备1个v蛋白结构域及2个c蛋白结构域，v蛋白结构域是cdvh蛋白主要的识别位点。nectin4主要分布于上皮细胞，丰富表达于胎盘组织、肺、肠、肾、脑及淋巴结等组织中，cdv感染中后期病毒随淋巴系统扩散至全身，借助nectin4受体侵入上皮组织细胞大量复制并在细胞间相互感染。cdv在上皮细胞中增殖，造成感染动物可见病变，如爪垫增厚肿大，结膜炎，肺肝肾等脏器、小肠、膀胱的广泛出血，并使得病毒释放到呼吸道、消化道以及泌尿系统，随机体代谢向体外排毒成为新的感染源。

发明专利cn102807970a公开了一种犬瘟热病毒敏感细胞系及其建立方法和应用，该发明采用慢病毒四质粒包装系统，获得了一株表达犬源slam的稳定细胞系mdck-csl，其菌种保藏编号为：cgmccno.5881，通过比较cdv标准株在mdck-csl和mdck细胞上的繁殖情况，表明cdv-snyderhill标准毒株感染mdck-csl细胞系24小时即可观察到细胞相互融合、圆缩、明显死亡等细胞病变；而感染mdck细胞持续6天仅表现为细胞生长缓慢，未出现细胞病变。该发明建立的cdv敏感细胞系mdck-csl，为cdv野毒株的分离及其完整的生物学特性研究提供了技术平台，也为犬瘟热病的防控奠定了基础。但相比slam受体，cdv与犬上皮组织受体nectin4的亲和力与结合效率更高，作为受体表达于细胞表面可提高分离成功率。cdv对不同易感对象slam受体识别具有专一性，需建立多个表达不同物种slam受体的细胞系，用于不同来源cdv的分离。nectin4受体多物种间相对保守，建立单一受体细胞系可用于多个种源的cdv病毒分离与鉴定，提高了病毒分离的操作效率。

本发明旨在构建一种对cdv野毒株敏感的vero细胞系，将nectin4受体表达月vero细胞表面，能够高效的分离cdv毒株，为病毒的深入研究及疫苗研发提供重要价值。

技术实现要素：

为克服上述现有技术的不足，本发明提供了提供一种基于nectin4受体的犬瘟热敏感细胞系建立方法及应用。

基于nectin4受体的犬瘟热敏感细胞系建立方法，包括以下步骤：

(1)样品总rna提取及cdna合成：trizol法提取比格犬胎盘组织总rna，以比格犬胎盘组织总rna为模板合成cdna；

(2)nectin4基因的扩增、克隆：利用合成的用于扩增nectin4基因的引物进行pcr扩增，产物纯化后于平末端加a尾形成粘性末端，然后连接至pmd18-t克隆载体上，将连接产物转化至dh5α感受态细胞内，培养并提取阳性菌落pmd18t-nectin4质粒；

(3)nectin4基因修饰：以pmd18t-nectin4质粒为模板，合成引物后采用重叠延伸pcr技术扩增，回收得dnectin4-hatag扩增产物；

(4)将dnectin4-hatag扩增产物双酶切后与同样经过双酶切的plvx-ires-puro质粒进行连接，然后转化至dh5α感受态大肠杆菌内，培养并挑取阳性单菌落，扩大培养无内毒素中提取获得plvx-dnetin4-hatag重组质粒；

(5)重组慢病毒包装：将plvx-dnetin4-hatag重组质粒：pspax2质粒：pmd2.0g质粒以20:15:4的质量比例混匀配置混合质粒，将混合质粒与lipfectamine2000以1:3的质量比混合转染至293ft细胞内，转染48h后收获上清得dnetin4-hatag的复制缺陷型慢病毒；

