检测猪链球菌的交叉等温扩增引物组、试剂盒及应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种检测猪链球菌的交叉等温扩增引物组、试剂盒及应用。

背景技术：

猪链球菌(streptococcussuis,ss)可引起猪的脑膜炎、关节炎、败血症、心内膜炎、多发性浆膜炎和支气管肺炎，发病猪的死亡率达80％。ss分为35个血清型，其中1、1/2、2、7、9、14型是其主要致病性血清型。ss是一种重要的人兽共患病原菌，人感染ss可导致败血症、脑膜炎、心内膜炎甚至死亡，在公共卫生方面引起了人们的极大关注。

目前，常用的ss检测方法主要包括细菌分离、血清学方法和pcr技术，其中细菌分离和血清学方法不仅费时费力，而且结果不易判定。pcr技术虽然能够实现ss的相对快速检测，但该技术在扩增过程中需要昂贵的热循环功能仪与熟练的操作人员，妨碍该技术在兽医基层进行广泛的应用与推广。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种检测猪链球菌的交叉等温扩增引物组、试剂盒及应用，该试剂盒具有高特异性、高敏感性、可视化、操作方法简单的特点。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种检测猪链球菌的交叉等温扩增引物组，由外部引物f3、外部引物b3、探针引物b2、探针引物b1、交叉引物cpf组成；

外部引物f3的核苷酸序列如seqidno.1所示；

外部引物b3的核苷酸序列如seqidno.2所示；

交叉引物cpf的核苷酸序列如seqidno.3所示；

探针引物b2的核苷酸序列如seqidno.4所示；

探针引物b1的核苷酸序列如seqidno.5所示。

进一步地，所述探针引物b2的5’端标记生物素biotin；探针引物b1的5’端标记fitc。

本发明还公开了一种检测猪链球菌的交叉等温扩增试剂盒，包括上述的检测猪链球菌的交叉等温扩增引物组和核酸试纸条。

进一步地，所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。

进一步地，该试剂盒还包括全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置，该全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到。

进一步地，该试剂盒包括10×反应缓冲液、浓度为8u/μl的bstwarmstart^tmdna聚合酶、浓度为10.0mmol/l的dntp混合物溶液、浓度为10mol/l的betaine溶液、浓度为0.1g/ml的pullulan、浓度为100mmol/l的mgso4溶液、浓度为10μmol/l的交叉引物cpf、浓度为10μmol/l的探针引物b2、浓度为10μmol/l的探针引物b1、浓度为10μmol/l的外部引物f3、浓度为10μmol/l的外部引物b3。

本发明还公开了一种上述的引物组或试剂盒在检测待测样品是否感染猪链球菌中的应用。

本发明还公开了一种检测待测样品是否感染猪链球菌的方法，包括以下步骤：

1)用上述的引物组或试剂盒对待测样品进行交叉等温扩增，得到扩增产物；

2)反应：将得到的产物用核酸检测试纸条检测，5min后观察结果；

3)结果判读：直接肉眼判读；

a)阴性：仅在质控区出现一条条带，在检测区内无条带出现，证明待测样品没有猪链球菌感染；

b)阳性：出现两条条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内，证明待测样品为猪链球菌感染；

c)无效：质控区和检测区内均无条带出现，表明核酸试纸条失效。

进一步地，步骤1)中所述的恒温反应的时间为60min；恒温反应的温度为62℃。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)由于交叉引物扩增检测方法成本低廉，利用bstwarmstart^tmdna聚合酶在62℃实现等温扩增，不需要复杂且昂贵的pcr仪，因此本发明提供的试剂盒使用成本低。

2)本发明所提供的试剂盒反应迅速，可以在50min内完成反应。

3)本发明提供的试剂盒得到的反应结果直观准确，无需进行复杂操作。分别对引物与特异性亲和探针进行生物标记，然后再用全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置对反应产物进行检测，既可以准确对结果进行直观、快速的判读，又可以防止污染。

4)本发明提供的试剂盒特异性好，对血清1型猪链球菌、血清2型猪链球菌、血清7型猪链球菌、血清9型猪链球菌都呈阳性反应，对血清5型副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌259株、巴氏杆菌1657株都呈阴性反应；敏度性高，最低可以检测到44cfu的猪链球菌基因组dna模板，与pcr方法敏感性相同。

5)本发明所述的猪链球菌交叉等温扩增试剂盒可快速、敏感的检测猪链球菌，无需昂贵仪器，只需一个恒温水浴锅即可完成反应。该试剂盒操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明本发明不同温度下反应的电泳亮度关系图，泳道m为dnamarkerdl2000，泳道1～10依次对应反应温度为57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃的反应产物；

