本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球呈明显的上升趋势，从而严重危害着广大妇女的身心健康。尽管我国目前乳腺癌发病率低于西方国家，并不属于乳腺癌高发地区，但是随着工业化的发展，环境因素的影响以及人们生活方式的改变，乳腺癌的总发病率正在迅速增长。2008年统计结果显示，乳腺癌在城市地区女性肿瘤发病率中位居第一，且年新发乳腺癌病例增至20万，并有发病年龄年轻化趋势。
乳腺癌的发病机理尚不清楚，目前相关研究倾向于其发生发展是乳腺上皮细胞在多种致癌因素作用下发生基因突变和异常增生的结果。研究发现，在乳腺癌患者中约5％-10％的病例具有家族聚集性和遗传倾向性，因此乳腺癌可分为遗传性和散发性两大类。1994年由miki等成功克隆分离出第一个与家族性乳腺癌和卵巢癌相关的基因，即乳腺/卵巢肿瘤易感基因1(breastcancersusceptibilitygene1，brca1)，随后wooste等发现的位于人类染色体13q12-1上的基因，即乳腺/卵巢肿瘤易感基因2(breastcancersusceptibilitygene2，brca2)。brca1基因被认为是基因组的看护者，主要的生物学特性是参与损伤修复dna、调节细胞周期以及转录调控基因。该易感基因发生突变时，表现为编码蛋白功能降低或丧失，影响细胞分化，从而使细胞失去正常的分化与增殖作用，最终导致细胞恶变，发展为恶性肿瘤。brca2基因的编码蛋白十分庞大，在多个组织中有其表达，目前其生物学特性尚不清楚。有报道指出，brca2对细胞周期的调节有重要作用。
中国专利申请(cn101921831a)公开了一种检测brca基因突变的pcr反应试剂盒，所述试剂盒包括用于特异性扩增brca基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有brca1基因的第2外显子或brca1基因的第20外显子或brca2基因的第11外显子中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述brca1基因的第2外显子具有seqidno：1的连续核苷酸序列；所述brca1基因的第20外显子具有seqidno：2的连续核苷酸序列；brca2基因的第21外显子具有seqidno：3的连续核苷酸序列。其主要是利用hrm技术来进行brca1/2突变基因的检测，hrm技术是近年来国内外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的分析方法。基于高效稳健的pcr技术，hrm不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在pcr结束后直接对pcr产物进行溶解分析，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-snp、甲基化、hla配型等的分析。对于在血浆和血清中dna含量很低的情况下，使用该方法仍可以用该方法进行brca1/2基因突变的检测，突破了微量无法检测或检测效率低的障碍。
因此，获得更高质量的pcr产物是准确检测brca1/2突变基因所需要的。
技术实现要素：
为克服上述问题，本发明提供了一种癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒。本发明试剂盒成本低，操作简单；本发明试剂盒及其检测方法对使用仪器设备、dna模板要求低，而取得的扩增产物特异性高。本发明还提供了一种试剂盒的检测方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒，包括dna聚合酶，mgcl2，dntp，上游引物，下游引物，阳性对照，阴性对照，enhencebuffer，荧光染料及二次蒸馏水。
所述enhencebuffer由甘油20-30μg/ml，甲酰胺0.1-0.5ul/ml，3-二氧化噻吩烯0.5-1.5ul/ml和血清白蛋白100-150μg/ml组成。
所述上游引物如seqidno：1所示。
所述下游引物如seqidno：2所示。
优选地，所述enhencebuffer由甘油27.5μg/ml，甲酰胺0.45ul/ml，3-二氧化噻吩烯0.65ul/ml和血清白蛋白125μg/ml组成。
优选地，所述阴性对照为二次蒸馏水，阳性对照为含癌基因brca1和brca2dna样品。
优选地，所述荧光染料为resolight染料。
优选地，所述样品预处理中缓冲液由8mmtris-hcl，1.5mmedta-2na，20mm氯化铵和体积含量10％的甘油组成。
优选地，所述dna聚合酶、mgcl2、dntp、上游引物、下游引物、enhencebuffer及荧光染料组成的pcr体系及体系浓度组成为：dna聚合酶0.5μl，20mmmgcl23μl，l0mmol/ldntp0.5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，enhencebuffer2μl，10x荧光染料5μl。
