本发明涉及制药技术领域，特别涉及一种固相法和液相法结合的高纯度亮丙瑞林合成方法。
背景技术：
亮丙瑞林，制剂中文名称为醋酸亮丙瑞林、抑那通或者简称亮丙瑞林，英文名称为leuprorelinacetate、enanton，lucrin等。亮丙瑞林的适应症为子宫内膜异位症；伴有月经过多、下腹痛、腰痛及贫血等的子宫肌瘤；绝经前乳腺癌，且雌激素受体阳性患者；前列腺癌；中枢性性早熟症。临床主要用于前列腺癌及子宫内膜异位症。
亮丙瑞林是1974年由日本武田化工的fujinomasahiko等人首先发现，并且发明合成工艺，其作为促黄体激素释放激素的九肽酰胺类似物，具有很好的活性。其先后在日本、德国、美国等国家申请专利，专利号分别为jp19740027442、de2446005、us4008209等。随后，又有一些研究机构和个人发表了一些合成工艺，专利号为ep1088555、ep1777232、us5480868等。
在中国专利cn200610119341.6公开的制备方法为在粗品合成肽键接肽时采用机械搅拌，氨基酸单体、hobt和dic用dmf溶解后倒入树脂中，室温下反应1-2h。抽干溶剂，再以dmf洗涤8次、抽干，kaiser试剂检测反应是否完全。然而，机械搅拌死角较多，不利于反应充分混匀反应，脱保护产生的co2和缩合反应产生的h2o，残留在反应液中，导致消耗更多的单体和试剂，并容易发生副反应，接肽反应率下降，粗品纯度和含量降低。
在中国专利cn200910104993.6公开的制备方法为在亮丙瑞林粗肽制备时，将侧链全保护，即将亮丙瑞林10mmol加入到250ml反应瓶中，将配制好的裂解试剂200ml倒入至上述反应瓶中，室温反应2小时。反应结束，将反应液倒入至2000ml冰乙醚中，洗出大量白色沉淀，离心，洗涤，干燥称重得亮丙瑞林粗肽。裂解沉淀过程时，需要消耗大量乙醚，增加了生产成本和后期废液处理的成本，不利于工业化生产。同时，该法无法完全避免二酮哌嗪副反应，放大生产时，二酮哌嗪副反应造成肽链脱落，显著降低收率。
目前已经公布的亮丙瑞林制备工艺都有着一定的缺陷，不能在操作复杂性、危险性、生产周期、产品总收率、产品成本和污染环境等方面达到一种较好的结合，应用价值不高。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的亮丙瑞林的合成工艺，解决现有技术存在的缺陷。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种合成高纯度亮丙瑞林的方法，其包括以下步骤：
(1)由fmoc-pro-ctc-oh和ctc树脂为起始原料，经反应得到fmoc-pro-ctc树脂；
(2)将fmoc-pro-ctc树脂用fmoc/tbu固相法以逐一偶联的方式依次连接具有保护基团的氨基酸，合成得到侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-树脂；
(3)配制体积比为20％的三氟乙醇的dcm溶液作为切割试剂，切割试剂冷却后加入，对侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-树脂进行切割，得到全保护亮丙瑞林前体肽；
(4)将侧链全保护的亮丙瑞林前体肽进行乙胺化修饰，得到侧链全保护的亮丙瑞林；
(5)对侧链全保护的亮丙瑞林进行侧链切割，得到亮丙瑞林粗肽；
(6)对亮丙瑞林粗肽进行cm纯化、hplc纯化，浓缩，溶解、冻干，得到高纯度的亮丙瑞林原料药。
在本发明方法的步骤(1)中，以dcm作为反应的溶剂。具体来说，用dcm将ctc树脂溶胀，溶胀时间为0.8-1h，加入反应釜中；用dcm将fmoc-pro-oh溶解后，加入一定量的diea，然后再加入到反应釜中；从反应釜底部通入氮气，反应时间为2-3h；反应完成后，对树脂进行封头，配制甲醇：diea：dcm(体积比1∶1∶2)的混合溶液，加入反应釜中，继续通入氮气振摇反应，将反应液抽干，用dmf洗涤2-6次。
