本发明属于药物生物技术领域，特别涉及一种糖基转移酶及其克隆表达方法与应用。
背景技术：
一直以来，强心甾类化合物因其具有强心、抗肿瘤、抗炎、镇痛等多种重要的药理活性而被人们广泛关注。以地高辛为代表的洋地黄类药物，在临床上用于治疗充血性心力衰竭与心律失常已有超过两百年的历史。此外，强心甾类化合物还具有选择性抑制肿瘤细胞增殖的作用。这是因为强心甾类药物能够特异性地抑制na+/k+-atp酶的α亚基，导致细胞内na+浓度上升，启动na+-ca2+交换，使细胞内ca2+浓度上升，从而发挥强心作用；另外，通过与na+/k+-atp酶α亚基的特异性结合，能够激活一系列下游信号转导通路，导致肿瘤细胞选择性凋亡(prassasi,diamandisep.noveltherapeuticapplicationsofcardiacglycosides.natrevdrugdiscov.2008nov；7(11):926-35.)。
强心甾类化合物c3羟基的糖基化修饰对化合物的药理活性具有重要影响，主要包括以下三个方面：1、糖基化修饰具有减毒作用。临床上使用的强心药如地高辛和洋地黄毒苷，都是多糖基化修饰的强心甾类化合物，而不含糖的强心甾类化合物水溶性差、毒性大，不能成药。2、糖链部分的长度及糖基的种类，能够影响强心甾类化合物对na+/k+-atp酶不同α亚基的选择性，例如明显增强对α2亚基(主要分布于骨骼肌、平滑肌和心脏等肌肉组织)的特异性结合能力，从而起到减毒作用(dostanic-larsoni,lorenzjn,vanhuyssejw,neumannjc,moseleyae,lingreljb.physiologicalroleofthealpha1-andalpha2-isoformsofthena+-k+-atpaseandbiologicalsignificanceoftheircardiacglycosidebindingsite.amjphysiolregulintegrcompphysiol.2006mar；290(3):r524-8.)。3、糖链部分的长度、糖基的种类及构型，与强心甾类化合物的抗肿瘤活性密切相关。例如洋地黄毒苷元与α-l-鼠李糖形成的强心苷，对肿瘤细胞的细胞毒活性强于洋地黄毒苷(wanghy,rojanasakuly,o'dohertyga.synthesisandevaluationoftheα-d-/α-l-rhamnosylandamicetosyldigitoxigeninoligomersasantitumoragents.acsmedchemlett.2011apr14；2(4):264-269.)。
为了获得更具药用开发前景的强心苷类化合物，目前的主要手段是通过植化分离或者化学合成。但是两种方法都具有明显缺陷，例如植化分离产量低，周期长，原料受地理、季节等条件约束；化学合成则成本高，需要昂贵的催化剂，需要较多的保护和去保护反应，产生较多毒性废物等。相比而言，通过糖基转移酶进行绿色、高效的糖基化修饰具有明显优势。美国学者thorson的研究团队通过酶定向进化方法改造放线菌来源的糖基转移酶oled，获得突变型oled(asp)，是目前全世界唯一一个对强心甾具有糖基化能力的糖基转移酶(zhoum,houy,hamzaa,painc,zhancg,bugnits,thorsonjs.probingtheregiospecificityofenzyme-catalyzedsteroidglycosylation.orglett.2012nov2；14(21):5424-7.)。但是强心甾并非oled(asp)的天然底物，由于糖基转移酶固有的底物专一性，导致该酶对强心甾c3位羟基的转化率低，例如对洋地黄毒苷元的转化率只有20％，对芰皂配基的转化率为3％，对华蟾蜍它灵的转化率为39％，对毒毛旋花子苷元等强心甾则不能转化；另外，该酶对c3位是α羟基的强心甾也不能转化；并且该酶对强心甾的区域选择性差，例如异羟基洋地黄毒苷元的c12位有羟基，则c3位羟基完全不能反应。因此直到目前为止，尚未发现一个对强心甾类化合物c3羟基具有高效转化能力的糖基转移酶。
强心苷广泛分布于玄参科、夹竹桃科、萝藦科、百合科、十字花科、毛茛科等多种植物中，例如从萝藦科植物马利筋分离到一系列强心苷类化合物(zhangrr,tianhy,tanyf,chungty,sunxh,xiax,yewc,middletonda,fedosovan,esmannm,tzenjt,jiangrw.structures,chemotaxonomicsignificance,cytotoxicandna+,k+-atpaseinhibitoryactivitiesofnewcardenolidesfromasclepiascurassavica.orgbiomolchem.2014nov28；12(44):8919-29.)。但到目前为止，尚未从植物中发现对强心甾类化合物具有转化能力的糖基转移酶。
技术实现要素：
为了克服强心甾类化合物水溶性差、副作用大的缺陷，同时针对现有技术手段的不足，本发明的目的之一在于提供一种糖基转移酶，命名为糖基转移酶ugt74an1，所述的糖基化转移酶可有效催化强心甾合成强心甾-3-o-β-d-吡喃葡萄糖苷，来源于植物马利筋(asclepiascurassavica)。