所述癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
s1样品预处理，将收集到的样品进行脱脂处理后，加入5倍体积的缓冲液，上下颠倒进行混合后，静置15min后，5000g/min4℃离心15-20min钟，得样品i；
s2将上述样品i进行dna提取；
s3pcr扩增体系扩增；
s4pcr扩增产物检测；
s5根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的brca1和brca2基因进行突变位点检测。
优选地，所述s2中pcr扩增体系为：dna聚合酶0.5μl，20mmmgcl23μl，l0mmol/ldntp0.5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，dna模板样品100ng，enhencebuffer2μl，10x荧光染料5μl，用二次蒸馏水补足至50μl。
优选地，所述s2中pcr扩增程序包括：
(1)热启动：95℃变性2min，加入dna聚合酶；
(2)slowdownpcr：95℃变性30-50s，在温度为70-65℃时退火45s～55s，72℃延伸50s～100s，共15-20个循环，使退火温度降至59-55℃，每个循环降低1℃，每5个循环后暂停重新加入dna聚合酶；随后95℃变性45s～50s，在58-55℃退火30s～60s，72℃延伸50s～120s，共25-30个循环；
(3)延伸：72℃延伸5min；
(4)4℃保存。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下技术优势：
(1)本发明试剂盒所用的pcr体系，结合了热启动以及改进的slowdownpcr方法，适用于不同样本中brca1和brca2基因快速扩增。
(2)本发明试剂盒中所用添加剂能够有助于pcr反应进行，使brca1和brca2基因扩增特异性高。
(3)本发明试剂盒及其检测方法对使用仪器设备、dna模板要求低，适用于大规模实验和诊断。
具体实施方式：
下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1一种癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒
所述癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒，包括dna聚合酶，mgcl2，dntp，上游引物，下游引物，阳性对照，阴性对照，enhencebuffer，荧光染料及二次蒸馏水。
所述enhencebuffer由甘油27.5μg/ml，甲酰胺0.45μl/ml，3-二氧化噻吩烯0.65μl/ml和血清白蛋白125μg/ml组成。
所述上游引物如seqidno：1所示。
所述下游引物如seqidno：2所示。
所述阴性对照为二次蒸馏水，阳性对照为含癌基因brca1和brca2dna样品。
所述荧光染料为resolight染料。
所述样品预处理中缓冲液由8mmtris-hcl，1.5mmedta-2na，20mm氯化铵和体积含量10％的甘油组成。
所述dna聚合酶、mgcl2、dntp、上游引物、下游引物、enhencebuffer及荧光染料组成的pcr体系及体系浓度组成为：dna聚合酶0.5μl，20mmmgcl23μl，l0mmol/ldntp0.5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，enhencebuffer2μl，10x荧光染料5μl。
实施例2一种癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒
所述癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒，包括dna聚合酶，mgcl2，dntp，上游引物，下游引物，阳性对照，阴性对照，enhencebuffer，荧光染料及二次蒸馏水。
所述enhencebuffer由甘油20μg/ml，甲酰胺0.1μl/ml，3-二氧化噻吩烯0.5μl/ml和血清白蛋白100μg/ml组成。
所述上游、下游引物、荧光染料、样品预处理中缓冲液、阴性对照、阳性对照、pcr体系组成同实施例1类似。
实施例3一种癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒
所述癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒，包括dna聚合酶，mgcl2，dntp，上游引物，下游引物，阳性对照，阴性对照，enhencebuffer，荧光染料及二次蒸馏水。
所述enhencebuffer由甘油20μg/ml，甲酰胺0.5μl/ml，3-二氧化噻吩烯1.5μl/ml和血清白蛋白150μg/ml组成。
所述上游、下游引物、荧光染料、样品预处理中缓冲液、阴性对照、阳性对照、pcr体系组成同实施例1类似。
实验例4一种癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒的使用方法
