本发明涉及环境科学、生态毒理学和污染生态学等研究领域，具体为一种高效提取多种蚯蚓体腔细胞的方法。
背景技术：
蚯蚓是环境科学、生态毒理学和污染生态学等领域的重要研究对象，其体腔细胞是在细胞、亚细胞和分子水平上深入开展研究的重要实验材料。目前，体腔细胞分离方法一般包括纤维针法、超声波刺激法、纤维针与超声波刺激结合法、电压刺激法、细胞提取液法。这些方法当初主要是针对赤子爱胜蚓建立起来的体腔细胞的分离方法，对提取其它种类蚯蚓的体腔细胞未必适用。而且，这些方法需要准备较多数量的蚯蚓才能够提取足量的体腔细胞，既增加了实验成本，又加重了工作负荷。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高效提取多种蚯蚓体腔细胞的方法，以解决上述背景技术中提出的更方便快捷获得更多数量的蚯蚓体腔细胞的问题。
为此，本发明提供如下技术方案：一种高效提取多种蚯蚓体腔细胞的方法，包含以下步骤：
s1、蚯蚓清肠后转移至烧杯中；
s2、向所述烧杯中添加适量体腔细胞提取液或0.85％生理盐水，以刚刚浸没蚯蚓为宜；
s3、将所述浸有蚯蚓的体腔细胞提取液或0.85％生理盐水接入电路，提供适宜强度的电流刺激；
s4、刺激一定时间后迅速收集步骤s3中所得细胞悬液，于室温(rt)和1000rpm条件下离心5min，弃上清；
s5、添加2ml10mmol/lpbs(磷酸盐缓冲液，ph7.0)，悬浮细胞后于rt和1000rpm条件下离心5min，弃上清；
s6、重复步骤s5一次；
s7、用1ml10mmol/lpbs重悬细胞沉淀，得到蚯蚓体腔细胞悬液。
优选的，所述步骤s1中蚯蚓的清肠方法为将蚯蚓置于1％蔗糖溶液润湿的滤纸上，避光清肠24h。
优选的，所述步骤s2中体腔细胞提取液配方为：5％乙醇，0.85％生理盐水，2.5mg/mlna2edta和10mg/ml愈创木酚甘油醚，ph6.5～8.5(其中ph7.3最佳)。
优选的，所述步骤s3中电路包括：直流电源、滑动变阻器、安培表、电极、电线和开关。
优选的，所述步骤s3中蚯蚓为赤子爱胜蚓时，体腔细胞提取液与2v、50ma电流联合刺激蚯蚓30-60s；所述步骤s3中蚯蚓为威廉腔环蚓时，体腔细胞提取液与2v、100ma电流联合刺激120-180s；所述步骤s3中蚯蚓为土蚯蚓时，体腔细胞提取液与2v、150ma电流联合刺激120-180s。
优选的，所述烧杯中的蚯蚓数量可以是一条或多条。
优选的，所述蚯蚓的种类包含但不限于赤子爱胜蚓、威廉腔环蚓和土蚯蚓。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：一种高效提取多种蚯蚓体腔细胞的方法，借助适宜强度的电场刺激，增强细胞提取液对蚯蚓的刺激作用，显著提高蚯蚓体腔细胞的分离数量，明显优于单一使用体腔细胞提取液的分离效果；该方法适用于多种类的蚯蚓，尤其适用于同时提取多条蚯蚓的体腔细胞，高效便捷，省时省力，可为环境科学、生态毒理学和污染生态学等研究领域提供充足的细胞实验材料。
附图说明
图1为本发明电路连接示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明实施例的一部分，而非全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性改进前提下所获得的所有其它实施例，均属于本发明保护的范畴。
实施例一
请参阅图1，一种高效提取多种蚯蚓体腔细胞的方法，按以下步骤操作：
