本发明属于生物技术领域，具体涉及一种紫背菜多糖多酚联合制备方法。
背景技术：
紫背菜（gynurabicolordc）别名血皮菜、观音菜、红风菜、紫背天葵等，系菊科三七草属中以嫩茎叶作菜用的半栽培种，多年生宿根常绿草本植物。紫背菜原产于中国，四川、浙江、广东、广西、海南、福建、台湾等地，或野生或栽培种植，尤以四川、重庆一带广为栽培食用。
紫背菜是一种食用兼药用的保健蔬菜，嫰叶茎可凉拌或炒食，同时富含粗蛋白、可食性纤维、脂肪、氨基酸、生物碱、黄酮类物质、挥发油和矿物质。紫背菜的矿质营养较为丰富，特别是铁、铜，锌等微量元素含量较高，还含有黄酮甙成分，这种成分无毒，具有延长抗坏血酸和减少血管紫瘢的作用。除了供直接食用或制作净菜，紫背菜在中国还被用于生产药酒和保健茶，并在日本被用作制备天然食品色素。紫背菜营养全面且兼具保健功能，集“鲜、绿、野”和“营养”、“药用”、“味美”于一身，是重要的绿色保健食品资源。
紫背菜含有三七多糖，其具有多种与生物机能的维持密切相关的生物活性功能。三七多糖是由许多相同或不同的单糖以α或β-糖苷键所组成的化合物，拥有复杂的四级结构，具有免疫调节、抗病毒、延缓衰老、抗肿瘤、抗辐射等作用，除此之外，多糖还具有抗凝血、抗炎、抗菌、抗惊厥、镇静、止喘及降血压等其他生物活性。近年来，人们对多糖的结构和活性的研究不断深入，进一步阐明了多糖作用机制与结构的关系，其多样性的生理活性更加受到重视。
目前植物多糖的提取方法主要有溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声波强化法、微波法等。本发明所用的多糖提取方法为乙醇水提法，相对于其他几种方法，其反应条件温和，提取速度快，提取的多糖纯度高。
紫背菜中的多酚物质包括黄酮类物质和花青素类等。植物多酚又称单宁或鞣质，包括单宁及与单宁有生源关系的化合物，具有多元酚羟基和羧基结构，主要骨架类型为c6-cl型和c6-c3型。植物多酚的独特结构使其具有多种功效，花青素类物质是多酚的一种，是具有特殊分子结构的生物类黄酮，能有效的清除自由基，具有抗氧化性、抑菌、抗癌、抗炎、抗病毒等活性，可保护人体组织免受自由基的氧化损伤，并能有效改善人体微循环。
目前对植物多酚提取研究较多，主要提取方法有溶剂萃取法、超声波浸取法、微波浸提法、吸附分离提取法、金属离子分离法、生物酶解提取法等。本发明所用的多酚提取方法为吸附分离提取法，其优势在于树脂对植物多酚的吸附作用强且可循环利用，操作条件温和，提取率较高，分离产物品质较好，无毒等。
cn201511008885.0涉及一种辣木籽中多糖提取方法，将粉碎后的粉末状辣木籽放入水中，在一定温度下浸泡一定时间，提取，得辣木籽多糖提取液，所述的辣木籽多糖提取液中多糖的产率达到14％以上，此方法多糖的提取率虽高，但纯度较低。cn201611054253.2提供了一种翻白草多糖提取方法，利用生物酶解技术从翻白草中提取多糖，再加上超声波处理、超滤、醇沉、季铵盐沉淀、盐洗、醇沉精制或大孔树脂柱精制，获得纯度较高的翻白草多糖，该法获得的多糖纯度虽高，但操作过程繁琐，成本较高。cn201210229217.0提供一种梨多酚的提取方法，将梨幼果去皮去核，切成小于1cm3的小块，用液氮研磨成粉末，用30-90%的乙醇溶液对梨果进行浸提2-6h，离心，所得上清液即为梨多酚提取液，该法提取的多酚活性虽高，同时成本也高，不适合工业化生产，资源浪费现象严重。cn201310300937.6是将剥开紫茉莉种子，弃掉内瓤，留下外皮，烘干至恒重，粉碎后过80-100目筛，按料液比1:5-25加入浓度为30-95%的乙醇溶液，于60℃的恒温水浴锅中加热提取30-150min，浸提液经抽滤、浓缩、干燥得多酚提取物，此方法生产成本低，但提取的多酚纯度不高，提取率也偏低。
