本发明属于分子生物技术领域，尤其是涉及一种鉴别阿拉伯鱚与印度鱚的分子标记引物及方法。
背景技术：
阿拉伯鱚隶属于鲈形目、鲈亚目、鱚科、鱚属，外部形态与印度鱚相似：第一背鳍具xii-xiii硬棘，臀鳍具ii硬棘及22-24软条，脊椎骨数38-40。阿拉伯鱚各鳍透明，第一及第二背鳍淡黄色，密布黑色小点；腹鳍和臀鳍黄白色；尾叉浅，近截形；尾鳍深褐色至深灰色。阿拉伯鱚同印度鱚一样，皆为巴基斯坦近海重要的经济鱼种，分布区重叠。由于二者形态非常相似，仅凭借形态特征很难将两者区分。因此寻找区分阿拉伯鱚和印度鱚的可靠标准，从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个迫不及待的问题。这将有助于解决种质混杂等问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供技术支撑。
技术实现要素：
本发明的另一目的在于提供一种准确高效地鉴别阿拉伯鱚与印度鱚的方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种鉴别阿拉伯鱚与印度鱚的方法，将提取所得dna序列与分子标记seqidno.3和seqidno.4比对；分子标记seqidno.3为：caggcatggtgggcaccgccctgagcttgctgatccgagcagaacttagccaacccggcgctctacttggagacgatcaaatttacaacgtcattgttacggcacacgcctttgtaataattttctttatagtaataccaattctaattggaggctttgggaactgactagttccgcttatgatcggagcccctgacatggcattccctcgaatgaataacatgagcttctgactcctgcccccttctttccttctcctctt；分子标记seqidno.4为：caggcatagtgggcacggccctaagcctgctaatccgagcagaactcagccaacccggcgctctgcttggtgatgaccagatctataatgttatcgttactgcacatgcctttgtaatgattttctttatagtaataccaattttaatcggtggcttcggaaactgattagttccgctaatgatcggggcgcccgatatggcattcccccggataaataatatgagcttctggcttttacccccttctttcctactcctctt。两个分子标记序列存在39个碱基的差异，表现为6个颠换，33个转换，特征明显，且可重复性强，能够准确高效低鉴别阿拉伯鱚与印度鱚。
作为优选，分子标记seqidno.3和seqidno.4的获取方法为：用用标准酚-氯仿法提取阿拉伯鱚基因组总dna和印度鱚基因组总dna，以总dna为模板，以引物进行pcr扩增，扩增反应过程为：将2.5μl10×buffer、2μldntps、0.15ulrtaq酶、1μl上游引物、1μl下游引物、1μl模板dna混合，再加入17.5μl灭菌水，将混合物在94℃预变性5min，然后94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞，对扩增结果进行纯化、测序。该条件下，靶序列变性彻底，其不影响rtaq酶的活性，引物延伸完全，能够达到有效的扩增量，且非特异性扩增少，所得的分子标记序列稳定一致。
作为优选，分子标记的获取过程中，上游引物序列为：5’-tttagtattcggagcctgag-3’(seqidno.1)；下游引物序列为：5’-cctcaacacctgatgaggcc-3’(seqidno.2)。上下游引物长度适当，与模板的序列紧密互补，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低。
作为优选，dna提取过程为：用用用标准酚-氯仿法提取阿拉伯鱚基因组总dna和印度鱚基因组总dna，以总dna为模板，以引物进行pcr扩增，对扩增结果进行纯化、测序；pcr扩增反应过程与上下游引物序列同上。依赖于酶促反应，将待扩增的dna片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性—低温退火—引物延伸”三步反应的多次循环，使dna片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。
一种鉴别阿拉伯鱚与印度鱚的分子标记引物，其特征在于：所述上游引物序列为：5’-tttagtattcggagcctgag-3’(seqidno.1)；下游引物序列为：5’-cctcaacacctgatgaggcc-3’(seqidno.2)。上下游引物长度适当，与模板的序列紧密互补，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过比对扩增序列与分子标记来鉴别鉴别阿拉伯鱚和印度鱚，该分子标记序列长度为262bp，存在39个碱基的差异，表现为6个颠换，33个转换，特征明显，能够准确高效低鉴别阿拉伯鱚与印度鱚；所用的上下游引物长度适当，与模板的序列紧密互补，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低。所用引物自身不存在互补序列，自身难以形成发夹结构，与模板的序列能够紧密互补，且延伸温度小于74℃，有利于扩增反应的进行。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明：
实施例1：
一种准确高效地鉴别阿拉伯鱚与印度鱚的方法，包括以下步骤：