本发明的另一目的在于提供一种重组表达载体。
本发明的另一目的在于提供一种宿主细胞。
本发明的再一目的在于提供所述的糖基转移酶的克隆表达方法。
本发明的又一目的在于提供所述的糖基转移酶的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种糖基转移酶，可有效催化强心甾合成强心甾-3-o-β-d-吡喃葡萄糖苷，命名为ugt74an1，其氨基酸序列选自如下(1)、(2)或(3)：
(1)如seqidno.1所示的氨基酸序列；
(2)如seqidno.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸且具有催化强心甾生成强心甾-3-o-β-d-吡喃葡萄糖苷活性的氨基酸序列；
(3)与seqidno.1所示的氨基酸序列同源性≥90％，且所表达蛋白具有催化强心甾合成强心甾-3-o-β-d-吡喃葡萄糖苷活性的氨基酸序列。
编码所述的糖基转移酶的核苷酸序列，选自如下(1)、(2)、(3)、(4)或(5)：
(1)如seqidno.2所示的核苷酸序列；
(2)与seqidno.2所示的核苷酸序列不同，但是编码如seqidno.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
(3)与seqidno.2所示的核苷酸序列同源性≥85％，且其所表达蛋白具有催化强心甾合成强心甾-3-o-β-d-吡喃葡萄糖苷活性的核苷酸序列；
(4)在严格条件下可以与seqidno.2限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
(5)与(1)、(2)或(3)任一项所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
含有编码所述的糖基转移酶的核苷酸序列的重组表达载体。
所述的表达载体是适用于大肠杆菌中表达的载体。
所述的重组表达载体优选通过in-fusion克隆方法构建得到。
所述的重组表达载体是将所述的核苷酸序列插入至pet28a中得到的。
一种基因工程化的宿主细胞，其转化了所述的重组表达载体或者基因组上整合了所述的核苷酸序列的宿主细胞及其后代细胞。
所述的宿主细胞及其后代细胞指细菌细胞、真菌细胞、动物细胞或者植物细胞及这些宿主细胞的后代。
所述的宿主细胞优选为大肠杆菌；进一步优选为大肠杆菌transetta(de3)。
一种糖基转移酶，通过所述的宿主细胞转化得到。
所述的糖基转移酶的克隆表达方法，包括如下步骤：
将编码所述的糖基转移酶的核苷酸序列克隆入表达载体中构建重组表达载体；再将所述的重组表达载体转入表达系统中进行异源表达；最后经纯化得到所述的糖基转移酶。
所述的重组表达载体或宿主细胞在表达所述的糖基转移酶中的应用。
所述的糖基转移酶在制备糖基化修饰的化合物中的应用。
所述的化合物优选为强心甾类化合物。
所述的强心甾类化合物优选为洋地黄毒苷元、酯蟾毒配基、华蟾蜍它灵、沙蟾毒精、蟾毒灵、3α-蟾毒灵或其他结构类似的甲型或乙型强心甾。
所述的糖基化修饰优选为对强心甾类化合物c3位羟基进行的糖基化修饰。
所述的应用为通过所述的糖基转移酶，按照图20中所示的合成路线进行酶促反应，催化强心甾与udp-葡萄糖(二磷酸尿苷葡糖)反应生成相应的强心甾-3-o-β-d-吡喃葡萄糖苷，在体外进行酶催化反应，从而制备或生产强心甾-3-o-β-d-吡喃葡萄糖苷。
所述的酶催化反应的反应体系优选为：50mmtris-hcl(ph8)，5mmmgcl2，5mmudp-葡萄糖，1mm底物，130μg所述的糖基转移酶，总体积为200μl。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明提供了一个马利筋植物来源的糖基转移酶ugt74an1，该酶是首次发现的植物来源的以强心甾作为天然底物的糖基转移酶。同时，本发明也在国内外首次公开了糖基转移酶ugt74an1在催化强心甾合成相应的强心甾-3-o-β-d-吡喃葡萄糖苷中的应用。
2、本发明的公开为通过体外酶催化方式合成强心甾-3-o-β-d-吡喃葡萄糖苷提供了条件，实现以绿色、高效的方式催化多种强心甾类化合物合成相应的糖苷产物。克服了通过植化分离方法或者化学合成方法获得强心苷类化合物时，存在产量低、效率低、操作繁琐、环境污染严重、成本高的缺陷。
3、与现有的能够催化强心甾的糖基转移酶oled(asp)相比，ugt74an1的转化率显著提高，且选择性更强。例如oled(asp)对洋地黄毒苷元的转化率为20％，ugt74an1可以达到95％；可高效转化oled(asp)不能利用的3位羟基为α构型的强心甾，例如3α-蟾毒灵。
4、本发明实施后将为强心甾的糖基化合成提供一种重要的工具酶，将为强心苷的合成工业带来巨大的经济效益。
附图说明
图1是糖基转移酶ugt74an1在大肠杆菌transetta(de3)中表达重组蛋白的电泳检测图。
图2是洋地黄毒苷元经酶催化后反应终产物的lc-ms图谱图；其中，上图是液相信号，1代表反应后的剩余底物，1a代表生成的糖基化产物；下图是质谱信号，显示糖基化产物的ms特征峰。
图3是洋地黄毒苷元经酶催化后反应终产物的结构式。
图4是洋地黄毒苷元经酶催化后反应终产物的1hnmr及13cnmr图谱图。