图2是本发明本发明提供的交叉等温扩增试剂盒特异性实验中的结果图，其中：

ctrl为空白对照；1是以血清1型猪链球菌基因组dna为模板的检测结果；2是以血清2型猪链球菌基因组dna为模板的检测结果；3是以血清7型猪链球菌基因组dna为模板的检测结果；4是以血清9型猪链球菌基因组dna为模板的检测结果；5是以血清5型副猪嗜血杆菌基因组dna为模板的检测结果；6是以猪胸膜肺炎放线杆菌259株基因组dna为模板的检测结果；7是以巴氏杆菌1657株基因组dna为模板的检测结果；8为空白对照；

图3是本发明提供的交叉等温扩增试剂盒敏感性试验结果图；其中，1为4.4cfu的血清2型猪链球菌基因组dna；2为4.4cfu的血清2型猪链球菌基因组dna；3为0.44cfu的血清2型猪链球菌基因组dna；4为0.044cfu的血清2型猪链球菌基因组dna；5为0.0044cfu的血清2型猪链球菌基因组dna，6为空白对照；

图4是本发明利用pcr方法得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳得到的图；其中，泳道m为2000bpdnamarker，1为44cfu的血清2型猪链球菌基因组dna；2为4.4cfu的血清2型猪链球菌基因组dna；3为0.44cfu的血清2型猪链球菌基因组dna；4为0.044cfu的血清2型猪链球菌基因组dna；5为0.0044cfu的血清2型猪链球菌基因组dna；6为空白对照。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明的研究思路是：针对pcr技术在诊断应用中不足，有关恒温扩增技术的研究不断深入，为快速诊断方法的形成带来了新的契机。本发明技术研制了猪链球菌的交叉等温扩增检测方法，并将该方法与核酸试纸条检测相结合，使得猪链球菌的检测过程更加方便、快速。本发明技术提供的检测试剂盒在整个使用过程不需要复杂仪器，核酸样品制备与扩增程序简便，容易在兽医基层建立与开展。另外，本发明技术提供的检测试剂盒在样品扩增与结果判定过程中可保证环境的密闭，有效杜绝了因核酸污染造成的假阳性的发生。

实施例中所涉及的材料：

a)引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；bstwarmstart^tmdna聚合酶购自newengland公司；mgso4(100mm)购自newengland公司；甜菜碱(betaine)购自sigma公司；普鲁兰多糖(pullulan)够自上海生工生物工程技术服务有限公司，全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置购自杭州优思达生物技术有限公司(货号：0001-03)。

b)以下生物材料均已在文献“副猪嗜血杆菌和猪链球菌双重pcr方法的建立与应用.中国兽医学报,2009(9):第1155-1157页.”中公开：血清1、2、7、9型猪链球菌，血清5型副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌。

实施例1交叉引物恒温扩增引物的设计和合成

一、引物设计

根据引物设计原则，针对猪链球菌recn基因的保守区域序列，应用priemer5软件进行引物设计，按照我们的经验保证引物的gc含量在40％～60％之间，各引物tm值在50～60℃左右。接着我们应用larsergene7.0生物软件的primerselect工具对引物进行初步筛选，筛选原则为保证各引物对之间dg值较小。引物序列如表1所示(此时b2和b1引物未进行生物标记)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，合成后的引物用灭菌三蒸水稀释成浓度为10μm，-20℃保存。

表1猪链球菌的交叉等温扩增反应引物

实施例2交叉引物恒温扩增引物在检测待测猪链球菌中的应用

一、猪链球菌基因组dna的提取

(1)取甘油保存的血清2型猪链球菌，pbs(ph值为7.4、浓度为0.15m磷酸盐缓冲液：kh2po40.2g、na2hpo4·12h2o2.9g、nacl8g、kcl0.2g)溶解，取50μl接种于5mltsb培养基中，37℃振荡培养24h。