技术实现要素：
本发明提供了一种紫背菜多糖多酚联合制备的方法。该法将多糖多酚的制备联合起来，减少了操作工艺，提高了资源的利用率，增加了效率，同时有效地提高了提取的多糖多酚的纯度。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
所述制备方法包括以下步骤：
（1）将新鲜紫背菜摘除掉坏叶和老梗以及虫洞的叶片后，洗净之后剁碎，装于密封袋，4℃冰箱中保存备用。
（2）准确称取剁碎后的紫背菜新鲜叶，按固液比1:4g/ml加入50%乙醇水溶液（乙醇：水（v/v）=1:1），在45℃的条件下于摇床中提取3h，粗过滤后，收集滤液及滤渣。将滤渣再以1:2g/ml的固液比添加50%乙醇水溶液（乙醇：水（v/v）=1:1）在相同的条件下重复提取一次，经粗过滤后进行抽滤，并将两次的提取液合并。混匀后，用真空旋转蒸发器进行浓缩直至体积为原来体积的1/6，将浓缩粗提液用棕色试剂瓶装好后，置于冰箱保鲜层保藏备用。
（3）取浓缩液，加入3倍体积的95%的乙醇溶液，混匀后，150r/min磁力搅拌30min，保鲜膜封盖烧杯口，常温静置过夜。将其混合液6000r/min离心10min，分别收集沉淀和上清液，沉淀是粗多糖物质，上清液需进一步处理得到多酚物质。
（4）将沉淀配制浓度为2-3mg/ml的粗多糖溶液100ml，添加酶量为1000u/g的中性蛋白酶，调节ph=7，在50℃酶条件下，酶解2h。将经脱蛋白处理后的溶液，6000r/min离心10min，收集沉淀，为紫背天葵多糖。
（5）将步骤（3）醇沉离心后的上清液一半在45℃下进行旋蒸，浓缩到50ml过滤后，将滤液经sephadexlh20柱层析连续纯化，先经1000ml50%的乙醇洗脱，后用500ml70%丙酮水溶液洗脱，丙酮洗脱液经45℃旋转蒸发，并放入-20℃冰箱保存2h，再在-80℃冰箱保存4h后进行冷冻干燥，得到紫背菜原花青素。
（6）将醇沉离心后的剩余上清液也在45℃下进行旋蒸，浓缩到50ml过滤后，将滤液经seppakc18柱层析连续纯化，先经1000ml10%乙醇水溶液洗脱，后用500ml80%乙醇水溶液洗脱，80%乙醇水洗脱液经45℃旋转蒸发，放入-20℃冰箱保存2h，再在-80℃冰箱保存4h后进行冷冻干燥，得到紫背菜花青素。
本发明的优点在于：将制备紫背菜多糖的工艺与多酚的工艺联合起来，精简了制备工艺，提高了工作效率；避免了资源浪费，提高了资源的利用率；同时能很好的保证所提取的多糖多酚的纯度，提高回收率。
具体实施方式
实施例1
将漳州产地的新鲜紫背菜摘除掉坏叶和老梗以及虫洞的叶片后，洗净之后剁碎，装于密封袋，4℃冰箱中保存备用。
准确称取200g剁碎后的紫背菜新鲜叶，按固液比1:4g/ml加入800ml50%乙醇水溶液（乙醇：水（v/v）=1:1），在45℃的条件下于摇床中提取3h，粗过滤后，收集滤液及滤渣。将滤渣再以1:2g/ml的固液比添加400ml50%乙醇水溶液（乙醇：水（v/v）=1:1）在相同的条件下重复提取一次，经粗过滤后进行抽滤，并将两次的提取液合并。混匀后，用真空旋转蒸发器进行浓缩直至体积为原来体积的1/6，将浓缩粗提液用棕色试剂瓶装好后，置于冰箱保鲜层保藏备用。