图5是酯蟾毒配基经酶催化后，反应终产物的lc-ms图谱；其中，上图是液相信号，2代表反应后的剩余底物，2a代表生成的糖基化产物；下图是质谱信号，显示糖基化产物的ms特征峰。
图6是酯蟾毒配基经酶催化后反应终产物的结构式。
图7是酯蟾毒配基经酶催化后反应终产物的1hnmr及13cnmr图谱图。
图8是华蟾蜍它灵经酶催化后，反应终产物的lc-ms图谱；其中，上图是液相信号，3代表反应后的剩余底物，3a代表生成的糖基化产物；下图是质谱信号，显示糖基化产物的ms特征峰。
图9是华蟾蜍它灵经酶催化后反应终产物的结构式。
图10是华蟾蜍它灵经酶催化后反应终产物的1hnmr及13cnmr图谱图。
图11是沙蟾毒精经酶催化后，反应终产物的lc-ms图谱；其中，上图是液相信号，4代表反应后的剩余底物，4a代表生成的糖基化产物；下图是质谱信号，显示糖基化产物的ms特征峰。
图12是沙蟾毒精经酶催化后反应终产物的结构式。
图13是沙蟾毒精经酶催化后反应终产物的1hnmr及13cnmr图谱图。
图14是蟾毒灵经酶催化后，反应终产物的lc-ms图谱；其中，上图是液相信号，5代表反应后的剩余底物，5a代表生成的糖基化产物；下图是质谱信号，显示糖基化产物的ms特征峰。
图15是蟾毒灵经酶催化后反应终产物的结构式。
图16是蟾毒灵经酶催化后反应终产物的1hnmr及13cnmr图谱图。
图17是3α-蟾毒灵经酶催化后，反应终产物的lc-ms图谱；其中，上图是液相信号，6代表反应后的剩余底物，6a代表生成的糖基化产物；下图是质谱信号，显示糖基化产物的ms特征峰。
图18是3α-蟾毒灵经酶催化后反应终产物的结构式。
图19是3α-蟾毒灵经酶催化后反应终产物的1hnmr及13cnmr图谱图。
图20是实施例3～8中各底物及产物的化学结构与合成路线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。需要指出的是，对本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以在此基础上做出若干变动和改进，例如改变表达载体的种类，更改表达载体构建的方法，改变蛋白纯化的方式等。这些都属于本发明的保护范围。
在以下实施例中，大肠杆菌表达菌株transetta(de3)购自北京全式金生物技术有限公司，货号cd801-01。
pet28a表达载体购自novagen公司，货号69864。
植物rna提取试剂盒rnapreppureplantkit购自天根生化科技有限公司，货号dp441。
rna逆转录试剂盒primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser购自takara公司，货号rr047a。
连接反应试剂盒in-fusionhdcloningkit购自clontech公司，货号639636。
以下实施例中未注明具体实验条件的实施方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或者按照相应试剂生产厂商提供的产品说明书中所建议的条件。
实施例1糖基转移酶ugt74an1的克隆及表达载体的构建
使用植物rna提取试剂盒分别提取马利筋(asclepiascurassavica)植物幼嫩叶片的rna，然后使用rna反转录试剂盒分别进行反转录反应获得cdna。针对糖基转移酶ugt74an1的编码基因序列设计一对特异性的引物，同时每条引物在5’端引入与载体同源的碱基序列用于in-fusion克隆方法构建pet28a表达载体，具体扩增引物如下(下划线标示序列为与载体序列同源的碱基，用于in-fusion连接)：
p1-f：5’-cgcgcggcagccatatgggcagtgaaagctacgaatttct-3’
p1-r：5’-gtgcggccgcaagcttctaaacgctgcacttcttggtaatc-3’
以马利筋幼嫩叶片的cdna作为模板，pcr扩增反应的条件：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，反应30个循环；72℃终延伸10min。将目的片段回收，使用连接反应试剂盒连接到pet28a表达载体，得到重组载体pet28a-ugt74an1，挑选单克隆进行测序验证(seqidno.2)。
实施例2糖基转移酶ugt74an1的原核表达及纯化
将测序正确的pet28a-ugt74an1的重组载体转化表达菌株transetta(de3)，使用菌落pcr方法验证重组质粒已经成功进入表达菌株。挑选转化成功的单个克隆接种至15ml的lb培养基中，该培养基中已事先加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素及34μg/ml的氯霉素，37℃、220rpm条件下培养过夜。次日将培养物以1:100的比例接种至1l含有相应抗生素的培养基中，37℃、220rpm条件下培养至od600为0.6～0.8，然后加入iptg至终浓度为0.2mm，18℃、120rpm条件下培养18～20h诱导蛋白表达。诱导结束后，通过离心收集菌体，条件为10,000g，4℃离心5min。