本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种牛胶原蛋白肽的分级提取工艺。
背景技术：
现行的胶原蛋白提取主要有水提法、碱提、酸提和酶解提取，各种方法均有其优缺点。水提法使将处理过的原料在热水中浸提，使胶原蛋白缓慢溶出，水温一般控制在60-70℃，其优点是胶原蛋白较纯、分子量比较均一、胶原蛋白结构完整，缺点是耗时较长且收率低，包括预处理在内的提取时间10-60天不等，蛋白收率在30％-60％之间，耗水量大。
碱提法使在碱性条件下，控制一定温度，使胶原蛋白溶出，较水提法快，时间缩短到1-3天，蛋白收率提高到50％-70％，缺点是胶原蛋白不纯，杂蛋白溶出较多，且氨基酸破坏严重，分子量不均一且灰分较高，环境污染。
酸法是在酸性条件下，控制一定温度，使胶原蛋溶出，提取时间介于水提和碱提之间，2-5天，胶原较纯，氨基酸破坏少，分子结构保留完整，缺点是提取周期较长，灰分高，环境污染。
酶法提取是控制一定的温度和ph，用蛋白酶酶解原料，经过除杂精滤提取胶原蛋白，周期短，1-24h结束，蛋白收率高，达到80％-90％，氨基酸破坏少，且环境友好，缺点是分子量分布广，成本高，杂蛋白较多。
技术实现要素：
针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种蛋白利用率较高、胶原蛋白肽品质较好、生产效率较高且对环境友好的牛胶原蛋白肽的分级提取工艺。
为实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：一种牛胶原蛋白肽的分级提取工艺，包括以下步骤：
对预处理后的原料在ph7-8、0-0.04mpa、100-105℃的条件下采用超声波进行一次提取，得到提取液；
对提取液进行固液分离，得到过滤液、滤渣；
对滤液降温后添加蛋白酶进行一次酶解，得到一次酶解液；
对一次酶解液灭酶、分离不溶物、除杂，得到一次精制液；
浓缩处理一次精制液，得到一次浓缩液；
将一次浓缩液杀菌、干燥，得到一次蛋白肽粉；
对滤渣加水后添加蛋白酶进行二次酶解，得到二次酶解液；
对二次酶解液灭酶、分离不溶物、除杂，得到二次精制液；
浓缩处理二次精制液，得到二次浓缩液；
将二次浓缩液杀菌、干燥，得到二次蛋白肽粉。
本发明所述的一次提取在ph7-8的弱碱性环境下进行，提高了提取效率，保证胶原蛋白的纯度和分子完整性，蛋白利用率较高；一次提取在0-0.04mpa的微高压环境下，配合100-105℃的操作温度，提高提取效率，保证胶原蛋白的纯度和分子完整性，同样蛋白利用率较高；将能够提高提取效率、保证胶原蛋白的纯度和分子完整性、蛋白利用率较高的弱碱环境、微高压环境结合，更加保证了提取效率的提高、胶原蛋白的纯度和分子完整性、蛋白的高利用率。结合超声波提取，提高了提取率(生产率)，节省了原料，提高了经济效益，溶剂用量少，节约了溶剂，且超声波提取是一个物理过程，在整个浸提过程中无化学反应发生，不影响大多数有效成分的生理活性，提取物有效成分含量高；分二级提取，一次提取的蛋白液(过滤液)继续用蛋白酶酶解，胶原蛋白纯度高，胶原蛋白肽品质较好，分子量均一；二次提取利用滤渣，继续用蛋白酶提取胶原蛋白肽，提高原料利用率，效率高；且无酸碱等化学试剂使用和排放，故对环境友好，不污染环境。
进一步地，所述预处理包括将原料去除油脂、杂质。
进一步地，所述一次提取包括以下步骤：
对预处理后的原料加水得到溶解液，加水的质量为预处理后的原料质量的1-3倍；
在ph7-8、0-0.04mpa、100-105℃的条件下采用超声波对溶解液进行一次提取，得到提取液，超声波功率为50-500w，一次提取时间为1-8h。
进一步地，一次提取时采用转速为10-30rpm的搅拌设备对溶解液进行搅拌。