在现有的技术文献中，大部分的科研人员选用了hmpb-am树脂或wang树脂作为起始原料。然而，本发明的科研人员在长期的实验过程中发现，使用该两种树脂均十分容易产生副反应：二酮哌嗪反应，特别是wang树脂，该副反应主要出现在第一个氨基酸为pro的时候，当第二个氨基酸脱fmoc的时候，α-氨基被游离出来之后，立即对wang树脂的苄酯键进行分子内胺解，生成六元环二酮哌嗪衍生物，同时从wang树脂上释放出来，导致反应终止。该反应非常迅速，文献报道采用50％pip/dmf，脱1min，4min的条件，但是我们实验证明在多数情况下，即使是1min左右反应就超过了20％。因此，经过理论摸索和实践验证，我们尝试了采用2-cl-trt树脂合成，该树脂的巨大空间阻力完全消除了该副反应。
同时，在步骤(1)中，采用了氮气搅拌，可以使反应更加充分地进行，并意想不到地通过带走反应产生的h2o，降低反应中氨基酸单体数量至1.5倍。
本发明方法的步骤(2)所述的具有保护基团的氨基酸采用fmoc基团保护，各种氨基酸分别以fmoc-pro-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-d-leu-oh、fmoc-tyr-oh、fmoc-ser(trt)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-his(trt)-oh和pglu的形式应用。
本发明方法的步骤(2)所述的fmoc保护基通过20％哌啶/dmf溶液处理来除去。
在本发明方法的步骤(2)所述的逐一偶联时，氨基酸相对于合成规模的投料比为1-6倍；所述逐一偶联剂的体系是dcc/hobt，或者是edc/hobt，或者是dic/hobt，或者是dic/hoat，或者是pybop/hobt，或者是pyaop/hoat，或者是tbtu/hobt，或者是hbtu/hobt，或者是hctu/hoct，或者是hatu/hoat；偶联反应溶剂是四氢呋喃(thf)，或者是二氧六环、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，或者是二氯甲烷(dcm)，或者是n-甲基吡咯烷酮(nmp)，或者是二甲基亚砜(dmso)；偶联反应的有机碱是n,n-二异丙基乙胺(dipea)，或者是三乙胺(tea)，或者是n-甲基吗啡啉(nmm)，或者是2,4,6-三甲基吡啶(tmp)；偶联反应时间为1-3小时。
本发明方法的步骤(3)所述的切割试剂，根据亮丙瑞林前体肽-树脂的质量多少进行投料，每克干燥树脂配制10ml切割试剂。
在本发明方法的步骤(4)所述的乙胺化修饰中，需加入hatu、2,4,6-三甲基吡啶、乙胺作为反应试剂，反应在25℃恒温进行，搅拌，反应0.5-3h。
在本发明方法的步骤(4)所述的乙胺化修饰中，加入hatu、2,4,6-三甲基吡啶作为反应试剂。其中，前体肽、hatu、2,4,6-三甲基吡啶三者的摩尔比为1∶2-3∶1.5-2；最佳地，三者的摩尔比为1∶2∶2。
本发明方法的步骤(4)所述的实验过程是将侧链全保护的亮丙瑞林前体肽进行乙胺化修饰，得到侧链全保护的亮丙瑞林。在现有的文献中，公开的实验方案虽多，但是实验反应所需的时间均在12-24小时之间，通常需要反应过夜。本发明的步骤(4)在已公开的实验技术基础上，反复优化实验条件，使得反应进行所需的时间大大地得到缩短，仅需0.5-3h即可完成。优选地，步骤(4)所述的乙胺化修饰得到侧链全保护的亮丙瑞林的反应时间为1h。本发明的步骤(4)中，反应釜中加入hatu、2,4,6-三甲基吡啶、乙胺的摩尔比为1∶1∶1。
本发明方法的步骤(5)所述的对侧链全保护的亮丙瑞林进行侧链切割需使用切割液，切割液为tfa：水(体积比为95∶5)。先低温下0-5℃加入侧链全保护的亮丙瑞林，再缓慢恢复至室温，反应1.5-3.5h。反应完成后，在33℃下低温旋蒸，去除反应液至原体积的1/3，再加入冰无水乙醚沉淀，离心过滤收集沉淀。
本发明方法步骤(5)所述的对侧链全保护的亮丙瑞林进行侧链切割的反应在0-5℃下进行，可以有效避免反应过于剧烈，使反应趋于温和，减少消旋副反应的发生。
本发明方法的步骤(6)所述的cm纯化是将亮丙瑞林粗品用ph6.0、0.05mol/l的乙酸钠溶液溶解(按1g粗品加入80～100ml溶液)，0.45μm膜过滤，上层析柱cm-sephadexg25。上样完毕后用ph6.0、0.05mol/l的乙酸钠缓冲液洗涤至稳定，再用ph6.0、0.5mol/l乙酸钠缓冲液进行洗脱，测定洗脱流出液在280nm处的吸光值，出峰时开始收集，至吸光值不在变化时停止收集。收集的洗脱液经hplc分析纯度，并计算含量。