向收集后的菌体中加入10ml预冷的buffera(20mmphosphatebuffer,0.5mnacl,10mmimidazole,ph7.4)，在冰水浴中进行超声破碎，处理方法：超声功率250w，超声3sec，间隔7sec，超声时间为30min。大肠杆菌裂解液通过离心除去不溶物，收集上清液，条件为14,000g，4℃离心40min。收集的上清液经0.45μm滤膜过滤后加入到含5ml介质的ni-nta柱中，ni-nta柱事先用10个柱体积的buffera平衡。为提高目的蛋白的结合效率，将ni-nta柱颠倒混匀，再于4℃条件下垂直混匀1h。然后加入10个柱体积的bufferb(20mmphosphatebuffer,0.5mnacl,50mmimidazole,ph7.4)洗下杂蛋白。最后再用10个柱体积的bufferc(20mmphosphatebuffer,0.5mnacl,250mmimidazole,ph7.4)洗脱目的蛋白。使用12％的sds-page电泳确认蛋白纯度>90％，可用于后续酶催化反应。蛋白浓度使用bradford法进行定量检测，结果如图1所示。
实施例3糖基转移酶ugt74an1对洋地黄毒苷元的糖基化修饰
1)糖基转移酶ugt74an1进行催化活性检测在1.5mlep管中进行，反应体系为：50mmtris-hcl(ph8.0)，5mmmgcl2，5mmudp-葡萄糖，1mm洋地黄毒苷元，最后加入130μg实施例2中的纯化后的糖基转移酶ugt74an1，总体积为200μl。反应条件为37℃，12h。同时以不加udp-葡萄糖或者不加酶的平行反应作为阴性对照。反应结束后，加入等体积的甲醇终止反应，14,000g离心30min。收集上清液作为反应后的终产物，用于hplc-dad/esi-ms分析。
2)hplc-dad/esi-ms分析由agilent1200液相系统串联agilent6210lc/msdtof离子阱质谱仪(esi离子源)完成，柱后分流比为1：10。其中hplc检测条件包括：ultimatepolarrpc18column(250mm×4.6mmi.d.，5μm)；检测波长为220nm及296nm；流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为乙腈；流速1ml/min；进样量10μl。梯度洗脱条件为：0～20min，10～75％b；20～21min，75～100％b；21～26min，100％b；26～29min，100～10％b；29～35min，10％b。质谱条件包括：干燥气温度3000℃；电喷雾电压3.5kv；裂解电压175.0v；扫描范围为正离子模式(m/z150-1200)；电喷雾气压30psig；干燥气流速11l/min。
3)液相结果显示，经过酶促反应后，生成了单一的产物峰，根据保留时间确认产物极性明显增大；而不加udp-葡萄糖或者不加酶的空白对照均没有产物生成。质谱结果显示，发现产生[m+glc+h]+的离子碎片，洋地黄毒苷元糖基化产物的ms特征峰537.3101，产率95％。结果如图2所示。
4)为了进一步确认强心甾与葡萄糖的连接方式，对洋地黄毒苷元进行了制备反应。将各反应原料等比例放大用于制备足够量的反应产物，制备反应体系为：50mmtris-hcl(ph8.0)，26.4mgmgcl2，39.7mgudp-葡萄糖，10mg洋地黄毒苷元，最后加入17mg实施例2中的纯化后的糖基转移酶ugt74an1，总体积为52ml。37℃反应12h后终止反应。制备条件为：cosmosil5c18-ms-iipackedcolumn(250mm×10.0mmi.d.，5μm)；流速5ml/min；检测波长296nm；甲醇：水为流动相。取少量无杂质的转化产物溶于氘代甲醇，于400mhz核磁共振仪检测，确认产物为洋地黄毒苷元3-o-β-d-葡萄糖苷。该产物的结构，1hnmr及13cnmr图谱如图3～4所示。
1hnmr(cd3od,400mhz)δ:5.93(1h,s),5.07(1h,d,j＝18.4hz),4.95(1h,d,j＝19.8hz),4.35(1h,d,j＝7.8hz,sugarh-1),4.11(1h,s,h-3),3.89(1h,d,j＝2.1hz),3.69(1h,dd,j＝11.8,5.4hz),3.40-3.21(5h,m),2.95-2.79(1hm,),2.35-2.12(2h,m),2.00-1.43(19h,m),1.40-1.22(4h,m),1.00(3h,s),0.92(3h,s)；13cnmr(cd3od,100mhz)δ:178.5(c-23),177.3(c-20),117.8(c-22),102.7(sugarc-1),86.5(c-14),78.2(sugarc-5),77.8(sugarc-2),75.4(sugarc-4),75.3(sugarc-3),75.2(c-31),71.7(c-3),62.8(sugarc-6),52.2(c-13),51.1(c-17),42.7(c-9),41.0(c-8),37.5(c-5),36.9(c-12),36.3(c-10),33.4(c-4),31.2(c-15),30.9(c-1),28.1(c-2),27.8(c-6),27.5(c-16),24.1(c-7),22.6(c-7),22.4(c-18),16.4(c-19).