(6)细胞转染与阳性细胞株的筛选：将含有dnetin4-hatag的复制缺陷型慢病毒的病毒液转染至vero细胞，选用最低致死浓度的嘌呤霉素培养基直至无死亡细胞，标记单细胞克隆并扩大培养，经两次有限稀释筛选后，可以获得稳定表达nectin4受体的细胞株。

优选的，所述步骤(2)中用于扩增nectin4基因的引物序列为：

nectin4-f：5’-atgcctctatccctgggagccgagatgt-3’；

nectin4-r：5’-tcagaccagatgcccccgcccttgatgta-3’。

优选的，所述步骤(3)中的引物序列为：

f1：5’-ccactggtgactatccatatgatgttccagattatgctggggcccagccggccagatctcccgtggggcaggtggcgtgg-3’；

f2：5’-cggaattcgccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgactatccatatgatgttc-3’；

r：5’-cgggattctcagaccagatgcccccgcc-3’。

优选的，所述步骤(4)中用于双酶切的酶为ecori和bamhi。

优选的，所述嘌呤霉素培养基中嘌呤霉素对vero细胞的最低致死浓度为6μg/ml。

进一步，所述的稳定表达nectin4受体的细胞株在培养或分离犬瘟热病毒中的应用。

与现有技术相比，本发明方法具有如下优点：

(1)正常的vero细胞缺乏病毒吸附所需要的细胞表面受体，会导致cdv毒力下降，为增加细胞膜定位效率，本发明使用重叠pcr技术，去掉nectin-4蛋白原有信号肽，替换为强分泌型igκ信号肽及hatag标签，起始密码子之前添加kozak序列以增强转录水平。

(2)本发明采用膜定位信号肽，可以增加受体蛋白在细胞膜上的定位效率，增加细胞表面的受体蛋白个数，提高病毒分离率。

(3)本发明采用nectin4作为cdv上皮细胞受体，其中，nectin4受体的v蛋白结构域与cdvh的结合能力是slam受体的7倍，可以增强cdv对细胞的亲和能力，病毒分离效率更高；slam受体具有专一性，如构建了犬源slam受体细胞，只能用于分离犬源cdv，而如果想要分离其他种源病毒，需重新构建一种其它种源slam细胞，但是，nectin4受体在不同种源之间保守性高，通过一次构建能够表达nectin4受体的细胞，可以分离多种种源cdv，增加了细胞的通用性。

(4)本发明选择vero细胞作为分离的细胞，vero细胞更易消化传代，减少了细胞制备时间；并且，vero细胞更易于悬浮培养等，利于生产转化。

(5)相对于普通真核质粒转染，本发明采用慢病毒转染方式，定向性好，筛选效率高且制备的细胞系稳定性好。

综合上述，通过本发明的方法构建的vero-nectin4能够稳定的表达稳定表达nectin4受体，通用性好，cdv强毒株能够在该细胞系内生长并获得明显的cpe病变，适合在培养或分离犬瘟热病毒中推广应用。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

序列表seqidno：1为本发明比格犬nectin-4基因的核苷酸序列；

序列表seqidno：1为比格犬nectin-4基因修饰改造后的dnectin4-hatag的序列图；

图1为vero细胞及vero-nectin4细胞接种cdv后24h细胞病变结果图；

图2为比格犬nectin-4基因的扩增结果电泳图；

m：dl5000bpmarker；1：阴性对照；2：nectin-4基因；

图3为比格犬nectin-4基因修饰改造后的扩增结果电泳图；

1-3：经修饰改造的nectin-4基因；m：dl2000marker；

图4为plvx-ires-puro质粒图谱；

图5为pmd2.0g质粒图谱；

图6为pspax2质粒图谱；

图7为plvx-ires–puro、pmd2.0g以及pspax2质粒提取结果的电泳图；

m：dl10000bpmarker；1-3：plvx-ires–puro质粒；4-6：pmd2.0g质粒；7-9：pspax2质粒；

图8为plvx-ires-puro重组质粒的鉴定；

m为dl1000bpmarker；1：plvx-dnetin4-hatag重组质粒pcr鉴定结果；2：plvx-dnetin4-hatag重组质粒双酶切鉴定结果；

