生物催化制备(S)‑1‑N‑苯甲氧羰基‑3‑羟基哌啶的方法与流程

本发明涉及一种酶催化法不对称还原制备(s)-1-n-苯甲氧羰基-3-羟基哌啶（简称(s)-n-cbz-3-羟基哌啶）的方法。

背景技术：

(s)-n-cbz-3-羟基哌啶（如式（ii）所示）

（ii）

是一种具有重要应用价值的手性医药中间体。大量天然和非天然生物活性分子具有一个或多个哌啶环，还有许多活性药物成分（api）也含有该部分。作为重要的药物中间体，它被广泛的应用于镇痛、抗肿瘤等药物的合成，例如靶向抗癌新药依鲁替尼、抗充血性心力衰竭卡莫瑞林。

目前，众多制备(s)-n-cbz-3-羟基哌啶的方法（包括传统化学法和生物酶催化法）中，传统的化学方法已经报道了合成手性哌啶的几种方法，包括经典的非对映体拆分，不对称合成和不对称还原，然后进行多步转化。目前还原哌啶酮来制备羟基哌啶的常用还原剂为nabh4，并在有机溶剂中长时间反应得到外消3-羟基哌啶，进而通过化学拆分法在手性有机酸的作用下成盐之后游离、上保护基团来制备对映体纯的氮保护的3-羟基哌啶。传统化学法成本高收率低、合成步骤繁琐、反应条件苛刻、产生的三废较多，因此没能实现工业化应用。生物法因为具有反应效率高、立体选择性好、反应条件温和、低能耗、对环境友好等优点，受到越来越广泛的关注和越来越深入的研究。

相关文献（organicletters,2009,11(6),1245-1248）报道，在以磨碎的野生胡萝卜根作为生物催化剂的条件下，可以将n-叔丁氧羰基-3-哌啶酮还原制备(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。但此方法得到的产物有光学纯度不高等问题，不适用于工业放大生产。

专利cn105420307a中公开了一种以羰基还原酶为催化剂，以葡萄糖脱氢酶gdh、葡萄糖、氧化型辅酶nadp⁺为优选的辅酶体系，酶催化转化n-叔丁氧羰基-3-哌啶酮制备(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法。该方法转化率高，产物的对映体过量值可达99.5%。

专利cn105274160a中公开了一种以醇脱氢酶为催化剂，在nadh为辅酶体系的情况下，将n-叔丁氧羰基-3-哌啶酮不对称还原制备(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。最终对底物的转化率可达99.3%，产物的对映体过量值为100%。采用酶催化方法不对称还原n-叔丁氧羰基-3-哌啶酮反应操作简单易行、绿色环保，具有良好的应用价值。

专利cn106520856a中公开了一种利用来源于细长聚球藻的酮还原酶催化n-叔丁氧羰基-3-哌啶酮不对称还原制备(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。该发明选取nadp为辅酶体系，其中酮还原酶由基因工程菌发酵所得。该方法转化率高，产物的对映体过量值可达99.5%，具有重要的工业应用价值。

专利cn103571908a中，选取了市场上可购得的酮还原酶kred198将外消旋的n-叔丁氧羰基-3-哌啶酮还原为手性(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。其反应条件温和，但是存在价格高和后处理繁琐等问题。具体合成路线如下所示：

苯甲氧羰基和叔丁氧羰基都是常用的氨基保护基团，而目前文献所报道的利用酶催化的方法制备单一构型的羟基哌啶均以叔丁氧羰基作为保护基团。研究表明（chin.j.org.chem.2011,31,908–911），相比于叔丁氧羰基，苯甲氧羰基在弱酸性条件下更稳定。因此，以苯甲氧羰基作为氨基保护基团，通过一种新型酶催化技术实现高效生产(s)-n-cbz-3-羟基哌啶具有重要意义。

此外，目前关于(s)-n-cbz-3-羟基哌啶的生物制备方法仍没有相关专利报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高产率并且高效的(s)-n-cbz-3-羟基哌啶的制备方法，主要解决现有制备方法均以叔丁氧羰基作为保护基团在弱酸性条件下稳定性较差的技术问题。旨在通过一种新型酶催化技术，实现n-cbz-3-哌啶酮的还原，从而实现大规模制备对映体纯的(s)-n-cbz-3-羟基哌啶的目的。

本发明的技术方案：一种(s)-n-cbz-3-羟基哌啶的制备方法，在以异丙醇或/和葡萄糖作为氢源，醇脱氢酶作为辅酶的条件下，通过酶催化转化n-cbz-3-哌啶酮直接制备式ii的(s)-n-cbz-3-羟基哌啶。反应式如下：