cm纯化：为弱阳离子交换树脂纯化，为hplc纯化前的预纯化。粗品经过预纯化处理后，一方面可将大部分短肽和大分子肽分离去除，将其纯度提高至少10％，有利于实现生产出高纯度肽(纯度可达到99.5％以上)。另一方面则可提前去除粗品中的各种有机溶剂(极性有机溶剂)，不溶性颗粒，使之避免进入hplc系统内，保护和延长hplc系统使用寿命，大大降低设备使用成本；同时可使hplc柱在梯度精细分离过程中避免极性有机溶剂干扰，保持良好的重复性和分离度，从而实现产品质量的持续稳定性。cm预纯化后，获得较高纯度的洗脱液可显著提高后期hplc纯化的单次上样量，从而实现工业化生产。
本发明方法的步骤(6)所述的hplc纯化是收集的预处理洗脱液经0.45μm膜过滤后上已经过溶剂a(0.5％乙酸、5％乙腈溶液)平衡好的制备型hplc柱。用溶剂a(0.5％乙酸、5％乙腈溶液)和溶剂b(0.5％乙酸、80％乙腈溶液)进行梯度洗脱，收集合并所有纯度≥99.5％的收集液即得醋酸亮丙瑞林中间体，杂质总含量小于0.5％。
本发明方法的步骤(6)中，使用的溶剂a和溶剂b避免了使用较复杂的磷酸三乙胺体系、或者酸性强且不容易保存和配制的三氟乙酸体系，采用乙酸/乙腈体系，大大简化了纯化过程，降低了生产成本和人力成本。采用乙酸/乙腈体系，可避免引入磷酸，三乙胺，三氟乙酸等试剂，简化了后续有机溶剂去除工艺，降低原料药有机溶剂残留风险。
本发明方法的步骤(6)所述的浓缩过程为：醋酸亮丙瑞林中间体用1～2倍注射用水稀释后再吸附到hplc制备柱上，用溶剂c(0.1m醋酸铵溶液、ph＝5.0)洗涤，溶剂a(0.5％乙酸、5％乙腈溶液)洗涤，最后用溶剂d(0.5％乙酸、40％乙腈溶液)洗脱，收集有吸收值部分；旋转浓缩：上述的柱浓缩液，经40～45℃减压浓缩(真空度为-0.08～-0.1mpa)至干，然后加入适量的注射用水溶解后再次浓缩至干，反复至少3次，得浓缩物。
本发明方法的步骤(6)所述溶解、冻干过程为：将浓缩物加适量注射用水溶解，通过两个0.22μm过滤器过滤，再用注射用水冲洗过滤器。最终控制过滤收集液的浓度为8％～10％；进箱：过滤后的药液，倒入冻干盘中，进冻干箱冻干；冻干工艺条件为：预冻：导热油温度小于-40℃，保温2小时左右。升华：导热油升温速度约10℃/小时，至油温升至38℃，过程控制前箱真空度不大于30pa。导热油温度达约38℃时，保温约8小时至干燥终点；出箱后即得醋酸亮丙瑞林原料药。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义如表1所示：
表1缩略词表
实施例1
fmoc-pro-ctc树脂制备
1.1称量ctc树脂200g，加入到反应釜中，加入1500mldcm，使树脂完全溶胀在dcm溶剂中，溶胀1h，抽干。若溶胀过程出现试剂不能完全浸泡树脂的情况，应酌量补加试剂。称量fmoc-pro-oh54.0g，用700mldcm溶解，加入28mldiea混匀，然后加入到反应釜中，从反应釜底部通入氮气，反应120min。
1.2封头，配制甲醇：diea：dcm(体积比1：1：2)混合溶液800ml；加入到反应釜中，氮气振摇反应20min。将反应液抽干，用dmf洗涤4次。
1.3分光光度计测定取代度，检测替代度为0.51mmol/g。
实施例2
侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-ctc树脂的制备
pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-leu-leu-arg(pbf)-pro-ctcresin
2.1、接二肽
脱保护：dmf洗涤完毕后，向反应釜中加入20％哌啶/dmf溶液700ml(此数值可调整，以树脂充分混合均匀为宜，反应20min。将脱保护液抽干，dmf洗涤8次，每次700ml。洗完可用kaiser试剂检测，若数值呈红褐色，则表明脱保护成功。