1、选取大小一致、有环带的赤子爱胜蚓多条，置于1％蔗糖溶液润湿的滤纸上，避光清肠24h，用去离子水洗净表明污物，备用；
2、分别配制0.85％生理盐水，ph6.5、ph7.3和ph8.5的体腔细胞提取液(5％乙醇、0.85％生理盐水、2.5mg/mlna2edta和10mg/ml愈创木酚甘油醚)，备用；
3、非电刺激条件下赤子爱胜蚓体腔细胞的提取与细胞密度的统计分析
(1)向50ml烧杯中添加3ml0.85％生理盐水，将清肠洗净后的1条赤子爱胜蚓置入其中，浸没120s；
(2)收集烧杯中的溶液，在rt和1000rpm条件下离心5min，弃上清；
(3)添加2ml10mmol/lpbs(磷酸盐缓冲液，ph7.0)，悬浮细胞后于rt和1000rpm条件下离心5min，弃上清，并重复该步骤一次；
(4)用1ml10mmol/lpbs重悬细胞，应用细胞计数板统计其细胞密度；
(5)重复上述步骤(1)-(4)两次，计算三次细胞密度值的“平均值±标准差”；
(6)将步骤(1)中0.85％生理盐水分别更换成ph6.5、ph7.3和ph8.5的体腔细胞提取液，重复步骤(1)-(5)，分别统计这三种ph值条件下细胞密度值的“平均值±标准差”。
4、电刺激条件下赤子爱胜蚓体腔细胞的提取与细胞密度的统计分析
(1)向50ml烧杯中添加3ml0.85％生理盐水，放入1条清肠洗净后的赤子爱胜蚓；
(2)连接2v直流电源、滑动变阻器、安培表、电极、电线和开关，组成电路，将电极放入浸有赤子爱胜蚓的溶液中，闭合开关，在50、100、150ma电流强度下分别刺激30、60、120s(见表1)；
(3)收集烧杯中的溶液，在rt和1000rpm条件下离心5min，弃上清；
(4)添加2ml10mmol/lpbs(磷酸盐缓冲液，ph7.0)，悬浮细胞后于rt和1000rpm条件下离心5min，弃上清，并重复该步骤一次；
(5)用1ml10mmol/lpbs重悬细胞沉淀，应用细胞计数板统计其细胞密度；
(6)重复上述步骤(1)-(5)两次，计算三次细胞密度值的“平均值±标准差”；
(7)将步骤(1)中0.85％生理盐水分别更换成ph6.5、ph7.3和ph8.5的体腔细胞提取液(见表1)，重复步骤(1)-(6)，分别统计这三种ph值条件下细胞密度值的“平均值±标准差”。
通过该实施例可以看出，ph7.3的体腔细胞提取液与2v、50ma电流联合作用30-60s可作为提取赤子爱胜蚓体腔细胞的最佳条件。
实施例二
请参阅图1，一种高效提取多种蚯蚓体腔细胞的方法，按以下步骤操作：
1、选取大小一致、有环带的威廉腔环蚓多条，置于1％蔗糖溶液润湿的滤纸上，避光清肠24h，用去离子水洗净表明污物，备用；
2、分别制备ph7.3、ph8.5的体腔细胞提取液(5％乙醇、0.85％生理盐水、2.5mg/mlna2edta和10mg/ml愈创木酚甘油醚)，备用；
3、非电刺激条件下威廉腔环蚓体腔细胞的提取与细胞密度的统计分析
(1)向50ml塑料离心管中添加10ml0.85％生理盐水，将清肠洗净后的1条威廉腔环蚓置入其中，浸没120s；
(2)收集离心管中溶液，在rt和1000rpm条件下离心5min，弃上清；
(3)添加2ml10mmol/lpbs(磷酸盐缓冲液，ph7.0)，悬浮细胞后于rt和1000rpm条件下离心5min，弃上清，并重复该步骤一次；
(4)用1ml10mmol/lpbs重悬细胞，应用细胞计数板统计其细胞密度；
(5)重复上述步骤(1)-(4)两次，计算三次细胞密度值的“平均值±标准差”；
(6)将步骤(1)中0.85％生理盐水更换成ph7.3体腔细胞提取液，重复步骤(1)-(5)，计算其细胞密度值的“平均值±标准差”(表2)；