实施例4糖基转移酶ugt74an1对酯蟾毒配基的糖基化修饰
1)糖基转移酶ugt74an1催化活性检测在1.5mlep管中进行，反应体系为：50mmtris-hcl(ph8.0)，5mmmgcl2，5mmudp-葡萄糖，1mm酯蟾毒配基，130μg纯化蛋白ugt74an1，总体积为200μl。反应条件为37℃，12h。同时以不加udp-葡萄糖或者不加酶的平行反应作为阴性对照。反应结束后，加入等体积的甲醇终止反应，14,000g离心30min。收集上清液作为反应后的终产物，用于hplc-dad/esi-ms分析。
2)hplc-dad/esi-ms分析由agilent1200液相系统串联agilent6210lc/msdtof离子阱质谱仪(esi离子源)完成，柱后分流比为1：10。其中hplc检测条件包括：ultimatepolarrpc18column(250mm×4.6mmi.d.，5μm)；检测波长为220nm及296nm；流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为乙腈；流速1ml/min；进样量10μl。梯度洗脱条件为：0～20min，10～75％b；20～21min，75～100％b；21～26min，100％b；26～29min，100～10％b；29～35min，10％b。质谱条件包括：干燥气温度3000℃；电喷雾电压3.5kv；裂解电压175.0v；扫描范围为正离子模式(m/z150-1200)；电喷雾气压30psig；干燥气流速11l/min。
3)液相结果显示，经过酶促反应后，生成了单一的产物峰，根据保留时间确认产物极性明显增大；而不加udp-葡萄糖或者不加酶的空白对照均没有产物生成。质谱结果显示，发现产生[m+glc+h]+的离子碎片，酯蟾毒配基糖基化产物的ms特征峰547.3876，产率99％；结果如图5所示。
4)为了进一步确认强心甾与葡萄糖的连接方式，对酯蟾毒配基进行了制备反应。将各反应原料等比例放大用于制备足够量的反应产物，制备反应体系为：50mmtris-hcl(ph8.0)，26.4mgmgcl2，39.7mgudp-葡萄糖，10mg酯蟾毒配基，最后加入17mg实施例2中的纯化后的糖基转移酶ugt74an1，总体积为52ml。37℃反应12h后终止反应。制备条件为：cosmosil5c18-ms-iipackedcolumn(250mm×10.0mmi.d.，5μm)；流速5ml/min；检测波长296nm；甲醇：水为流动相。取少量无杂质的转化产物溶于氘代甲醇，于400mhz核磁共振仪检测，确认产物为酯蟾毒配基3-o-β-d-葡萄糖苷。该产物的结构，1hnmr及13cnmr图谱如图6～7所示。
1hnmr(cd3od,400mhz)δ:7.91(1h,dd,j＝9.8,2.4hz,h-22),7.46(1h,d,j＝2.4hz,h-21),6.27(1hd,j＝9.8hz,h-23),4.32(1h,d,j＝7.8hz,sugarh-1),4.08(1h,m,h-3),3.86(1h,d,j＝11.9hz),3.67(1h,dd,j＝11.9,5.4hz),3.62(1h,s,h-15),3.39-3.17(7h,m),2.61(1h,d,j＝10.0hz,h-10),2.44(1h,d,j＝10.4hz,h-16),2.04-1.43(15h,m),1.40-1.05(4h,m),0.99(3h,s),0.79(3h,s)；13cnmr(cd3od,100mhz)δ:164.5(c-24),151.8(c-21),149.6(c-22),124.5(c-20),115.3(c-23),102.7(sugarc-1),78.2(sugarc-5),77.84(sugarc-2),75.8(c-14),75.4(sugarc-4),75.2(sugarc-3),71.7(c-3),62.8(sugarc-6),61.6(c-15),52.3(c-17),49.8(c-13),43.1(c-12),41.9(c-9),40.4(c-10),37.4(c-5),37.1(c-4),36.3(c-8),33.2(c-1),30.9(c-16),29.8(c-2),27.8(c-6),27.5(c-19),24.1(c-11),22.6(c-7),21.7,17.1(c-18).
