一种用于检测肺癌的试剂盒的制作方法

本发明涉及医学检测领域，更具体的涉及一种用于检测肺癌的试剂盒。
背景技术：
：肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确。根据世界卫生组织(who)的病理学分析，肺癌分为四种主要组织类型：小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者还可再进一步分为肺腺癌、鳞状上皮细胞癌和大细胞癌。大细胞肺癌实际上是肺腺癌的一种变异，在组织学上它既没有鳞癌的特征，也没有腺癌或小细胞肺癌的特征，属于一种未分化型肺癌。大细胞肺癌发病率不高，占全部肺癌的2％～8％。大细胞肺癌常发生于肺上叶，多为周围型，体积较大，边界清楚，分叶，少见空洞。其恶性程度高，治疗效果差，预后不良。因此如果能够在发病早期及时的诊断出大细胞肺癌将大大提高患者的治疗效果，而现有的常规检测方法均无法有效的在早期检测出大细胞肺癌，因此迫切的需要提供一种早期诊断大细胞肺癌的方法。技术实现要素：本发明的目的是提供一种用于检测肺癌的试剂盒，具体来说是一种检测大细胞肺癌的试剂盒。本发明的一个技术方案是提供一种用于检测肺癌的试剂盒，其包含特异性检测mirna-6070的试剂。优选的，所述试剂包括反转录引物、正向引物、反向引物，所述反转录引物序列如seqidno：1所示，所述正向引物的序列如seqidno：2所示，所述反向引物的序列如seqidno：3所示。本发明的另一个技术方案是提供seqidno：1-3在用于制备检测肺癌的试剂盒中的用途。发明人在前期的细胞学试验中，通过差显表达的方法发现mirna-6070的表达量与大细胞肺癌密切相关，mirna-6070的高表达预示着大细胞肺癌的发生，为了进一步证实该结论，发明人又通过临床样本统计学实验进一步证实了该相关性。本发明的试剂盒可以有效的检测大细胞肺癌，所述试剂盒可快速实现mirna的定量检测，从而达到快速有效的检测大细胞肺癌的目的。附图说明图1引物的扩增曲线图2临床标本中大细胞肺癌与正常对照组之间外周血mirna-6070的表达水平比较图具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1样本收集及伦理声明收集60例大细胞肺癌和30例正常人群血液，所有标本均来自苏州大学第一附属医院和苏州大学第二附属医院，标本收集时间为2015年9月至2017年6月。上述标本的收集均通过苏州大学第一附属医院伦理审查委员会和苏州大学第二附属医院伦理审查委员会的批准，所有受试者均签署了知情同意书。以上肺大细胞癌血清标本来源的病人均通过穿刺活检或者手术得到了细胞学或者病理学的病理诊断，病人在采血之前未经过任何放疗或化疗的治疗。1.血清mirna的提取1)200μl血清中加入500μltrizol，涡旋振荡30s，室温静置5min。2)加200μl三氯甲烷，剧烈颠倒混匀45s，室温静置5min。3)离心30min(13000rpm，4℃)，小心将上清液移至新的1.5ml离心管。4)加等体积的异丙醇至上清液中，颠倒混匀，置-20℃静置30min。5)离心30min(13000rpm，4℃)，沉淀总rna。6)吸弃上清液，沉淀用体积分数1ml75％乙醇洗1次。7)离心5min(7500rpm，4℃)，沉淀rna。8)吸净乙醇，室温放置晾干，加入50μldepc水，充分溶解。9)琼脂糖凝胶电泳检测rna，rna完好无降解。2.mirna逆转录使用天根公司fastquantrtkit快速反转录试剂盒合成第一链cdna1)将模板rna在冰上解冻；5×gdnabuffer、fq-rtprimermix、10×fastrtbuffer、无rna水在室温解冻，解冻后迅速置于冰上。2)按下表基因组dna的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。基因组dna的去除体系组成成分使用量5×gdnabuffer2μltotalrna1μl无rna酶水7μl3)按下表反转录反应体系配制混合液。反转录反应体系:上表中反转录引物序列为：ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagctccaggg(seqidno:1)。同时反转录u6，其反转录引物rt-u6为:cgcttcacgaatttgcgtgtcat(seqidno:4)。4)将反转录反应中的混合液，加到基因组去除步骤的反应液中，充分混匀。5)42℃，孵育15min。6)95℃，孵育3min之后放于冰上，得到cdna。实施例3荧光定量pcr检测胃印绒细胞癌组和对照组mirna的表达1)荧光定量pcr试剂盒采用天根公司的fastfireqpcrpremix(sybrgreen)。首先，融解fastfireqpcrpremix，模板，引物和无rna酶水，并将所有试剂在室温下溶解并彻底混匀。接下来配置荧光定量pcr体系。荧光定量pcr体系mirna表达检测每个样品设置3个平行反应，以snrnau6作为内参。上表中正向引物序列为：acactccagctgggccggttccagtcc(seqidno:2)。上表中反向引物序列为：tggtgtcgtggagtcg(seqidno:3)。同时以u6作为内参，正向引物：gcttcggcagcacatatactaaaat(seqidno:5)；反向引物：cgcttcacgaatttgcgtgtcat(seqidno:6)。荧光定量pcr程序：引物的扩增曲线见图1。2)统计学分析采用spss22.0软件进行分析。统计学分析方法组间采用t检验，p<0.05时有统计学意义。通过分析肺大细胞癌与正常对照组之间外周血mirna-6070的表达水平，发现肺大细胞癌中mirna-6070的表达明显高于正常组织，具体见附图2。上述临床实验表明，通过检测mirna-6070的表达水平可以有效的检测肺大细胞癌。序列表<110>苏州立豪生物科技有限公司<120>一种用于检测肺癌的试剂盒<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>44<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>1ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagctccaggg44<210>2<211>27<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>2acactccagctgggccggttccagtcc27<210>3<211>16<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>3tggtgtcgtggagtcg16<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>4cgcttcacgaatttgcgtgtcat23<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>5gcttcggcagcacatatactaaaat25<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>6cgcttcacgaatttgcgtgtcat23当前第1页12