进一步地，采用卧式螺旋离心机或板框过滤机对提取液进行固液分离，得到过滤液、滤渣。
进一步地，对滤液降温到45-65℃后添加蛋白酶进行一次酶解，得到一次酶解液，所述蛋白酶为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶或枯草芽孢杆菌中性蛋白酶或木瓜蛋白酶，添加的蛋白酶的质量为预处理后的原料质量的0.01-0.1％，一次酶解时间为1-4h，搅拌转速为30-60rpm。
进一步地，对一次酶解液在80-100℃、10-30min的灭酶条件下进行灭酶，然后经过过滤或离心分离不溶物，最后加入活性炭或活性白土或硅藻土进行除杂、澄清，得到一次精制液；
对二次酶解液在80-100℃、10-30min的灭酶条件下进行灭酶，然后经过过滤或离心分离不溶物，最后加入活性炭或活性白土或硅藻土进行除杂、澄清，得到二次精制液。
进一步地，一次浓缩液、二次浓缩液均包括浓度为20-50％的胶原蛋白肽。
进一步地，对滤渣加水，加水的质量为滤渣质量的1-3倍，加水后在45-65℃的环境中添加蛋白酶对滤渣进行二次酶解，得到二次酶解液，所述蛋白酶为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶或枯草芽孢杆菌中性蛋白酶或木瓜蛋白酶，添加的蛋白酶的质量为预处理后的原料质量的0.01-0.1％，二次酶解时间为1-4h，搅拌转速为30-60rpm。
进一步地，还包括对一次蛋白肽粉、二次蛋白肽粉分别进行金检、包装。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：本发明所述的一次提取在ph7-8的弱碱性环境下进行，提高了提取效率，保证胶原蛋白的纯度和分子完整性，蛋白利用率较高；一次提取在0-0.04mpa的微高压环境下，配合100-105℃的操作温度，提高提取效率，保证胶原蛋白的纯度和分子完整性，同样蛋白利用率较高；将能够提高提取效率、保证胶原蛋白的纯度和分子完整性、蛋白利用率较高的弱碱环境、微高压环境结合，更加保证了提取效率的提高、胶原蛋白的纯度和分子完整性、蛋白的高利用率。结合超声波提取，提高了提取率(生产率)，节省了原料，提高了经济效益，溶剂用量少，节约了溶剂，且超声波提取是一个物理过程，在整个浸提过程中无化学反应发生，不影响大多数有效成分的生理活性，提取物有效成分含量高；分二级提取，一次提取的蛋白液(过滤液)继续用蛋白酶酶解，胶原蛋白纯度高，胶原蛋白肽品质较好，分子量均一；二次提取利用滤渣，继续用蛋白酶提取胶原蛋白肽，提高原料利用率，效率高；且无酸碱等化学试剂使用和排放，故对环境友好，不污染环境。
具体实施方式
实施例一
本发明所述的一种牛胶原蛋白肽的分级提取工艺，包括以下步骤：
选取牛皮作为原料，将牛皮去除油脂和碎肉杂质。
对预处理后的牛皮进行一次提取，得到提取液；所述一次提取包括以下步骤：
对预处理后的原料加水得到溶解液，加水的质量为预处理后的原料质量的1倍；在ph7、0mpa、100℃的条件下采用超声波对溶解液进行一次提取，超声波功率为50w，一次提取时间为1h；一次提取时采用转速为10rpm的搅拌设备对溶解液进行搅拌。
采用卧式螺旋离心机对提取液进行固液分离，得到过滤液、滤渣。
对滤液降温到45℃后添加蛋白酶进行一次酶解，所述蛋白酶为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶，添加的蛋白酶的质量为预处理后的原料质量的0.01％，一次酶解时间为1h，搅拌转速为30rpm，得到一次酶解液。
对一次酶解液在80℃、10min的灭酶条件下进行灭酶，然后经过过滤分离不溶物，最后加入活性炭进行除杂、澄清，得到一次精制液。
浓缩处理一次精制液，得到胶原蛋白浓度为20％的一次浓缩液。