实施例5糖基转移酶ugt74an1对华蟾蜍它灵的糖基化修饰
1)糖基转移酶ugt74an1催化活性检测在1.5mlep管中进行，反应体系为：50mmtris-hcl(ph8.0)，5mmmgcl2，5mmudp-葡萄糖，1mm华蟾蜍它灵，130μg纯化蛋白ugt74an1，总体积为200μl。反应条件为37℃，12h。同时以不加udp-葡萄糖或者不加酶的平行反应作为阴性对照。反应结束后，加入等体积的甲醇终止反应，14,000g离心30min。收集上清液作为反应后的终产物，用于hplc-dad/esi-ms分析。
2)hplc-dad/esi-ms分析由agilent1200液相系统串联agilent6210lc/msdtof离子阱质谱仪(esi离子源)完成，柱后分流比为1：10。其中hplc检测条件包括：ultimatepolarrpc18column(250mm×4.6mmi.d.，5μm)；检测波长为220nm及296nm；流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为乙腈；流速1ml/min；进样量10μl。梯度洗脱条件为：0～20min，10～75％b；20～21min，75～100％b；21～26min，100％b；26～29min，100～10％b；29～35min，10％b。质谱条件包括：干燥气温度3000℃；电喷雾电压3.5kv；裂解电压175.0v；扫描范围为正离子模式(m/z150-1200)；电喷雾气压30psig；干燥气流速11l/min。
3)液相结果显示，经过酶促反应后，生成了单一的产物峰，根据保留时间确认产物极性明显增大；而不加udp-葡萄糖或者不加酶的空白对照均没有产物生成。质谱结果显示，发现产生[m+glc+h]+的离子碎片，华蟾蜍它灵糖基化产物的ms特征峰605.3817，产率70％；结果如图8所示。
4)为了进一步确认强心甾与葡萄糖的连接方式，对华蟾蜍它灵进行了制备反应。将各反应原料等比例放大用于制备足够量的反应产物，制备反应体系为：50mmtris-hcl(ph8.0)，26.4mgmgcl2，39.7mgudp-葡萄糖，10mg华蟾蜍它灵，最后加入17mg实施例2中的纯化后的糖基转移酶ugt74an1，总体积为52ml。37℃反应12h后终止反应。制备条件为：cosmosil5c18-ms-iipackedcolumn(250mm×10.0mmi.d.，5μm)；流速5ml/min；检测波长296nm；甲醇：水为流动相。取少量无杂质的转化产物溶于氘代甲醇，于400mhz核磁共振仪检测，确认产物为华蟾蜍它灵3-o-β-d-葡萄糖苷。该产物的结构，1hnmr及13cnmr图谱如图9～10所示。
1hnmr(cd3od,400mhz)δ:7.91(1h,dd,j＝9.8,2.4hz,h-22),7.47(1h,d,j＝2.4hz,h-21),6.28(1hd,j＝9.8hz,h-23),4.34(1h,d,j＝7.8hz,sugarh-1),4.10(1h,m,h-3),3.87(1h,dd,j＝11.8,1.8hz),3.76(1h,s,h-15),3.69(1h,dd,j＝11.8,5.4hz),3.58(1h,m,h-3),3.45-3.17(5h,m),2.95(1h,d,j＝9.3hz,h-17),2.15-2.01(1h,td,h-8),1.85(3h,s,coch3,)1.81-1.04(19h,m,),0.99(3h,s,h-19),0.83(3h,s,h-18)；13cnmr(cd3od,100mhz)δ:171.6(coch3),164.0(c-24),153.5(c-22),150.9(c-21),118.4(c-20),114.1(c-23),102.7(sugarc-1),78.2(sugarc-5),77.84(sugarc-2),76.6(c-16),75.4(sugarc-4),75.2(sugarc-3),73.4(c-14),71.7(c-3),62.8(sugarc-6),60.8(c-15),51.4(c-17),46.3(c-13),40.5(c-5),40.7(c-9),37.3(c-12),36.3(c-4),36.1(c-1),36.0(c-10),31.7(c-8),31.2(c-2),27.4(c-6),23.7(c-19),21.9(c-7),21.9(c-11),20.4(coch3),17.5(c-18).
实施例6糖基转移酶ugt74an1对沙蟾毒精的糖基化修饰
1)糖基转移酶ugt74an1催化活性检测在1.5mlep管中进行，反应体系为：50mmtris-hcl(ph8.0)，5mmmgcl2，5mmudp-葡萄糖，1mm沙蟾毒精，130μg纯化蛋白ugt74an1，总体积为200μl。反应条件为37℃，12h。同时以不加udp-葡萄糖或者不加酶的平行反应作为阴性对照。反应结束后，加入等体积的甲醇终止反应，14,000g离心30min。收集上清液作为反应后的终产物，用于hplc-dad/esi-ms分析。
2)hplc-dad/esi-ms分析由agilent1200液相系统串联agilent6210lc/msdtof离子阱质谱仪(esi离子源)完成，柱后分流比为1：10。其中hplc检测条件包括：ultimatepolarrpc18column(250mm×4.6mmi.d.，5μm)；检测波长为220nm及296nm；流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为乙腈；流速1ml/min；进样量10μl。梯度洗脱条件为：0～20min，10～75％b；20～21min，75～100％b；21～26min，100％b；26～29min，100～10％b；29～35min，10％b。质谱条件包括：干燥气温度3000℃；电喷雾电压3.5kv；裂解电压175.0v；扫描范围为正离子模式(m/z150-1200)；电喷雾气压30psig；干燥气流速11l/min。
3)液相结果显示，经过酶促反应后，生成了单一的产物峰，根据保留时间确认产物极性明显增大；而不加udp-葡萄糖或者不加酶的空白对照均没有产物生成。质谱结果显示，发现产生[m+glc+h]+的离子碎片，沙蟾毒精糖基化产物的ms特征峰579.2658，产率90％；结果如图11所示。