图9为无内毒素中体质粒电泳结果；

m：dl10000bpmarker；2、plvx-dnetin4-hatag重组质粒；3、pmd2.0g质粒；4、pspax2质粒；

图10为vero细胞嘌呤霉素敏感度筛选；

图11为nectin4蛋白细胞亚定位鉴定结果；

图12为不同代次细胞nectin4mrna鉴定；

m：dl2000bpmarker；1：5代；2：10代；3：20代；4：30代；5：40代；6：50代；

图13为10x物镜下46代vero转染细胞间接免疫荧光鉴定结果图；

图14为20x物镜下46代vero转染细胞间接免疫荧光鉴定结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明具体实施例中涉及的材料及试剂

1、细胞与毒株

vero细胞，293ft细胞购自中国科学院上海细胞库，pmd18-t载体购自宝生物公司，慢病毒表达载体plvx-ires-puro购自clontech，pmd2.0gpspax2由购自addgene公司。synderhill购自atcc。

2、常用生物学试剂

dmem培养基，胎牛血清购自gibco，ph＝7.4pbs，0.25％胰酶购自生工。primestarhs，primescript，rri，dntp(2.5mm，10mmeach)，ligationkit，各大小dnamarker购自宝生物公司。trizol购自invitrogen公司，质粒小提试剂盒、无内毒素质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自omega公司。异丙醇、乙醇等化学试剂为分析纯。

3、主要仪器设备

eppendorf2.5μl-5ml移液器、bioradt100pcr仪、eppendorf5424r台式低温离心机、sigma3k15台式低温水平转子离心机、eppendorfthemostatc金属浴、苏净安泰sw-gj-2f0超净工作台、知楚zq7y-70f全温振荡器、thermonanodrop2000c微量分光光度计、北京六一dyy-6c电泳仪、proxima16phit凝胶成像系统、olympusckx41倒置显微镜、leicacm5荧光倒置显微镜、sanyomco-150ac二氧化碳恒温细胞培养箱。

实施例1基于nectin4受体的犬瘟热敏感细胞系的建立

一、方法

1nectin4基因制备及修饰

1.1组织样品及实验器具处理

无菌环境下采集比格犬胎盘组织样品，使用液氮速冻并保存于-70℃冰箱。取5g组织样品预先低温破碎并置于使用液氮预冷的研钵中，充分研磨至无肉眼可见的组织颗粒，期间不断加入适量液氮，维持组织冰冻状态，取每0.1g研磨完成的组织样品分装至1.5ml无rna酶ep管，加入1mltrizol，充分振荡混匀后存于-70℃冰箱或直接用于总rna提取。

1.2样品总rna提取及cdna合成

1.2.1trizol法提取比格犬胎盘组织totalrna

tzrizol保存组织充分振荡，混合液中加入200μl氯仿，剧烈震荡15s使其充分乳化，4℃静置5min，4℃12000g离心15min。吸取上清液500μl于取新1.5ml离心管，加入等量异丙醇，室温静置10min，4℃12000g离心15min。弃上清液，加入1mldepc处理水配75％乙醇，涡旋混合后，4℃7500g离心5min，弃去上清液，室温通风条件下放置20min，充分挥发酒精。加入20μldepc处理水，60℃助溶10min，适当分装-70℃保存备用。