在本发明的制备方法中，所述酶是酮还原酶、醛酮还原酶、羰基还原酶或醇脱氢酶中的一种。其中优选的酶为采购自美国药企codexis,inc.公司的酮还原酶kred-p3-g09、kred-p3-h02、kred-p3-h12或kred-nadh-101中的一种。

所述的辅酶为选自nad、nadh、nadp或nadph的任意一种或它们的组合，其中优选为nadp+nad的组合。

进一步，氢源选自异丙醇或/和葡萄糖再加上葡萄糖脱氢酶。

在本发明的制备方法中，还包括以常规方法分离出产物式（ii）所述的对映体。常规分离方法包括有机溶剂进行萃取、离子交换或层析等。其中，优选使用溶剂萃取法分离未反应的所述式（ii）的对映体。

在本发明的制备方法中，所述反应在ph范围为7~9的条件下进行。当ph小于7时，酶的催化活力可能显著降低。当ph大于9时，酶活亦有可能降低。优选的反应ph为7.0。通过向反应溶剂中加入缓冲液进行ph控制。常用的缓冲液包括但不限于kh2po4-k2hpo4或nah2po4-na2hpo4缓冲液。

在本发明的制备方法中，所述反应在温度为15~60℃的条件下进行。当温度低于15℃时，反应速度较慢。但温度高于60℃时，酶会不可逆失活。出于保证反应稳定、高效进行的目的，优选的反应温度为25℃。

在本发明的制备方法中，还包括分离出羟基产物(s)-n-cbz-3-羟基哌啶的步骤。

本发明的有益效果是：以本发明的方法制备的(s)-n-cbz-3-羟基哌啶（ii），对映体过量值不低于99%，纯度不低于99%。苯甲氧羰基和叔丁氧羰基都是常用的氨基保护基团，而目前文献所报道的利用酶催化的方法制备单一构型的羟基哌啶主要以叔丁氧羰基作为保护基团。研究表明（chin.j.org.chem.2011,31,908–911），相比于叔丁氧羰基，苯甲氧羰基在弱酸性条件下更稳定。因此，以苯甲氧羰基作为氨基保护基团，通过一种新型酶催化技术生产(s)-n-cbz-3-羟基哌啶具有重要意义。此外，目前关于(s)-n-cbz-3-羟基哌啶的生物制备方法中所采用的酶都需要通过基因改造进行大量的分子生物学操作，不适用于大规模工业化生产。而本发明使用可大量获得的商业化酶作为原料的方法实现高效大规模商业化生产(s)-n-cbz-3-羟基哌啶具有重要意义。

附图说明

图1是n-cbz-3-羟基哌啶的外消旋物的高效液相色谱法图谱。左侧的峰为s构型，右侧的峰为r构型。

图2是按照本发明实施例4的方法转化后的n-cbz-3-羟基哌啶的手性高效液相色谱法图谱。图中唯一的峰为目标化合物(s)-n-cbz-3-羟基哌啶。

图3是按照本发明实施例4的方法转化后的n-cbz-3-羟基哌啶的手性高效液相色谱质谱联用法图谱。图中质荷比m/z为236.1的峰为目标化合物(s)-n-cbz-3-羟基哌啶的分子离子峰。

图4是按照本发明实施例4的方法转化后的(s)-n-cbz-3-羟基哌啶的氢谱核磁图谱。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δppm1.38-1.63(m,2h),1.72–1.82(m,1h),1.88(brs,1h),3.03–3.32(m,2h),3.59(brs,1h),3.67–3.85(m,2h),5.12(m,2h),7.28-7.38(m,5h)。其中化学位移在1.25的为异丙醇的峰，5.29的为溶剂二氯甲烷的峰。

具体实施方式

本发明所述的反应方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用酮还原酶，催化还原n-cbz-3-哌啶酮。其中酮还原酶的添加量为0.002~10g酮还原酶/g底物（优选范围为0.02~1g酮还原酶/g底物）。选取2~20g葡萄糖/g底物或/和2~20g异丙醇/g底物作为氢源及进一步再添加0.001~0.05g葡萄糖脱氢酶（gdh）/g底物作为氢源，0.001~0.05g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nadp）/g底物和0.001~0.05g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nad）/g底物作为辅酶。