将一次浓缩液杀菌、干燥，得到一次蛋白肽粉。
对滤渣加水，加水的质量为滤渣质量的1倍，加水后在45℃的环境中添加蛋白酶对滤渣进行二次酶解，所述蛋白酶为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶或枯草芽孢杆菌中性蛋白酶或木瓜蛋白酶，添加的蛋白酶的质量为预处理后的原料质量的0.01％，二次酶解时间为1h，搅拌转速为30rpm，得到二次酶解液。
对二次酶解液在80℃、10min的灭酶条件下进行灭酶，然后经过过滤分离不溶物，最后加入活性炭或活性白土或硅藻土进行除杂、澄清，得到二次精制液。
浓缩处理二次精制液，得到胶原蛋白浓度为20％的二次浓缩液。
将二次浓缩液杀菌、干燥，得到二次蛋白肽粉。
对一次蛋白肽粉、二次蛋白肽粉分别进行金检、包装。
实施例二
本发明所述的一种牛胶原蛋白肽的分级提取工艺，包括以下步骤：
选取牛骨作为原料，将牛骨去除油脂和碎肉杂质。
对预处理后的牛骨进行一次提取，得到提取液；所述一次提取包括以下步骤：
对预处理后的原料加水得到溶解液，加水的质量为预处理后的原料质量的3倍；在ph8、0.04mpa、105℃的条件下采用超声波对溶解液进行一次提取，超声波功率为500w，一次提取时间为8h；一次提取时采用转速为30rpm的搅拌设备对溶解液进行搅拌。
采用板框过滤机对提取液进行固液分离，得到过滤液、滤渣。
对滤液降温到65℃后添加蛋白酶进行一次酶解，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶，添加的蛋白酶的质量为预处理后的原料质量的0.1％，一次酶解时间为4h，搅拌转速为60rpm，得到一次酶解液。
对一次酶解液在100℃、30min的灭酶条件下进行灭酶，然后经过离心分离不溶物，
最后加入硅藻土进行除杂、澄清，得到一次精制液。
浓缩处理一次精制液，得到胶原蛋白浓度为50％的一次浓缩液。
将一次浓缩液杀菌、干燥，得到一次蛋白肽粉。
对滤渣加水，加水的质量为滤渣质量的3倍，加水后在65℃的环境中添加蛋白酶对滤渣进行二次酶解，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶，添加的蛋白酶的质量为预处理后的原料质量的0.1％，二次酶解时间为4h，搅拌转速为60rpm，得到二次酶解液。
对二次酶解液在100℃、30min的灭酶条件下进行灭酶，然后经过离心分离不溶物，
最后加入硅藻土进行除杂、澄清，得到二次精制液。
浓缩处理二次精制液，得到胶原蛋白浓度为50％的二次浓缩液。
将二次浓缩液杀菌、干燥，得到二次蛋白肽粉。
对一次蛋白肽粉、二次蛋白肽粉分别进行金检、包装。
实施例三
本发明所述的一种牛胶原蛋白肽的分级提取工艺，包括以下步骤：
选取牛皮作为原料，将牛皮去除油脂和碎肉杂质。
对预处理后的牛皮进行一次提取，得到提取液；所述一次提取包括以下步骤：
对预处理后的原料加水得到溶解液，加水的质量为预处理后的原料质量的2倍；在ph7.5、0.02mpa、103℃的条件下采用超声波对溶解液进行一次提取，超声波功率为275w，一次提取时间为4.5h；一次提取时采用转速为20rpm的搅拌设备对溶解液进行搅拌。
采用卧式螺旋离心机对提取液进行固液分离，得到过滤液、滤渣。
对滤液降温到55℃后添加蛋白酶进行一次酶解，所述蛋白酶为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，添加的蛋白酶的质量为预处理后的原料质量的0.055％，一次酶解时间为2.5h，搅拌转速为45rpm，得到一次酶解液。
对一次酶解液在90℃、20min的灭酶条件下进行灭酶，然后经过过滤分离不溶物，最后加入活性白土进行除杂、澄清，得到一次精制液。
浓缩处理一次精制液，得到胶原蛋白浓度为35％的一次浓缩液。