1.2.2cdna合成

使用通用引物oligodt(18)，以比格犬胎盘组织totalrna为模板合成cdna，冰上操作，按如下表1所示体系及顺序依次加入各试剂。

表1nectin4mrna反转录体系

将以上混合物执行程序：30℃水浴10min，42℃水浴1h，70℃水浴15min后放于-20℃保存备用。

1.3nectin4基因扩增

根据genbank提交的序列，采用primerpremier5软件设计一对nectin4orf特异性引物nectin4-f/nectin4-r，目的片段大小1529bp。引物序列如下：

nectin4-f：5’-atgcctctatccctgggagccgagatgt-3’；

nectin4-r：5’-tcagaccagatgcccccgcccttgatgta-3’。

以necin-4cdna为模板，建立以高保真酶primestar为dna聚合酶的50μl体系，按照表2于冰上依次加入以下试剂。

表2nectin4基因pcr扩增体系

充分混匀后98℃预变性10min，98℃变性10s，68℃退火延伸100s，变性与退火延伸，30个循环，68℃10min，4℃保存备用。扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。

1.4nectin4基因pcr产物的纯化与连接转化

1.4.1nectin4基因pcr产物的纯化

nectin4orfpcr产物使用1％tae琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，回收目的条带。使用干净的切胶刀快速仔细切下含有需nectin4目的基因pcr产物的琼脂胶，放入预先称量质量10ml离心管中，按胶块质量等比例加入溶胶液；将离心管放入60℃水浴锅中溶解15min轻微旋转加速溶解；将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的uniq-10柱中，室温放置2min，12000rpm室温离心1min，超过700μl，需多次滤过；倒掉收集管中的废液，300μlbindingbuffer12000g1min洗涤；弃滤过液，加入500μlwashsolution，12000rpm室温离心1min，并重复一次；弃废液，将uniq-10柱放入同一个收集管中，13000rpm室温空载离心2min；将uniq-10柱放入一个新的1.5ml离心管中，在柱子膜中央逐滴加入20μlelutionbuffer室温静置2min13000rpm室温离心1.5min得nectin4orf纯化产物，-20℃保存备用。

1.4.2nectin4基因产物的连接转化

在分离纯化的nectin4基因扩增片段的平末端加a尾形成粘性末端。其反应体系如表3所示：

表3a克隆体系

于冰上完成体系混合后，72℃水浴保温20min，所得产物于-20℃保存备用。

nectin4pcr扩增片段经加a克隆后，按比例建立10μl连接体系，将nectin4片段连接至pmd18-t克隆载体。操作全程需在冰上进行，配置体系如表4所示：

表4pmd18-t克隆载体连接体系

将连接产物转化至dh5α感受态细胞内，转化步骤如下：-70℃冰箱内取出dh5α感受态细胞，迅速置于冰盒内至冻存液融化。取5μl连接产物在无菌条件下加入到已融化的dh5α感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰浴30min后，42℃水浴90s，立即冰浴2-3min使之冷却。加入890μlsoc培养基，使总体积定容为1ml，漩涡震荡混匀，37℃、220rpm振荡培养1h。吸取100μl菌液，均匀涂布于含amp⁺的lb琼脂平板上，将平皿倒置放于培养箱内，37℃培养10-12h。pcr鉴定形成的单菌落，阳性菌落接种amp液体lb扩大培养。

1.5阳性菌落质粒提取

质粒提取操作采用e.z.n.a.tmplasmidminikiti(质粒小量提取试剂盒i型)，按试剂盒说明书操作方案进行：37℃搖床培养12-16h至od600值达到0.7，室温10000g离心1min收集细菌。弃培养基，加入250μl含有rnasea的solutioni试剂，充分振荡使细胞完全悬浮。重悬液中加入250μlsolutionii，轻轻颠倒混匀4-6次至溶液透明澄清。加入350μlsolutioniii，迅速温和颠倒数次纸质形成白色絮狀沉淀，室温10000g离心10min，仔细吸取上清液，避免沉淀重新悬浮污染。将上清液转移至hibinddna结合柱中，室温10000g离心1min，弃滤液。把柱子重新装回收集管，加入500μlhbbuffer，室温10000g离心，弃滤液。把柱子重新装回收集管，加入700μldnawashbuffer，按上述条件离心，弃去滤液。重复洗涤一次。弃去收集管中滤液，空柱10000g离心2min，以甩干柱子基质。柱子装入干净的1.5ml离心管上，加入30μlelutionbuffer到柱子基质中，室温静置1-2min，10000g离心1min洗脱出dna。