接肽：fmoc-arg(pbf)-oh97g(150mmol)
hobt20g(150mmol)
dic54ml(300mmol)
将称取的fmoc-arg(pbf)-oh和hobt放于烧杯中，加入dmf将其溶解，再向烧杯中加入dic活化20s，混合均匀。加入到反应釜中反应60min。在缩合过程中，视情况补加dmf溶液，使反应中树脂呈流沙状。
检测：用长勺取少量树脂于试管中，用kaiser试剂检测，树脂呈无色透明状，说明反应完全。将反应液抽干，再向反应釜中加入700mldmf，混合振摇洗涤3min，抽干，重复操作8次。
2.2、接三肽
去保护基、洗涤：方法同接二肽项目
接肽：fmoc-leu-oh61g(150mmol)
hobt20g(150mmol)
dic54ml(300mmol)
方法同接二肽。
2.3、接四肽
去保护基、洗涤，方法同接二肽项下。
接肽：fmoc-d-leu-oh61g(150mmol)
hobt20g(150mmol)
dic54ml(300mmol)
方法同接二肽。
2.4、接五肽
接肽：fmoc-tyr(tbu)-oh79g(150mmol)
hobt20g(150mmol)
dic54ml(300mmol)
方法同接二肽。
2.5、接六肽
接肽：fmoc-ser(tbu)-oh66g(150mmol)
hobt20g(150mmol)
dic54ml(300mmol)
方法同接二肽。
2.6、接七肽
去保护基、洗涤、中和：方法同接二肽项下。
接肽：fmoc-trp(boc)-oh90g(150mmol)
hobt20g(150mmol)
dic54ml(300mmol)
方法同接二肽项目。
2.7、接八肽
脱保护、洗涤：方法同接二肽项下。
接肽：fmoc-his(trt)-oh108g(150mmol)
hobt20g(150mmol)
dic54ml(300mmol)
方法同接二肽。
2.8、接九肽
脱保护、洗涤：方法同接二肽项下。
接肽：pglu22g(150mmol)
hobt20g(150mmol)
dic54ml(300mmol)
方法同接二肽。
洗涤：dmf洗涤4次、甲醇洗涤4次，抽干。
干燥：树脂于50℃烘箱中干燥5小时以上，再置p2o5干燥箱中干燥至恒重，称重得亮丙瑞林前体肽-树脂167g。
实施例3
制备侧链全保护的亮丙瑞林前体肽：
pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-leu-leu-arg(pbf)-pro-oh
称量亮丙瑞林前体肽-树脂，加入到两个3l三角瓶中。按每g干燥树脂10ml切割试剂，配制20％的三氟乙醇/dcm溶液，在冰箱冷却1h后，分别加入到两个反应瓶中，振摇速度100r/min，反应120min；将上述切割后溶液置于旋转蒸发器中，35℃减压蒸干，得亮丙瑞林前体肽175.2g，ms：1889。
实施例4
制备侧链全保护的亮丙瑞林：
pglu-his(trt)-trp(boc)-ser(trt)-tyr-d-leu-leu-arg(pbf)-pro-nhch2ch3
取冻干后的上述肽46mmol(87g)，溶于5.75l二氯甲烷中，进行乙胺化修饰，按摩尔比，称取92mmol(35g，2n)的hatu，92mmol(11.1g，2n)的2,4,6-三甲基吡啶和92mmol(4.1g，2n)的乙胺加入到上述混合溶液中，25℃恒温搅拌1h。乙胺化修饰完成后，将上述反应液旋转浓缩至干，再冻干。得侧链全保护的亮丙瑞林91.5g(hplc纯度94.0％，收率98％，ms1916)。
实施例5
制备亮丙瑞林粗肽：
pglu-his-trp-ser-tyr-d-leu-leu-arg-pro-nhch2ch3
取冻干后的上述肽，按50mg/ml的多肽浓度，进行侧链切割。按tfa：水＝95：5配制切割液，先低温加入肽，再缓慢恢复至室温，反应120min。反应结束后，在33℃下低温旋蒸，去除反应液至原体积的1/3。再加入冰无水乙醚沉淀，离心/过滤收集沉淀，真空干燥得亮丙瑞林粗品91g。(hplc纯度88.0％，收率98％，ms1209)。
实施例6
cm纯化