4、电刺激条件下威廉腔环蚓体腔细胞的分离提取与细胞密度的统计分析
(1)向50ml塑料离心管中添加10ml0.85％生理盐水，将1条清肠洗净后的威廉腔环蚓置入其中；
(2)连接2v直流电源、滑动变阻器、安培表、电极、电线和开关，组成电路，将电极置入溶液中，闭合开关，分别在50、100、150ma条件下刺激120s(见表2)；
(3)收集离心管中溶液，在rt和1000rpm条件下离心5min，弃上清；
(4)添加2ml10mmol/lpbs(磷酸盐缓冲液，ph7.0)，悬浮细胞后于rt和1000rpm条件下离心5min，弃上清，并重复该步骤一次；
(5)用1ml10mmol/lpbs重悬细胞，应用细胞计数板统计其细胞密度；
(6)重复上述步骤(1)-(5)两次，分别计算三种电流强度下细胞密度值的“平均值±标准差”；
(7)将步骤(1)中0.85％生理盐水更换成ph7.3的体腔细胞提取液(见表1)，在100ma条件下分别刺激30、60、120、180s，重复上述步骤(1)-(6)，分别计算四种刺激条件下细胞密度值的“平均值±标准差”；
(8)将步骤(1)中0.85％生理盐水更换成ph8.5的体腔细胞提取液(见表1)，分别在50、100、150ma条件下刺激120s，重复上述步骤(1)-(6)，分别计算三种电流强度刺激条件下细胞密度值的“平均值±标准差”；
由此可见，ph7.3的体腔细胞提取液与2v、100ma电流联合作用120-180s后收集的细胞数量比该提取液单一作用提高6倍以上，可作为提取威廉腔环蚓体腔细胞的最佳条件。
实施例三
请参阅图1，一种高效提取多种蚯蚓体腔细胞的方法，按以下步骤操作：
1、挑选多条大小一致、有环带的土蚯蚓，置于1％蔗糖溶液润湿的滤纸上，避光清肠24h，用去离子水洗净表明污物，备用；
2、分别制备0.85％生理盐水和ph7.3体腔细胞提取液(5％乙醇、0.85％生理盐水、2.5mg/mlna2edta和10mg/ml愈创木酚甘油醚)，备用；
3、电刺激条件下土蚯蚓体腔细胞的分离提取与细胞密度的统计分析：
(1)向50ml塑料离心管中添加10ml0.85％生理盐水，将1条清肠洗净后的土蚯蚓置入其中；
(2)连接2v直流电源、滑动变阻器、安培表、电极、电线和开关，组成电路，将电极置入溶液中，闭合开关，分别在50、100、150ma条件下刺激120s(见表3)；
(3)收集离心管中溶液，在rt和1000rpm条件下离心5min，弃上清；
(4)添加2ml10mmol/lpbs(磷酸盐缓冲液，ph7.0)，悬浮细胞后于rt和1000rpm条件下离心5min，弃上清，重复该步骤一次；
(5)用1ml10mmol/lpbs重悬细胞，应用细胞计数板统计其细胞密度；
(6)重复上述步骤(1)-(5)两次，分别计算三种电流刺激条件下细胞密度值的“平均值±标准差”；
(7)将步骤(1)中0.85％生理盐水更换成ph7.3的体腔细胞提取液(见表3)，在100ma和150ma下分别刺激60、120、180和240s，重复上述步骤(1)-(6)，计算100ma分别刺激60、120、180和240s，以及150ma分别刺激60、120、180和240s后细胞密度值的“平均值±标准差”。
由此可见，ph7.3的体腔细胞提取液与2v、150ma电流联合作用120-180s可作为提取土蚯蚓体腔细胞的首选条件。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。