1.6nectin4orf基因修饰

为保证nectin4基因细胞亚定位正确并方便鉴定，更换nectin4基因信号肽，并引入ha标签及kozak序列。以pmd18t-nectin4质粒为模板，设计引物如下：

f1：5’-ccactggtgactatccatatgatgttccagattatgctggggcccagccggccagatctcccgtggggcaggtggcgtgg-3’；

f2：5’-cggaattcgccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgactatccatatgatgttc-3’(ecori)；

r：5’-cgggattctcagaccagatgcccccgcc-3’(bamhi)。

扩增体系及条件见上述表2，1％tae电泳鉴定并回收片段，如序列表seqidno：2所示得到的dnectin4-hatag(即带有ha标签及igк信号肽nectin4受体序列)扩增产物。

2nectin4连接plvx-ires-puro

将plvx-ires-puro顺式基因组质粒(质粒图谱见图4)、pspax2反式作用因子质粒(质粒图谱见图6)和pmd2.0g包装质粒(质粒图谱见图5)分别转化并扩增，提取质粒保存。将提取保存的plvx-ires-puro顺式基因组质粒、pspax2反式作用因子质粒和pmd2.0g包装质粒进行电泳鉴定，结果见图7。

选择ecori和bamhi分别将dnectin4-hatag扩增产物和plvx-ires-puro质粒进行双酶切，回收得到带有ecori和bamhi粘性末端的dnectin4-hatag片段和plvx-ires-puro质粒片段，酶切体系如下：

表5双酶切体系

测定胶回收酶切片段的核酸浓度，然后采用takaraligationkit，将连接产物4℃放置过夜，得plvx-dnetin4-hatag(即带有ha标签及igк信号肽nectin4受体序列连入plvx-ires-puro载体)连接产物，连接体系如下：

表6真核表达载体连接体系

将plvx-dnetin4-hatag连接产物全量加入100μldh5α感受态大肠杆菌中，轻轻吹打混匀，冰上放置30min，42℃热激45s，加入soc培养基补液至总体积为1ml，37℃180rpm恒温摇床振荡培养1h，培养后取100μl涂布于添加了amp的lb平板上，37℃继续培养过夜，直至生长出肉眼可见的单菌落，挑取单菌落鉴定为阳性后，扩大培养无内毒素中提取获得plvx-dnetin4-hatag重组质粒。

3重组慢病毒包装

复苏液氮中保存的293ft细胞，连续传代2～3代，调整细胞状态为最佳。0.25％胰酶消化细胞，接种6孔板每孔2.5ml，置于37℃5％co2细胞培养箱内继续培养8～10h，待细胞融合度达到80％。以plvx-dnetin4-hatag：pspax2：pmd2.0g＝20:15:4质量比例配制混合质粒，总质粒质量2.5μg，混合质粒与lipfectamine2000比例为1:3。转染后置于37℃，5％co2培养箱内继续培养48h，收获细胞上清，3500rpm离心5min去除细胞碎片，收获上清液即为含有dnetin4-hatag的复制缺陷型慢病毒，分装后-80℃保存。