反应温度为15~60℃，优选为25℃。

所用反应介质为纯水或含有磷酸盐浓度在0.1~2mmol/l（优选为0.2mol/l）、ph范围为7~9（优选为ph=7.0）的kh2po4-k2hpo4或nah2po4-na2hpo4缓冲液，也可以是纯水或上述缓冲液与水不混溶的有机溶剂（如n,n-二甲基甲酰胺或二甲亚砜等）组成的两相体系。

(2)反应结束后，使用二氯甲烷或甲基叔丁基醚等有机溶剂萃取，萃取结束后，萃取混合物经离心机或过滤器处理，分层后，取有机层，即为粗产品的溶液。

(3)将粗产品的溶液用饱和食盐水洗涤，收集有机相后用无水硫酸钠干燥，过滤后可以直接在不高于45℃的条件下减压浓缩干，最终得到淡黄色油状物至白色粉末，即为对映体过量值不低于99%、纯度不低于99%的产品(s)-1-n-cbz-3-羟基哌啶。

本发明所使用试剂和原料均市售可得。

以下根据实施例，并且结合附图，详细描述本发明。从下文的详细描述中，本发明的上述方面和本发明的其他方面将是明显的。下列实施例仅试图阐明本发明，而对本发明保护范围不起任何限定作用。下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1

在50ml玻璃夹套反应瓶中，加入20ml水，0.212gkh2po4和0.557gk2hpo4，搅拌直至固体溶清；加入氢氧化钾调节ph值到7.0；向反应液中加入1g葡萄糖、0.05g酮还原酶冻干粉（采购自美国药企codexis,inc.公司的kred-p3-h02），0.01gnadp、0.01gnad和0.05ggdh，搅拌后加入1gn-cbz-3-哌啶酮；调整并控制反应液温度25℃，连续搅拌24小时；

用20ml二氯甲烷萃取反应液，收集有机相，加入少量无水硫酸钠除水后过滤，在30℃减压蒸馏浓缩。所得黄色粘稠液体称重得0.96g，粗收率为95.05%。所得液体即产品(s)-n-cbz-3-羟基哌啶，经高效液相色谱法分析，对映体过量值95.11%。分析条件：岛津lc-20a液相色谱仪和紫外检测器，chirapakia（250×4.6mm，5μm）手性色谱柱，流动相：正己烷-乙醇（体积比90:10）。30℃1ml/min下平衡，检测波长218nm。

实施例2

在50ml玻璃夹套反应瓶中，加入20ml水，0.212gkh2po4和0.557gk2hpo4，搅拌直至固体溶清；加入氢氧化钾调节ph值到7.0；向反应液中加入1g异丙醇，0.05g酮还原酶冻干粉（采购自美国药企codexis,inc.公司的kred-p3-h02），0.01gnadp和0.01gnad，搅拌后加入1gn-cbz-3-哌啶酮；调整并控制反应液温度25℃，连续搅拌24小时；

后处理条件同实施例1。所得黄色粘稠液体称重得0.93g，粗收率为92.08%。所得液体即产品(s)-n-cbz-3-羟基哌啶，经高效液相色谱法分析，对映体过量值94.22%。分析条件同实施例1。

实施例3

在50ml玻璃夹套反应瓶中，加入20ml水，0.212gkh2po4和0.557gk2hpo4，搅拌直至固体溶清；加入氢氧化钾调节ph值到7.0；向反应液中加入1g葡萄糖、1g异丙醇，0.05g酮还原酶冻干粉（采购自美国药企codexis,inc.公司的kred-p3-h02），0.01gnadp、0.01gnad和0.05ggdh，搅拌后加入1gn-cbz-3-哌啶酮；调整并控制反应液温度25℃，连续搅拌24小时；

后处理条件同实施例1。所得黄色粘稠液体称重得0.98g，粗收率为97.03%。所得液体即产品(s)-n-cbz-3-羟基哌啶，经高效液相色谱法分析，对映体过量值99.52%。分析条件同实施例1。

实施例4

在50ml玻璃夹套反应瓶中，加入20ml水，0.212gkh2po4和0.557gk2hpo4，搅拌直至固体溶清；加入氢氧化钾调节ph值到7.0；向反应液中加入1g葡萄糖、1g异丙醇，0.05g酮还原酶冻干粉（采购自美国药企codexis,inc.公司的kred-p3-h02），0.01gnadp、0.01gnad和0.05ggdh，搅拌后加入1gn-cbz-3-哌啶酮；调整并控制反应液温度25℃，连续搅拌24小时；