所述癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
s1样品预处理，将收集到的样品进行脱脂处理后，加入5倍体积的缓冲液，上下颠倒进行混合后，静置15min后，5000g/min4℃离心15-20min钟，得样品i；
s2将上述样品i进行dna提取；
s3pcr扩增体系扩增；
s4pcr扩增产物检测；
s5根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的brca1和brca2基因进行突变位点检测。
所述s2中pcr扩增体系为：dna聚合酶0.5μl，20mmmgcl23μl，l0mmol/ldntp0.5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，dna模板样品100ng，enhencebuffer2μl，10x荧光染料5μl，用二次蒸馏水补足至50μl。
所述s2中pcr扩增程序包括：
(1)热启动：95℃变性2min，加入dna聚合酶；
(2)slowdownpcr：95℃变性30-50s，在温度为70-65℃时退火45s～55s，72℃延伸50s～100s，共15-20个循环，使退火温度降至59-55℃，每个循环降低1℃，每5个循环后暂停重新加入dna聚合酶；随后95℃变性45s～50s，在58-55℃退火30s～60s，72℃延伸50s～120s，共25-30个循环；
(3)延伸：72℃延伸5min；
(4)4℃保存。
对比例1一种癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒
与实施例1的区别在于，所述enhencebuffer中不含有3-二氧化噻吩烯，其它均与实施例1类似。
试验例1试剂盒最低检测限的测定
(1)试验材料：实施例1-3及对比例1试剂盒
(2)试验方法：将阳性标品按10倍稀释，分别稀释成浓度为1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、10拷贝/μl的稀释液。按实施例4使用方法分别检测实施例1-3及对比例1试剂盒最低检测限。
(3)试验结果：试验结果如表1所示。
表1不同试剂盒的最低检测限
由表1可知，本发明实施例1试剂盒最低检测限为1.0×102拷贝/μl，高于实施例2、3试剂盒，为最佳实施例。对比例1试剂盒最低检测限明显高于实施例1，说明其检测灵敏度明显低于实施例1试剂盒，由此可知，3-二氧化噻吩烯与本发明enhencebuffer中其它成分相互作用，能提高本发明试剂盒的灵敏度。
试验例2、用于检测癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒稳定性
1、加速破坏稳定性
分别对放置4℃、37℃保存10天的实施例1所述整套试剂盒按实施例4所述使用方法进行性能测试，测试试剂盒的性能指标。加速破坏稳定性结果如表2所示。
表2：试剂盒加速破坏稳定性结果
依据加速破坏试验推算试剂盒有效期的经验方法，37℃下加速破坏10天，相当于有效期1年半，可以满足试剂盒一年的有效期要求。由表2可以看出，本发明癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒在4℃、37℃保存10天后，试剂盒的灵敏度、准确性及精密性等均满足要求。
2、冻融稳定性
为模拟试剂盒在运输过程中，低温环境下试剂盒各组分反复冻融对试剂盒稳定性的影响，将实施例1整套试剂盒在-20℃的低温下冷冻过夜，然后在室温下复溶，然后再置于-20℃的低温下冷冻过夜，如此反复冻融5次后，利用实施例4所述使用方法进行稳定性检测，结果如表3所示。
表3：试剂盒冻融稳定性结果
由表3可以看出，本发明癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒经反复冻融5次后，试剂盒的灵敏度、准确性及精密性等均满足要求。这说明，本发明试剂盒具有较好的冻融稳定性。
3、模拟运输稳定性
为模拟试剂盒在运输过程中，车辆的颠簸以及高温环境对试剂盒稳定性的影响，将实施例1整套试剂盒固定在微量振荡器上，放置于37℃恒温箱振荡7天，利用实施例4所述使用方法进行稳定性检测，结果如表4所示。
表4：试剂盒模拟运输稳定性结果
由表4可以看出，本发明癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒放置于37℃恒温箱振荡7天后，试剂盒的灵敏度、准确性及精密性等均满足要求。
序列表
<110>广州华弘生物科技有限公司
<120>癌基因brca1和brca2的快速诊断试剂盒
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>51
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gctagaggaaacctttgaggaactattaatgaaataggttccagtgatgat51