取150ml浓缩液，加入3倍体积的450ml95%的乙醇溶液，混匀后，150r/min磁力搅拌30min,保鲜膜封盖烧杯口，常温静置过夜。将其混合液6000r/min离心10min,分别收集沉淀和上清液，沉淀是粗多糖物质，上清液需进一步处理得到多酚物质。
将得到的粗多糖沉淀配制成2mg/ml的粗多糖溶液100ml，添加酶量为1000u/g的中性蛋白酶，调节ph=7，在50℃酶最适条件下，酶解2h。将处理后的溶液置于离心管中，6000r/min离心10min，收集沉淀。结果显示，漳州产地的紫背菜的多糖回收率为80.21%，纯度为75.56%。
将醇沉离心后的上清液各取一半经旋蒸、浓缩后，分别经过sephadexlh20和seppakc18柱层析连续纯化。sephadexlh20柱经1000ml50%的乙醇洗脱后用500ml70%丙酮水溶液洗脱，将丙酮洗脱液经45℃旋转蒸发，并放入-20℃冰箱保存2h，在-80℃冰箱保存4h后进行冷冻干燥，得到紫背菜原花青素。结果表明，漳州产地的紫背菜的原花青素回收率为70.25%，纯度为80.30%。
同时，取醇沉离心后的剩余上清液过seppakc18柱，经1000ml10%乙醇水溶液洗脱后用500ml80%乙醇水溶液洗脱，将80%乙醇水洗脱液经45℃旋转蒸发，放入-20℃冰箱保存2h，在-80℃冰箱保存4h后进行冷冻干燥，得到紫背菜花青素，结果显示，漳州产地的紫背菜的花青素回收率为75.77%，纯度为75.46%。
实施例2
将广西产地的新鲜紫背菜摘除掉坏叶和老梗以及虫洞的叶片后，洗净之后剁碎，装于密封袋，4℃冰箱中保存备用。
准确称取200g剁碎后的紫背菜新鲜叶，按固液比1:4g/ml加入800ml50%乙醇水溶液（乙醇：水（v/v）=1:1），在45℃的条件下于摇床中提取3h，粗过滤后，收集滤液及滤渣。将滤渣再以1:2g/ml的固液比添加400ml50%乙醇水溶液（乙醇：水（v/v）=1:1）在相同的条件下重复提取一次，经粗过滤后进行抽滤，并将两次的提取液合并。混匀后，用真空旋转蒸发器进行浓缩直至体积为原来体积的1/6，将浓缩粗提液用棕色试剂瓶装好后，置于冰箱保鲜层保藏备用。
取150ml浓缩液，加入3倍体积的450ml95%的乙醇溶液，混匀后，150r/min磁力搅拌30min,保鲜膜封盖烧杯口，常温静置过夜。将其混合液6000r/min离心10min,分别收集沉淀和上清液，沉淀是粗多糖物质，上清液需进一步处理得到多酚物质。
将得到的粗多糖沉淀配制成3mg/ml的粗多糖溶液100ml，添加酶量为1000u/g的中性蛋白酶，调节ph=7，在50℃酶最适条件下，酶解2h。将处理后的溶液置于离心管中，6000r/min离心10min，收集沉淀。结果显示，广西产地的紫背菜的多糖回收率为75.57%，纯度为70.99%。
将醇沉离心后的上清液各取一半经旋蒸、浓缩后，分别经过sephadexlh20和seppakc18柱层析连续纯化。sephadexlh20柱经1000ml50%的乙醇洗脱后用750ml70%水丙酮洗脱，将丙酮洗脱液经45℃旋转蒸发，并放入-20℃冰箱保存2h，在-80℃冰箱保存4h后进行冷冻干燥，得到紫背菜原花青素，结果表明，广西产地的紫背菜的原花青素回收率为60.11%，纯度为70.32%。