(2)接种环取一环，在tsa琼脂培养基平板上划线，37℃，5％co2条件下培养24h。

(3)挑取单个菌落，接种于5mltsb液体培养基中，37℃振荡培养12h。

(4)取1ml细菌培养物，4000r/min离心5min收集菌体。

(5)用500μl灭菌超纯水洗涤3次。

(6)以100μl灭菌超纯水重悬沉淀，100℃煮沸5min，12000g离心1min,上清即为dna模板，-20℃保存备用。

二、交叉等温扩增方法的建立

以血清2型猪链球菌的基因组dna为模板，应用初步筛选理论值较优的1套引物(如表1所示)进行交叉引物扩增，并对得到产物进行琼脂糖凝胶(质量体积比2％)电泳检测。

三、交叉引物扩增反应温度的优化

为了得到最优化的反应温度，分别设置57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃进行交叉等温扩增反应，反应时间是60min，反应体系如表2所示。反应产物通过2％琼脂糖凝胶(质量体积比)电泳检测，从多次重复试验中确定最佳反应温度，结果如图1所示，说明最佳反应温度为62℃。

表2猪链球菌交叉引物扩增反应体系

四、交叉等温扩增-测流层析检测方法的建立

由上海生工生物工程技术服务有限公司对b2和b1引物的5’端分别进行biotin(生物素)和fitc(异硫氰酸荧光素)标记。将b2和b1分别替换为biotin(生物素)标记的b2和fitc(异硫氰酸荧光素)标记的b1，建立可用于核酸试纸条检测的新交叉等温扩增反应体系。以血清2型猪链球菌的基因组dna为模板进行交叉等温扩增反应，反应条件为62℃恒温60min，同时以水替代核酸模板设置空白对照。反应结束后，将产物用核酸试纸条进行检测。

核酸试纸条的结果鉴定方法如下：

①阴性(－)：仅在质控区(c)出现一条条带，在检测区(t)内无红色条带出现。证明所检测的样本没有猪链球菌感染；

②阳性(+)：出现两条条带。一条位于检测区(t)内，另一条位于质控区(c)内。证明所检测的样本为猪链球菌感染。

③无效：质控区(c)和检测区(t)内均无条带出现，表明核酸试纸条失效。

五、交叉等温扩增检测方法的特异性、敏感性分析

1.特异性分析

使用血清1型猪链球菌、血清2型猪链球菌、血清7型猪链球菌、血清9型猪链球菌、血清5型副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌259株、巴氏杆菌1657株的基因组dna为模板检测体系的特异性。反应体系如表2所示，反应温度为步骤3确定的优化条件，使用核酸试纸条对产物进行检测。使用全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置检测(5min后看结果)，得到的结果如图2所示：以血清1型猪链球菌、血清2型猪链球菌、血清7型猪链球菌、血清9型猪链球菌的基因组dna为模板的交叉等温扩增反应产物出现两条条带，一条位于检测区(t)内，另一条位于质控区(c)内；以血清5型副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌259株、巴氏杆菌1657株的基因组dna分别为模板得到交叉引物扩增反应产物，仅在质控区(c)出现一条条带，在检测区(t)内无条带出现。结果显示检测体系的特异性良好，可特异的检测到猪链球菌。

2.敏感性分析

取浓度为4.4×10⁵cfu/ml的血清2型链球菌液体培养物100μl，用灭菌纯水进行10倍梯度稀释，煮沸5min后，冰上静置2min。每个稀释度取1μl样品液进行交叉等温扩增-测流层析检测，并与pcr进行比较。pcr所使用的引物是p1与p2引物，pcr所使用的引物是：

p1：5′-cagtatttaccgcatggtagatat-3′；

p2：5′-gtaagataccgtcaagtgagaa-3′；

以p1和p2为引物进行pcr，反应体系如表3所示：

表3pcr反应体系

pcr程序如下：94℃预变性3min；94℃30s，53℃35s，72℃30s为一个循环，运行35个循环，最后72℃延伸8min，16℃保存。

比较交叉等温扩增-测流层析检测法与pcr琼脂糖凝胶电泳检测方法的敏感性。结果如图3和4所示，交叉等温扩增-测流层析检测法的敏感性与pcr琼脂糖凝胶电泳方法相同，最低可以检测到4.4cfu的血清2型猪链球菌基因组dna。相比之下，本发明提供的交叉等温扩增-测流层析检测方法敏感性高，操作更加简单(等温反应)，而且用时更短(只需50min)，结果比较直观(肉眼判别)。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110>广东省农业科学院动物卫生研究所

<120>检测猪链球菌的交叉等温扩增引物组、试剂盒及应用

<130>2017

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

actgtcgatgatgttttgga20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cgaacttggaaacgagctt19

<210>3

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

acctgctcgttcaaccaatctggagatgatttgga35

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

acctgctcgttcaaccaat19

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gaacttccaaatcatctccag21

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cagtatttaccgcatggtagatat24

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gtaagataccgtcaagtgagaa22