4)为了进一步确认强心甾与葡萄糖的连接方式，对沙蟾毒精进行了制备反应。将各反应原料等比例放大用于制备足够量的反应产物，制备反应体系为：50mmtris-hcl(ph8.0)，26.4mgmgcl2，39.7mgudp-葡萄糖，10mg沙蟾毒精，最后加入17mg实施例2中的纯化后的糖基转移酶ugt74an1，总体积为52ml。37℃反应12h后终止反应。制备条件为：cosmosil5c18-ms-iipackedcolumn(250mm×10.0mmi.d.，5μm)；流速5ml/min；检测波长296nm；甲醇：水为流动相。取少量无杂质的转化产物溶于氘代甲醇，于400mhz核磁共振仪检测，确认产物为沙蟾毒精3-o-β-d-葡萄糖苷。该产物的结构，1hnmr及13cnmr图谱如图12～13所示。
1hnmr(cd3od,400mhz)δ:7.93(1h,dd,j＝9.7,2.2hz,h-22),7.54(1h,s,h-21),6.33(1h,d,j＝9.7hz,h-23),4.38(1h,d,j＝11.1hz,h-11),4.33(1h,d,j＝7.8hz,sugarh-1),4.16(t,j＝8.1hz,2h),4.08(1h,s,h-3),3.89-3.82(1h,m),3.69(1h,d,j＝5.5hz),3.66(1h,d,j＝5.4hz),3.47-3.12(7h,m),2.41(1h,d,j＝13.2hz),2.19-1.29(26h,m),1.19(3hs,h-19),0.92(3hs,h-18).13cnmr(cd3od,100mhz)δ:215.0(c-12),164.5(c-24),151.6(c-21),149.1(c-22),123.2(c-20),115.9(c-23),102.6(sugarc-1),86.2(c-14),78.2(sugarc-5),77.8(sugarc-2),75.5(sugarc-4),75.2(sugarc-2),75.0(c-11),71.7(c-3),63.8(c-13),62.81(sugarc-6),42.0(c-9),41.7(c-17),40.8(c-8),39.2(c-5),38.0(c-10),33.5(c-4),33.2(c-15),31.2(c-1),29.1(c-16),28.2(c-2),27.8(c-6),23.8(c-19),22.8(c-7),18.0(c-18).
实施例7糖基转移酶ugt74an1对蟾毒灵的糖基化修饰
1)糖基转移酶ugt74an1催化活性检测在1.5mlep管中进行，反应体系为：50mmtris-hcl(ph8.0)，5mmmgcl2，5mmudp-葡萄糖，1mm蟾毒灵，130μg纯化蛋白ugt74an1，总体积为200μl。反应条件为37℃，12h。同时以不加udp-葡萄糖或者不加酶的平行反应作为阴性对照。反应结束后，加入等体积的甲醇终止反应，14,000g离心30min。收集上清液作为反应后的终产物，用于hplc-dad/esi-ms分析。
2)hplc-dad/esi-ms分析由agilent1200液相系统串联agilent6210lc/msdtof离子阱质谱仪(esi离子源)完成，柱后分流比为1：10。其中hplc检测条件包括：ultimatepolarrpc18column(250mm×4.6mmi.d.，5μm)；检测波长为220nm及296nm；流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为乙腈；流速1ml/min；进样量10μl。梯度洗脱条件为：0～20min，10～75％b；20～21min，75～100％b；21～26min，100％b；26～29min，100～10％b；29～35min，10％b。质谱条件包括：干燥气温度3000℃；电喷雾电压3.5kv；裂解电压175.0v；扫描范围为正离子模式(m/z150-1200)；电喷雾气压30psig；干燥气流速11l/min。
3)液相结果显示，经过酶促反应后，生成了单一的产物峰，根据保留时间确认产物极性明显增大；而不加udp-葡萄糖或者不加酶的空白对照均没有产物生成。质谱结果显示，发现产生[m+glc+h]+的离子碎片，蟾毒灵糖基化产物的ms特征峰549.3093，产率95％；结果如图14所示。
4)为了进一步确认强心甾与葡萄糖的连接方式，对蟾毒灵进行了制备反应。将各反应原料等比例放大用于制备足够量的反应产物，制备反应体系为：50mmtris-hcl(ph8.0)，26.4mgmgcl2，39.7mgudp-葡萄糖，10mg蟾毒灵，最后加入17mg实施例2中的纯化后的糖基转移酶ugt74an1，总体积为52ml。37℃反应12h后终止反应。制备条件为：cosmosil5c18-ms-iipackedcolumn(250mm×10.0mmi.d.，5μm)；流速5ml/min；检测波长296nm；甲醇：水为流动相。取少量无杂质的转化产物溶于氘代甲醇，于400mhz核磁共振仪检测，确认产物为蟾毒灵3-o-β-d-葡萄糖苷。该产物的结构，1hnmr及13cnmr图谱如图15～16所示。
1hnmr(cd3od,400mhz)δ:8.03(1h,dd,j＝9.7,2.3hz,h-22),7.45(1h,d,j＝1.8hz,h-21),6.30(1h,d,j＝9.6hz,h-23),4.37(1h,d,j＝7.8hz,sugarh-1),4.12(1h,m,h-3),3.88(1h,d,j＝11.9,1.8hz),3.71(1h,dd,j＝5.4hz),3.40-3.20(4h,m),2.56-2.52(1h,m,h-17),2.26-2.11(2h,m),1.92-1.22(23h,m),1.09-1.01(2h,m),0.95(3h,s,h-19),0.73(3h,s,h-18)；13cnmr(cd3od,100mhz)δ:164.8(c-24),150.5(c-21),149.37(c-22),125.0(c-20),115.4(c-23),102.7(sugarc-1),86.1(c-14),78.2(sugarc-5),77.84(sugarc-2),75.6(sugarc-4),75.2(sugarc-3),71.8(c-3),61.7(sugarc-6),52.3(c-17),49.8(c-13),43.2(c-9),43.1(c-5),41.9(c-12),37.7(c-8),37.0(c-4),36.3(c-1),35.9(c-10),33.2(c-15),31.3(c-2),29.9(c-16),28.4(c-6),23.8(c-19),22.8(c-7),22.5(c-11),17.3(c-18).