用20ml二氯甲烷萃取反应液，收集有机相。所得有机相用饱和氯化钠溶液洗去异丙醇后，加入少量无水硫酸钠除水后过滤，在30℃减压蒸馏浓缩。所得黄色粘稠液体称重得0.99g，粗收率为98.02%。所得液体即产品(s)-n-cbz-3-羟基哌啶，经高效液相色谱法分析，对映体过量值99.68%。分析条件同实施例1。产品液相色谱法图谱见图2，产品液相色谱质谱联用法图谱见图3，产品的核磁图谱见图4。

实施例5

在50ml玻璃夹套反应瓶中，加入20ml水，0.212gkh2po4和0.557gk2hpo4，搅拌直至固体溶清；加入氢氧化钾调节ph值到7.0；向反应液中加入1g葡萄糖、1g异丙醇，0.05g酮还原酶冻干粉（采购自美国药企codexis,inc.公司的kred-p3-h02），0.01gnadp、0.01gnad和0.05ggdh，搅拌后加入1gn-cbz-3-哌啶酮；调整并控制反应液温度37℃，连续搅拌24小时；

用20ml二氯甲烷萃取反应液，收集有机相。所得有机相用饱和氯化钠溶液洗去异丙醇后，加入少量无水硫酸钠除水后过滤，在30℃减压蒸馏浓缩。所得黄色粘稠液体称重得0.98g，粗收率为97.03%。所得液体即产品(s)-n-cbz-3-羟基哌啶，经高效液相色谱法分析，对映体过量值99.12%。分析条件同实施例1。

实施例6

在50ml玻璃夹套反应瓶中，加入20ml水，0.212gkh2po4和0.557gk2hpo4，搅拌直至固体溶清；加入氢氧化钾调节ph值到8.0；向反应液中加入1g葡萄糖、1g异丙醇，0.05g酮还原酶冻干粉（采购自美国药企codexis,inc.公司的kred-p3-h02），0.01gnadp、0.01gnad和0.05ggdh，搅拌后加入1gn-cbz-3-哌啶酮；调整并控制反应液温度25℃，连续搅拌24小时；

用20ml二氯甲烷萃取反应液，收集有机相。所得有机相用饱和氯化钠溶液洗去异丙醇后，加入少量无水硫酸钠除水后过滤，在30℃减压蒸馏浓缩。所得黄色粘稠液体称重得0.98g，粗收率为97.03%。所得液体即产品(s)-n-cbz-3-羟基哌啶，经高效液相色谱法分析，对映体过量值97.92%。分析条件同实施例1。

实施例7

在50ml玻璃夹套反应瓶中，加入20ml水，0.212gkh2po4和0.557gk2hpo4，搅拌直至固体溶清；加入氢氧化钾调节ph值到7.0；向反应液中加入1g葡萄糖、1g异丙醇，0.05g酮还原酶冻干粉（分别采购自美国药企codexis,inc.公司的kred-p3-g09、kred-p3-h12和kred-nadh-101），0.01gnadp、0.01gnad和0.05ggdh，搅拌后加入1gn-cbz-3-哌啶酮；调整并控制反应液温度25℃，连续搅拌24小时；

用20ml二氯甲烷萃取反应液，收集有机相。所得有机相用饱和氯化钠溶液洗去异丙醇后，加入少量无水硫酸钠除水后过滤，在30℃减压蒸馏浓缩。所得黄色粘稠液体即产品(s)-n-cbz-3-羟基哌啶，经高效液相色谱法分析，对映体过量值分别为98.92%、99.14%和99.01%。分析条件同实施例1。

实施例8

在1l玻璃夹套反应瓶中，加入400ml水，10.6gkh2po4和27.8gk2hpo4，搅拌直至固体溶清；搅拌直至固体溶清；加入氢氧化钾调节ph值到7.0；向反应液中加入30g葡萄糖、30g异丙醇，2.5g酮还原酶冻干粉（采购自美国药企codexis,inc.公司的kred-p3-h02），0.5gnadp、0.5gnad和2.5ggdh，搅拌均匀后加入50gn-cbz-3-哌啶酮；调整并控制反应液温度25℃，连续搅拌24小时；

后处理条件同实施例4。所得黄色粘稠液体称重得47.92g，粗收率为94.90%。所得液体即产品(s)-n-cbz-3-羟基哌啶，经高效液相色谱法分析，对映体过量值99.79%。分析条件同实施例1。

本领域的技术人员应当明了，尽管为了举例说明的目的，本文描述了本发明的具体实施方式，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明的具体实施方式和实施例不应当视为限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的所有文献均完整地并入本文作为参考。