将一次浓缩液杀菌、干燥，得到一次蛋白肽粉。
对滤渣加水，加水的质量为滤渣质量的2倍，加水后在55℃的环境中添加蛋白酶对滤渣进行二次酶解，所述蛋白酶为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，添加的蛋白酶的质量为预处理后的原料质量的0.055％，二次酶解时间为2.5h，搅拌转速为45rpm，得到二次酶解液。
对二次酶解液在90℃、20min的灭酶条件下进行灭酶，然后经过离心分离不溶物，最后加入活性白土进行除杂、澄清，得到二次精制液。
浓缩处理二次精制液，得到胶原蛋白浓度为35％的二次浓缩液。
将二次浓缩液杀菌、干燥，得到二次蛋白肽粉。
对一次蛋白肽粉、二次蛋白肽粉分别进行金检、包装。
本实施例中的原料，还可以是牛骨，处理方式与牛皮相同。
实施例四
本发明所述的一种牛胶原蛋白肽的分级提取工艺，包括以下步骤：
1、原料的预处理：将原料牛皮经过清水或碱水清洗干净，去除油脂和碎肉杂质，并切成1*1cm-3*3cm尺寸的牛皮块；
2、一次水提：将步骤1中预处理的牛皮块加水，加水比率为牛皮块重量的1-3倍，弱碱性(控制ph＝7-8)条件下采用微高压(0-0.04mpa)在100-105℃，辅助超声波提取胶原蛋白，超声波功率在50w-500w，提取时间为1-8h，得到提取液，提取过程中用框式搅拌，速度为10-30rpm；
3、过滤：将步骤2的提取液采用卧式螺旋离心机或板框过滤机分离固液，得到滤液和滤渣；
4、一次酶解：将滤液降温到45-65℃，添加枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶或枯草芽孢杆菌中性蛋白酶或木瓜蛋白酶，酶量为预处理后原料重的0.01％到0.1％，酶解时间为1-4h，搅拌速度为30-60rpm，获得一次酶解液；
5、精制：将一次酶解液灭酶，灭酶温度为80-100℃，时间为10-30min，经过过滤或离心分离不溶物，加入活性炭或活性白土或硅藻土得到一次精制液；
6、浓缩：一次精制液经过浓缩，使胶原蛋白肽浓度为20％-50％，得到一次浓缩液；
7、干燥：经过杀菌后干燥得到一次蛋白肽粉；
8、二次酶解：滤渣加水，水量为渣量的1-3倍，温度45-65℃，添加枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶或枯草芽孢杆菌中性蛋白酶或木瓜蛋白酶，酶量为预处理后原料重的0.01％到0.1％，酶解时间为1-4h，搅拌速度为30-60rpm，获得二次酶解液；
9、精制：将二次酶解液灭酶，灭酶温度为80-100℃，时间为10-30min，经过过滤或离心分离不溶物，加入活性炭或活性白土或硅藻土得到二次精制液；
10、浓缩：二次精制液经过浓缩，使胶原蛋白肽浓度为20％-50％，得到二次浓缩液；
11、干燥：经过杀菌后干燥得到二次蛋白肽粉；
12、一次蛋白肽粉和二次蛋白肽粉分别经过金检，包装。
本实施例中，原料也可为牛骨，牛骨经过清水或碱水清洗干净，去除油脂和碎肉杂质，牛骨粉碎成0.5*0.5cm-1*1cm大小的牛骨粒；一次水提中将步骤1中预处理的牛骨粒加水，加水比率为牛骨粒重量的1-3倍。
本发明所述的牛胶原蛋白肽的分级提取工艺，结合水提、碱提、超声波提取和酶解技术，先将预处理好的牛皮在弱碱性(控制ph＝7-8)条件下采用微高压(0-0.04mpa)辅助超声波提取胶原蛋白，料液滤出，继续用蛋白酶酶解，料渣直接用蛋白酶酶解。然后酶解液各自进行精滤、浓缩、干燥，具备以下有益效果：
1、蛋白利用率较高；
2、产品分级；
3、胶原蛋白肽品质提高；
4、生产效率提高；
5、环境友好。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。