1)分子标记的获取：选用巴基斯坦沿岸的阿拉伯鱚与印度鱚，用标准酚-氯仿法提取阿拉伯鱚基因组总dna和印度鱚基因组总dna，以总dna为模板，采用引物进行pcr扩增，pcr扩增反应过程为：将2.5μl10×buffer、2μldntps、0.15ulrtaq酶、1μl上游引物、1μl下游引物、1μl模板dna混合，再加入17.5μl灭菌水，将混合物在94℃预变性5min，然后94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。
其中，上游引物序列为：5’-tttagtattcggagcctgag-3’；下游引物序列为：5’-cctcaacacctgatgaggcc-3’。
对扩增结果进行纯化，测序，分子序列长度为262bp，结果如下：
阿拉伯鱚的分子标记seqidno.3为：caggcatggtgggcaccgccctgagcttgctgatccgagcagaacttagccaacccggcgctctacttggagacgatcaaatttacaacgtcattgttacggcacacgcctttgtaataattttctttatagtaataccaattctaattggaggctttgggaactgactagttccgcttatgatcggagcccctgacatggcattccctcgaatgaataacatgagcttctgactcctgcccccttctttccttctcctctt。
印度鱚的分子标记seqidno.4为：caggcatagtgggcacggccctaagcctgctaatccgagcagaactcagccaacccggcgctctgcttggtgatgaccagatctataatgttatcgttactgcacatgcctttgtaatgattttctttatagtaataccaattttaatcggtggcttcggaaactgattagttccgctaatgatcggggcgcccgatatggcattcccccggataaataatatgagcttctggcttttacccccttctttcctactcctctt。
将两者进行比对，结果如下：
pkicaggcatagtgggcacggccctaagcctgctaatccgagcagaactcagc
pka*******g********c*****g***t****t**************g***
ruler.........10.........20.........30.........40.........50
pkicaacccggcgctctgcttggtgatgaccagatctataatgttatcgttac
pka**************a*****a**c**t**a**t**c**c**c**t*****
ruler.........60........70.........80.........90.........100
pkitgcacatgcctttgtaatgattttctttatagtaataccaattttaatcg
pkag*****c**********a*************************c****t*
ruler........110........120........130........140........150
pkigtggcttcggaaactgattagttccgctaatgatcggggcgcccgatatg
pka*a*****t**g******c**********t********a**c**t**c***
ruler........160........170.......180........190.........200
pkigcattcccccggataaataatatgagcttctggcttttacccccttcttt
pka********t**a**g*****c***********a**cc*g***********
ruler........210........220........230........240........250
pkicctactcctctt
pka***t********
ruler........260..262
其中“*”表示相同的碱基序列位点，pki：巴基斯坦沿海印度鱚样品；pka：巴基斯坦沿海阿拉伯鱚样品，可知，分子标记序列存在39个碱基的差异，表现为6个颠换，33个转换，特征明显，可以准确地鉴别阿拉伯鱚与印度鱚；
2)以步骤1）中的方法提取阿拉伯鱚和印度鱚的dna序列，与步骤1）中的分子标记比对。
实施例2：
一种准确高效地鉴别阿拉伯鱚与印度鱚的方法，包括以下步骤：
1)分子标记的获取：选用巴基斯坦沿岸的阿拉伯鱚与印度鱚，用标准酚-氯仿法提取阿拉伯鱚基因组总dna和印度鱚基因组总dna，以总dna为模板，采用引物进行pcr扩增，pcr扩增反应过程为：将2.5μl10×buffer、2μldntps、0.15ulrtaq酶、1μl上游引物、1μl下游引物、1μl模板dna混合，再加入17.5μl灭菌水、0.1μl安息香丁醚以及0.1μl3-甲基二苯甲酮，将混合物在94℃预变性5min，然后94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。所加入的安息香丁醚、3-甲基二苯甲酮与buffer具有协同作用，不仅提高了聚合酶的热稳定性，且降低了pcr扩增反应中每一循环的错配率，使pcr扩增产物具有较好的保真性，使扩增结果更加准确稳定。
其中，上游引物序列为：5’-tttagtattcggagcctgag-3’；下游引物序列为：5’-cctcaacacctgatgaggcc-3’。
对扩增结果进行纯化，测序，分子序列长度为262bp，结果如下：