将上述亮丙瑞林粗品91克，用ph6.0、0.05mol/l的乙酸钠溶液溶解(按1g粗品加入80～100ml溶液)，0.45μm膜过滤，上层析柱cm-sephadexg25。上样完毕后用ph6.0、0.05mol/l的乙酸钠缓冲液洗涤至稳定，再用ph6.0、0.5mol/l乙酸钠缓冲液进行洗脱，测定洗脱流出液在280nm处的吸光值，出峰时开始收集，至吸光值不在变化时停止收集。收集的洗脱液经hplc分析纯度(纯度应≥90％)，并计算含量。
实施例7
hplc纯化
收集的预处理洗脱液经0.45μm膜过滤后上已经过溶剂a(0.5％乙酸、5％乙腈溶液)平衡好的制备型hplc柱。用溶剂a(0.5％乙酸、5％乙腈溶液)和溶剂b(0.5％乙酸、80％乙腈溶液)进行梯度洗脱，收集合并所有纯度≥99.5％的收集液即得醋酸亮丙瑞林中间体，有关物质总纯度≤0.5％。(hplc纯度99.8％，收率89％)。
实施例8
浓缩
8.1、醋酸亮丙瑞林中间体用1～2倍注射用水稀释后再吸附到hplc制备柱上，用溶剂c(0.1m醋酸铵溶液、ph＝5.0)洗涤，溶剂a(0.5％乙酸、5％乙腈溶液)洗涤，最后用溶剂d(0.5％乙酸、40％乙腈溶液)洗脱，收集有吸收值部分。
8.2、旋转浓缩：上述的柱浓缩液，经40～45℃减压浓缩(真空度为-0.08～-0.1mpa)至干，然后加入适量的注射用水溶解后再次浓缩至干，反复至少3次，得浓缩物。
实施例9
溶解、冻干
9.1、溶解：将浓缩物加适量注射用水溶解，通过两个0.22μm过滤器过滤，再用注射用水冲洗过滤器。最终控制过滤收集液的浓度为8％～10％。
9.2、进箱：过滤后的药液，倒入冻干盘中，进冻干箱冻干。
9.3、冻干工艺条件为：预冻：导热油温度小于-40℃，保温2小时左右。升华：导热油升温速度约10℃/小时，至油温升至38℃，过程控制前箱真空度不大于30pa。导热油温度达约38℃时，保温约8小时至干燥终点。
9.4、出箱后即得醋酸亮丙瑞林原料药49克。
实施例10
1、实验a按照以下实验步骤进行：
1)fmoc-pro-hmpb-am树脂的制备
将hmpb-am树脂111.0g，替代度为0.9mmol/g，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤1次，用dcm溶胀树脂30分钟后，将77.6gfmoc-pro-oh，加入上述装有树脂的反应柱中搅拌反应2小时。反应结束，用dmf洗涤3次，dcm洗3次，用甲醇封闭30分钟，后用甲醇收缩得到fmoc-pro-hmpb-am树脂，检测替代度为0.6mmol/g。
2)侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-hmpb-am树脂的制备
称取100gfmoc-pro-hmpb-am树脂(0.6mmol/g，60mmol)加入反应器中，用dmf洗涤一次，用dcm溶胀0.5小时。溶胀结束，用20％dblk去除fmoc保护，后用dmf洗涤4次，dcm洗2次。将77.76gfmoc-arg(pbf)-oh(120mmol)，24.315ghobt(180mmol)，37.8gdcc溶于dcm中(可以加入少量dmf助溶)，加入固相反应器中，室温搅拌反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准)。重复以上步骤，依次完成fmoc-leu-oh、fmoc-d-leu-oh、fmoc-tyr-oh、、fmoc-ser(trt)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-his(trt)-oh和pglu等剩余氨基酸的连接。当pglu偶联结束后，将树脂用dmf洗涤3次，dcm洗3次，后用甲醇收缩，放置在真空干燥器中干燥过夜。第二天，称重得到侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-hmpb-am树脂201.082g(树脂增重率99.1％)。
3)pglu-his(trt)-trp(boc)-ser(trt)-tyr-d-leu-leu-arg(pbf)-pro-oh的制备(侧链全保护的亮丙瑞林前体肽的制备)