同时，取醇沉离心后的剩余上清液过seppakc18柱，经750ml10%乙醇水溶液洗脱后用500ml80%乙醇水溶液洗脱，将80%乙醇水洗脱液经45℃旋转蒸发，放入-20℃冰箱保存2h，在-80℃冰箱保存4h后进行冷冻干燥，得到紫背菜花青素，结果显示，广西产地的紫背菜的花青素回收率为70.89%，纯度为75.33%。
实施例3
将浙江产地的新鲜紫背菜摘除掉坏叶和老梗以及虫洞的叶片后，洗净之后剁碎，装于密封袋，4℃冰箱中保存备用。
准确称取200g剁碎后的紫背菜新鲜叶，按固液比1:4g/ml加入800ml50%乙醇水溶液（乙醇：水（v/v）=1:1），在45℃的条件下于摇床中提取3h，粗过滤后，收集滤液及滤渣。将滤渣再以1:2g/ml的固液比添加400ml50%乙醇水溶液（乙醇：水（v/v）=1:1）在相同的条件下重复提取一次，经粗过滤后进行抽滤，并将两次的提取液合并。混匀后，用真空旋转蒸发器进行浓缩直至体积为原来体积的1/6，将浓缩粗提液用棕色试剂瓶装好后，置于冰箱保鲜层保藏备用。
取150ml浓缩液，加入3倍体积的450ml95%的乙醇溶液，混匀后，150r/min磁力搅拌30min,保鲜膜封盖烧杯口，常温静置过夜。将其混合液6000r/min离心10min,分别收集沉淀和上清液，沉淀是粗多糖物质，上清液需进一步处理得到多酚物质。
将得到的粗多糖沉淀配制成2.5mg/ml的粗多糖溶液100ml，添加酶量为1000u/g的中性蛋白酶，调节ph=7，在50℃酶最适条件下，酶解2h。将处理后的溶液置于离心管中，6000r/min离心10min，收集沉淀。结果显示，浙江产地的紫背菜的多糖回收率为70.33%，纯度为65.49%。
将醇沉离心后的上清液各取一半经旋蒸、浓缩后，分别经过sephadexlh20和seppakc18柱层析连续纯化。sephadexlh20柱经1000ml50%的乙醇洗脱后用800ml70%水丙酮洗脱，将丙酮洗脱液经45℃旋转蒸发，并放入-20℃冰箱保存2h，在-80℃冰箱保存4h后进行冷冻干燥，得到紫背菜原花青素，结果表明，浙江产地的紫背菜的原花青素回收率为60.15%，纯度为65.37%。
同时，取醇沉离心后的剩余上清液过seppakc18柱，经800ml10%乙醇水溶液洗脱后用500ml80%乙醇水溶液洗脱，将80%乙醇水洗脱液经45℃旋转蒸发，放入-20℃冰箱保存2h，在-80℃冰箱保存4h后进行冷冻干燥，得到紫背菜花青素，结果显示，浙江产地的紫背菜的花青素回收率为65.02%，纯度为60.99%。
实施例4
将海南产地的新鲜紫背菜摘除掉坏叶和老梗以及虫洞的叶片后，洗净之后剁碎，装于密封袋，4℃冰箱中保存备用。
准确称取200g剁碎后的紫背菜新鲜叶，按固液比1:4g/ml加入800ml50%乙醇水溶液（乙醇：水（v/v）=1:1），在45℃的条件下于摇床中提取3h，粗过滤后，收集滤液及滤渣。将滤渣再以1:2g/ml的固液比添加400ml50%乙醇水溶液（乙醇：水（v/v）=1:1）在相同的条件下重复提取一次，经粗过滤后进行抽滤，并将两次的提取液合并。混匀后，用真空旋转蒸发器进行浓缩直至体积为原来体积的1/6，将浓缩粗提液用棕色试剂瓶装好后，置于冰箱保鲜层保藏备用。
取150ml浓缩液，加入3倍体积的450ml95%的乙醇溶液，混匀后，150r/min磁力搅拌30min,保鲜膜封盖烧杯口，常温静置过夜。将其混合液6000r/min离心10min,分别收集沉淀和上清液，沉淀是粗多糖物质，上清液需进一步处理得到多酚物质。