4细胞转染与阳性细胞株的筛选

复苏vero细胞，连续传代2～3代，调整细胞状态为最佳。0.25％胰酶消化贴壁细胞，细胞液计数测定细胞浓度，用完全培养基调整细胞浓度，将细胞浓度调整为1000cell/ml，24孔板每孔添加500μl细胞液，放置于37℃5％co2细胞恒温培养箱内24h待细胞贴壁。分别使用0、2、4、6、8、10μg/ml浓度嘌呤霉素完全培养基进行筛选，每梯度设置两个重复，每天观察细胞状态并两天更换一次细胞培养液，一周后后观察细胞死亡情况，选择最小完全杀死细胞浓度。确定最佳浓度为6μg/ml。

vero细胞接种6孔板待细胞回合度达到80％。从-80℃冰箱内取出冻存的含有dnetin4-hatag的复制缺陷型慢病毒的病毒液，置于冰上融化。吸弃六孔板细胞液，每孔加入1ml含有dnetin4-hatag的复制缺陷型慢病毒的病毒液，37℃细胞培养箱内孵育细胞2h，后加入1.5ml完全培养基，继续培养2d。2d后更换终浓度为6μg/ml嘌呤霉素培养基，继续培养，每日观察细胞状态并每隔一日更换一次培养基，直至无死亡细胞。将一轮筛选细胞胰酶消化成单细胞均匀悬液，有限稀释法接种于96孔板中，继续培养，培养过程中实时记录有且仅有一个单细胞克隆的孔。

5间接免疫荧光鉴定

单细胞克隆生长为细胞簇后，0.25％胰酶消化细胞，单孔细胞一分为二接种于两个96孔板同编号孔中，置于37℃5％co2培养箱中继续培养24h，取其中一板用于间接免疫荧光试验。细胞弃去细胞液，使用37℃温育过的ph＝7.4(下同)冲洗细胞三次，每次100μl并轻微震荡后弃去。4％中性多聚甲醛置于4℃冰箱内保存，使用冷多聚甲醛固定液固定细胞，每孔30μl，室温放置15min以充分固定细胞。洗净固定液，使用pbst(2‰吐温-20，下同)100μl，置于摇床上震荡洗涤三次，每次5min。每孔加入40μl4％pbst脱脂奶封闭液室温震荡孵育1h，弃封闭液。1:300pbst稀释anti-ha鼠源单克隆抗体作为一抗孵育液，每孔30μl轻微震荡后，置于湿盒内4℃孵育过夜。以下操作均在暗室内进行，去一抗孵育液，pbst震荡洗涤三次，每次5min。加入30μl1:500pbst稀释的anti-mouseantibodyfitc荧光二抗，室温震荡孵育1h，去二抗孵育液，pbst冲洗三遍，每次5min。hochest染液pbst1:300稀释，孵育细胞10min，去染色液pbst震荡冲洗三次，每次三分钟，最后使用封片剂封片，荧光倒置显微镜和激光共聚焦显微镜下观察。

二、结果

1犬源nectin-4基因的扩增与鉴定

经pcr鉴定与测序分析，如序列表seqidno：1所示获得orf为1529bp的比格犬nectin-4基因，信号肽序列为氨基端前30个氨基酸。为增加细胞膜定位效率，使用重叠pcr方法，去掉nectin-4蛋白原有信号肽，替换为强分泌型igκ信号肽及hatag标签，起始密码子之前添加kozak序列以增强转录水平，如图2所示，经修饰改造的nectin-4基因即dnectin4-hatag的序列全长为1470bp。

2重组慢病毒表达载体构建及鉴定

选择ecori和bamhi分别将dnectin4-hatag扩增产物和plvx-ires-puro质粒进行双酶切，将带有ecori和bamhi粘性末端的酶切片段回收并连接转化，获得重组慢病毒基因组质粒plvx-dnetin4-hatag，以该重组质粒为模板，以方法1.6中的f2/r为引物扩增经修饰改造的nectin-4基因，扩增结果见图8；将plvx-dnetin4-hatag重组质粒采用ecori和bamhi进行双酶切鉴定，酶切结果见图8。通过质粒pcr及双酶切鉴定，证明重组质粒连接正确。扩大培养后无内毒素中提重组质粒保存备用，电泳结果见图9。