将201.082g侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-hmpb-am树脂(60mmol)加入到3000ml圆底烧瓶中，配制裂解试剂2000ml(三氟乙醇1800ml，dcm200ml)，将裂解试剂倒入树脂中，室温反应1小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量dcm洗涤树脂，合并滤液，将滤液减压蒸干，并且真空干燥，得到侧链全保护的亮丙瑞林前体粗肽104.2g(hplc纯度86.5％，收率92.04％，ms1889)。
4)pglu-his(trt)-trp(boc)-ser(trt)-tyr-d-leu-leu-arg(pbf)-pro-nhch2ch3的制备(侧链全保护的亮丙瑞林)
将104.2g侧链全保护的亮丙瑞林前体粗肽(55.2mmol)加到2000ml的三口烧瓶中，加入500ml二氯甲烷使其完全溶解。称取115.9gdcc和74.25ghobt(552mmol)加入到上述反应瓶中，剧烈搅拌反应30min。30min后再反应瓶中加入550ml1mol/l乙胺的二氯甲烷溶液，室温反应过夜。反应结束，用1m盐酸洗、水洗、10％碳酸氢钠洗、水洗、饱和氯化钠洗，然后用无水硫酸镁干燥1小时。干燥结束，过滤滤液浓缩蒸干，减压干燥得侧链全保护的亮丙瑞林105.2g(hplc纯度80.5％，收率99.5％，ms1916)。
5)亮丙瑞林粗肽的制备
将19.2g侧链全保护的亮丙瑞林(10mmol，纯度80.5％)加入到250ml反应瓶中，将配制好的裂解试剂200ml(三氟乙酸190ml，水10ml)倒入至上述反应瓶中，室温反应2小时。反应结束，将反应液倒入至2000ml冰乙醚中，洗出大量白色沉淀，离心，洗涤，干燥称重得亮丙瑞林粗肽11.872g(hplc纯度85.7％，收率98.2％，ms1209)。
6)亮丙瑞林精肽的制备
将11.872g亮丙瑞林粗品使用高效液相制备色谱纯化，流动相：a相：0.1％-0.3％磷酸水溶液用三乙胺调ph至2.0-3.0；b相：乙腈和甲醇(v乙腈∶v甲醇＝4∶1)混合液。流速：70-80ml/min。检测波长：280nm。梯度：b％：12％～43％(55min)，收集纯度大于98.5％以上馏分，浓缩、冻干得到7.242g亮丙瑞林的精肽(hplc纯度＞98.5％，收率51.0％，ms1209)，总收率46.0％。
2、实验b按照本说明书实施例1-9依次进行
3、实验c按照本说明书实施例1-5、7-9，依次进行
4、实验结论分析
实验a、b、c三者的比较情况如表1。由表1分析对比可知，运用氮气搅拌反应，可以使氨基酸单体数量和hobt数量减半，粗品纯度也有所提高。旋蒸去除反应液可使乙醚用量大大降低，采用cm纯化预处理和乙酸/乙腈hplc纯化体系，不仅简化了生产过程，降低生产成本，进一步提高了成品质量和稳定性。
实验b所得粗品，当经过实施例6步骤(cm柱预纯化)后，所得洗脱液再进行实施例7步骤(hplc纯化)，所得纯度≥99.5％的合格中间体，纯化收率比实验c由60％提高至89％，中间体有关物质也明显偏低，进一步提高了成品质量。
表1工艺结果对比
实施例11
偶联试剂的选择
取冻干后的亮丙瑞林前体肽，按8mmol/ml的多肽浓度，进行乙胺化修饰，按摩尔比，加入偶联试剂，到上述混合溶液中，25℃恒温搅拌1h。乙胺化修饰完成后，将上述反应液旋转浓缩至干，再冻干，得侧链全保护亮丙瑞林。(表2中，n表示摩尔量的倍数)
表2不同偶联试剂的实验结果比较
实验结论：由上述表格数据分析可知，使用不同组合的缩合剂进行乙胺化，反应1小时后，dcc+hobt反应率最低，纯度也最低。dic+hobt所得侧链全保护亮丙瑞林，颜色最浅，为类白色，但是纯度较低。对偶联试剂hatu和2,4,6-三甲基吡啶(tmp)的用量进行对比试验，随着2,4,6-三甲基吡啶用量的增加，所得侧链全保护的亮丙瑞林，颜色加深。当前体肽：hatu：tmp摩尔比例为1∶2-3∶1.5-2时，实验的收率与纯度较优；当hatu、tmp的比例均为肽投料量的2倍摩尔量(2n)时，为浅黄色，收率可达到98％，纯度最优，且hatu、tmp都是工业上易得价廉的原料，非常有利于规模化的大生产。