将得到的粗多糖沉淀配制成2mg/ml的粗多糖溶液150ml，添加酶量为1000u/g的中性蛋白酶，调节ph=7，在50℃酶最适条件下，酶解2h。将处理后的溶液置于离心管中，6000r/min离心10min，收集沉淀。结果显示，海南产地的紫背菜的多糖回收率为75.09%，纯度为80.55%。
将醇沉离心后的上清液各取一半，经旋蒸、浓缩后，分别经过sephadexlh20和seppakc18柱层析连续纯化。sephadexlh20柱经1000ml50%的乙醇洗脱后用500ml70%水丙酮洗脱，将丙酮洗脱液经45℃旋转蒸发，并放入-20℃冰箱保存2h，在-80℃冰箱保存4h后进行冷冻干燥，得到紫背菜原花青素，结果表明，海南产地的紫背菜的原花青素回收率为70.46%，纯度为75.91%。
同时，取醇沉离心后的剩余上清液过seppakc18柱，经1000ml10%乙醇水溶液洗脱后用500ml80%乙醇水溶液洗脱，将80%乙醇水洗脱液经45℃旋转蒸发，放入-20℃冰箱保存2h，在-80℃冰箱保存4h后进行冷冻干燥，得到紫背菜花青素，结果显示，海南产地的紫背菜的花青素回收率为70.33%，纯度为75.67%。
实施例5
将台湾产地的新鲜紫背菜摘除掉坏叶和老梗以及虫洞的叶片后，洗净之后剁碎，装于密封袋，4℃冰箱中保存备用。
准确称取200g剁碎后的紫背菜新鲜叶，按固液比1:4g/ml加入800ml50%乙醇水溶液（乙醇：水（v/v）=1:1），在45℃的条件下于摇床中提取3h，粗过滤后，收集滤液及滤渣。将滤渣再以1:2g/ml的固液比添加400ml50%乙醇水溶液（乙醇：水（v/v）=1:1）在相同的条件下重复提取一次，经粗过滤后进行抽滤，并将两次的提取液合并。混匀后，用真空旋转蒸发器进行浓缩直至体积为原来体积的1/6，将浓缩粗提液用棕色试剂瓶装好后，置于冰箱保鲜层保藏备用。
取150ml浓缩液，加入3倍体积的450ml95%的乙醇溶液，混匀后，150r/min磁力搅拌30min,保鲜膜封盖烧杯口，常温静置过夜。将其混合液6000r/min离心10min,分别收集沉淀和上清液，沉淀是粗多糖物质，上清液需进一步处理得到多酚物质。
将得到的粗多糖沉淀配制成3mg/ml的粗多糖溶液150ml，添加酶量为1000u/g的中性蛋白酶，调节ph=7，在50℃酶最适条件下，酶解2h。将处理后的溶液置于离心管中，6000r/min离心10min，收集沉淀。结果显示，台湾产地的紫背菜的多糖回收率为75.06%，纯度为70.47%。
将醇沉离心后的上清液各取一半经旋蒸、浓缩后，分别经过sephadexlh20和seppakc18柱层析连续纯化。sephadexlh20柱经1000ml50%的乙醇洗脱后用750ml70%水丙酮洗脱，将丙酮洗脱液经45℃旋转蒸发，并放入-20℃冰箱保存2h，在-80℃冰箱保存4h后进行冷冻干燥，得到紫背菜原花青素，结果表明，台湾产地的紫背菜的原花青素回收率为55.15%，纯度为60.84%。
同时，取醇沉离心后的剩余上清液过seppakc18柱，经750ml10%乙醇水溶液洗脱后用500ml80%乙醇水溶液洗脱，将80%乙醇水洗脱液经45℃旋转蒸发，放入-20℃冰箱保存2h，在-80℃冰箱保存4h后进行冷冻干燥，得到紫背菜花青素，结果显示，台湾产地的紫背菜的花青素回收率为65.66%，纯度为60.35%。