3vero细胞嘌呤霉素敏感度筛选

10000cells铺板24孔板，分别使用0、2、4、6、8、10μg/ml浓度嘌呤霉素完全培养基进行筛选，每隔一天更换细胞培养液，5天后观察细胞死亡情况，选择最小完全杀死细胞浓度，筛选结果见图10，确定最佳浓度为6μg/ml。

4病毒包装及转染鉴定

293t细胞培养，约5×106cell/孔铺板6孔板，待细胞长至单层70％，以plvx-ires-puro：pspax2：pmd2.0g＝20:15:4质量比例比例转染，总质粒质量2.5μg，分别按质粒：脂质体＝1:1、2、3比例转染。转染后分别在24h，48h，72h收集293t细胞上清，4000rpm5min，经0.45nm滤器过滤后，多次孵育vero细胞，以第一次孵育时间计算，72h后间接免疫荧光观察nectin-4蛋白表达情况，nectin-4蛋白有均匀表达。如图11所示，激光共聚焦显微镜显示，nectin4蛋白定位于细胞膜上。

5稳定细胞系筛选及鉴定

将重组慢病毒转染的vero用胰酶消化，终止消化后调整细胞密度至10000cell/ml，每个96孔板接种200μl并做有限稀释处理，生长过程中时时观察细胞生长状态，标记有且仅有一个亚细胞克隆的孔，消化后扩大培养。经两次有限稀释筛选后，可以获得稳定表达nectin4受体的细胞株vero-nectin4(即表达nectin4受体的vero细胞)。细胞连续传代，分别在5代、10代、20代、30代、40代和50代提取总rna鉴定，如图12所示，均能检测出有完整nectin4mrna转录。如图13和14所示，46代间接免疫荧光鉴定，nectin4受体高效率表达。

6cdv细胞敏感性试验

cdv强毒标准株synderhill株病毒液，5％接种量分别感作vero细胞以及vero-nectin4细胞2h，感作后换为血清浓度为1％的细胞维持液，细胞培养箱内继续培养。如图1所示，在vero-nectin4中，毒株感作后12h即有cpe产生，至24h出现明显的cpe，包括细胞溃缩，拉网以及合胞体并开始脱落，至36h细胞脱落。同时间段vero细胞，培养至96小时未出现有明显的cpe，盲传三代细胞仍未出现明显的cpe。以上实验，证明cdv强毒株不能在普通vero细胞增殖，而能够表达nectin4受体的vero细胞可生长，获得cpe病变。

实施例2采用pci-neo质粒转染方法

通过pcr方法扩增得到ires-puro片段，通过酶切位点将ires-puro片段连入到pmd18t-nectin4质粒nectin4序列下游，获得nectin4-ires-puro串联序列。扩增该重组质粒，通过酶切位点，分别双酶切pci-neo载体及重组质粒，将nectin4-ires-puro序列连入至pci-neo载体中，获得pci-nip质粒。

pci-nip质粒脂质体方法转染vero细胞，转染后继续培养24h，24h后将转染细胞消化并按1：10比例稀释传代至10cm培养皿中，继续培养24h。待细胞转染48h后，将培养基更换为含有6μg/ml嘌呤霉素的完全培养基，继续培养直至对照组细胞全部死亡。将转染阳性细胞消化，通过有限稀释法稀释至多个96孔板中，继续培养直至含有单细胞克隆的孔生长出细胞簇。将单细胞簇消化并扩大培养，通过间接免疫荧光方法鉴定，选择nectin4蛋白表达丰度高且定位正确的细胞，进行第二轮有限稀释筛选，获得的单细胞簇经鉴定正确的扩大培养，获得稳定表达的细胞系。

作为对照实施例，实施例2的筛选具有随机性，筛选效率不如实施例1的慢病毒高，并且，实施例2获得的细胞系稳定性不足。

以上所述仅为发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>山东信得科技股份有限公司

<120>基于nectin4受体的犬瘟热敏感细胞系建立方法及应用

<160>2

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