阿拉伯鱚的分子标记seqidno.3为：caggcatggtgggcaccgccctgagcttgctgatccgagcagaacttagccaacccggcgctctacttggagacgatcaaatttacaacgtcattgttacggcacacgcctttgtaataattttctttatagtaataccaattctaattggaggctttgggaactgactagttccgcttatgatcggagcccctgacatggcattccctcgaatgaataacatgagcttctgactcctgcccccttctttccttctcctctt。
印度鱚的分子标记seqidno.4为：caggcatagtgggcacggccctaagcctgctaatccgagcagaactcagccaacccggcgctctgcttggtgatgaccagatctataatgttatcgttactgcacatgcctttgtaatgattttctttatagtaataccaattttaatcggtggcttcggaaactgattagttccgctaatgatcggggcgcccgatatggcattcccccggataaataatatgagcttctggcttttacccccttctttcctactcctctt。
将两者进行比对，结果如下：
pkicaggcatagtgggcacggccctaagcctgctaatccgagcagaactcagc
pka*******g********c*****g***t****t**************g***
ruler.........10.........20.........30.........40.........50
pkicaacccggcgctctgcttggtgatgaccagatctataatgttatcgttac
pka**************a*****a**c**t**a**t**c**c**c**t*****
ruler.........60........70.........80.........90.........100
pkitgcacatgcctttgtaatgattttctttatagtaataccaattttaatcg
pkag*****c**********a*************************c****t*
ruler........110........120........130........140........150
pkigtggcttcggaaactgattagttccgctaatgatcggggcgcccgatatg
pka*a*****t**g******c**********t********a**c**t**c***
ruler........160........170.......180........190.........200
pkigcattcccccggataaataatatgagcttctggcttttacccccttcttt
pka********t**a**g*****c***********a**cc*g***********
ruler........210........220........230........240........250
pkicctactcctctt
pka***t********
ruler........260..262
其中“*”表示相同的碱基序列位点，pki：巴基斯坦沿海印度鱚样品；pka：巴基斯坦沿海阿拉伯鱚样品，可知，分子标记序列存在39个碱基的差异，表现为6个颠换，33个转换，特征明显，可以准确地鉴别阿拉伯鱚与印度鱚；
2)以步骤1）中的方法提取阿拉伯鱚和印度鱚的dna序列，与步骤1）中的分子标记比对。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110>浙江海洋大学
<120>一种鉴别阿拉伯鱚与印度鱚的分子标记引物及方法
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工合成(saccharum)
<400>1
tttagtattcggagcctgag20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工合成(saccharum)
<400>2
cctcaacacctgatgaggcc20
<210>3
<211>262
<212>dna
<213>阿拉伯鱚(sillagoarabica)
<400>3
caggcatggtgggcaccgccctgagcttgctgatccgagcagaacttagccaacccggcg60
ctctacttggagacgatcaaatttacaacgtcattgttacggcacacgcctttgtaataa120
ttttctttatagtaataccaattctaattggaggctttgggaactgactagttccgctta180
tgatcggagcccctgacatggcattccctcgaatgaataacatgagcttctgactcctgc240
ccccttctttccttctcctctt262
<210>4
<211>262
<212>dna
<213>印度鱚(sillagoindica)
<400>4
caggcatagtgggcacggccctaagcctgctaatccgagcagaactcagccaacccggcg60
ctctgcttggtgatgaccagatctataatgttatcgttactgcacatgcctttgtaatga120
ttttctttatagtaataccaattttaatcggtggcttcggaaactgattagttccgctaa180
tgatcggggcgcccgatatggcattcccccggataaataatatgagcttctggcttttac240
ccccttctttcctactcctctt262