实施例6
将广东产地的新鲜紫背菜摘除掉坏叶和老梗以及虫洞的叶片后，洗净之后剁碎，装于密封袋，4℃冰箱中保存备用。
准确称取200g剁碎后的紫背菜新鲜叶，按固液比1:4g/ml加入800ml50%乙醇水溶液（乙醇：水（v/v）=1:1），在45℃的条件下于摇床中提取3h，粗过滤后，收集滤液及滤渣。将滤渣再以1:2g/ml的固液比添加400ml50%乙醇水溶液（乙醇：水（v/v）=1:1）在相同的条件下重复提取一次，经粗过滤后进行抽滤，并将两次的提取液合并。混匀后，用真空旋转蒸发器进行浓缩直至体积为原来体积的1/6，将浓缩粗提液用棕色试剂瓶装好后，置于冰箱保鲜层保藏备用。
取150ml浓缩液，加入3倍体积的450ml95%的乙醇溶液，混匀后，150r/min磁力搅拌30min,保鲜膜封盖烧杯口，常温静置过夜。将其混合液6000r/min离心10min,分别收集沉淀和上清液，沉淀是粗多糖物质，上清液需进一步处理得到多酚物质。
广东产地的紫背菜经水提、醇沉后，将得到的粗多糖沉淀配制成2.5mg/ml的粗多糖溶液150ml，添加酶量为1000u/g的中性蛋白酶，调节ph=7，在50℃酶最适条件下，酶解2h。将处理后的溶液置于离心管中，6000r/min离心10min，收集沉淀。结果显示，广东产地的紫背菜的多糖回收率为70.80%，纯度为65.79%。
将醇沉离心后的上清液各取一半经旋蒸、浓缩后，分别经过sephadexlh20和seppakc18柱层析连续纯化。sephadexlh20柱经1000ml50%的乙醇洗脱后用800ml70%水丙酮洗脱，将丙酮洗脱液经45℃旋转蒸发，并放入-20℃冰箱保存2h，在-80℃冰箱保存4h后进行冷冻干燥，得到紫背菜原花青素，结果表明，广东产地的紫背菜的原花青素回收率为60.21%，纯度为60.75%。
同时，取醇沉离心后的剩余上清液过seppakc18柱，经800ml10%乙醇水溶液洗脱后用500ml80%乙醇水溶液洗脱，将80%乙醇水洗脱液经45℃旋转蒸发，放入-20℃冰箱保存2h，在-80℃冰箱保存4h后进行冷冻干燥，得到紫背菜花青素，结果显示，广东产地的紫背菜的花青素回收率为60.45%，纯度为65.89%。
通过实施例1~6，比较从不同产地紫背菜中提取的多糖、原花青素以及花青素的回收率及纯度，可知本发明的多糖和多酚的提取率相对较高。实施例1和4为第一组，实施例2和5是第二组，实施例3和6是第三组，三个组相比较，实施例1和4中多糖、原花青素以及花青素的回收率及纯度较其他两组明显提高，因此，本发明所设计的紫背菜中多糖、原花青素以及花青素的提取方法具有很高的效率。其中，多糖的最佳提取工艺为：2mg/ml粗多糖浓度100ml，中性蛋白酶的添加量为1000u/g，ph=7，在50℃酶最适条件下，酶解2h。将处理后的溶液置于离心管中，6000r/min离心10min；原花青素的最佳提取工艺为：sephadexlh20柱经1000ml50%的乙醇洗脱后用500ml70%水丙酮洗脱，将丙酮洗脱液经45℃旋转蒸发，并放入-20℃冰箱保存2h，在-80℃冰箱保存4h后进行冷冻干燥；花青素的最佳提取工艺为：乙醇洗脱液过seppakc18柱，经1000ml10%乙醇水溶液洗脱后用500ml80%乙醇水溶液洗脱，将80%乙醇水洗脱液经45℃旋转蒸发，放入-20℃冰箱保存2h，在-80℃冰箱保存4h后进行冷冻干燥。