实施例8糖基转移酶ugt74an1对3α-蟾毒灵的糖基化修饰
1)糖基转移酶ugt74an1催化活性检测在1.5mlep管中进行，反应体系为：50mmtris-hcl(ph8.0)，5mmmgcl2，5mmudp-葡萄糖，1mm3α-蟾毒灵，130μg纯化蛋白ugt74an1，总体积为200μl。反应条件为37℃，12h。同时以不加udp-葡萄糖或者不加酶的平行反应作为阴性对照。反应结束后，加入等体积的甲醇终止反应，14,000g离心30min。收集上清液作为反应后的终产物，用于hplc-dad/esi-ms分析。
2)hplc-dad/esi-ms分析由agilent1200液相系统串联agilent6210lc/msdtof离子阱质谱仪(esi离子源)完成，柱后分流比为1：10。其中hplc检测条件包括：ultimatepolarrpc18column(250mm×4.6mmi.d.，5μm)；检测波长为220nm及296nm；流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为乙腈；流速1ml/min；进样量10μl。梯度洗脱条件为：0～20min，10～75％b；20～21min，75～100％b；21～26min，100％b；26～29min，100～10％b；29～35min，10％b。质谱条件包括：干燥气温度3000℃；电喷雾电压3.5kv；裂解电压175.0v；扫描范围为正离子模式(m/z150-1200)；电喷雾气压30psig；干燥气流速11l/min。
3)液相结果显示，经过酶促反应后，生成了单一的产物峰，根据保留时间确认产物极性明显增大；而不加udp-葡萄糖或者不加酶的空白对照均没有产物生成。质谱结果显示，发现产生[m+glc+h]+的离子碎片，3α-蟾毒灵糖基化产物的ms特征峰549.3093，产率95％；结果如图17所示。
4)为了进一步确认强心甾与葡萄糖的连接方式，对3α-蟾毒灵进行了制备反应。将各反应原料等比例放大用于制备足够量的反应产物，制备反应体系为：50mmtris-hcl(ph8.0)，26.4mgmgcl2，39.7mgudp-葡萄糖，10mg3α-蟾毒灵，最后加入17mg实施例2中的纯化后的糖基转移酶ugt74an1，总体积为52ml。37℃反应12h后终止反应。制备条件为：cosmosil5c18-ms-iipackedcolumn(250mm×10.0mmi.d.，5μm)；流速5ml/min；检测波长296nm；甲醇：水为流动相。取少量无杂质的转化产物溶于氘代甲醇，于400mhz核磁共振仪检测，确认产物为3α-蟾毒灵3-o-β-d-葡萄糖苷，该产物的结构，1hnmr及13cnmr图谱如图18～19所示。
1hnmr(cd3od,300mhz)δ7.98(1h,dd,j＝9.7,2.5hz),7.48-7.31(2h,m),6.27(1h,d,j＝9.7hz),4.39(1h,d,j＝7.7hz,sugarh-1),3.84(1h,d,j＝11.9hz),3.82(1h,d,j＝1.5hz),3.80-3.69(1h,m,h-3),3.68-3.60(1h,m,),3.35(1h,s),3.27-3.23(2h,m),3.13(1h,t,j＝8.9hz),2.54(1h,m),2.23-2.00(2h,m),1.95-1.48(11h,m),1.48-0.96(10h,m),0.92(3h,s),0.69(3h,s).
13cnmr(cd3od,75mhz)δ:164.8(c-24),150.5(c-21),149.4(c-22),125.0(c-20),115.4(c-23),102.1(sugarc-1),86.1(c-14),79.6(sugarc-5),78.1(sugarc-2),77.9(sugarc-4),75.2(sugarc-3),71.7(c-3),62.8(sugarc-6),52.3(c-17),49.8(c-13),43.2(c-9),43.1(c-5),41.9(c-12),37.6(c-8),36.1(c-4),36.1(c-1),35.2(c-10),33.2(c-15),29.8(c-2),28.3(c-16),27.8(c-6),23.8(c-19),22.7(c-7),22.5(c-11),17.3(c-18).
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>暨南大学
<120>一种糖基转移酶及其克隆表达方法与应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>471
<212>prt
<213>马利筋(asclepiascurassavica)
<220>
<223>糖基转移酶ugt74an1氨基酸序列
<400>1
metglythrilegluileserserproarglysthrhisileleuala
151015
phepropheproalalysglyhisileasnprometleuhisleucys
202530
asnargleualaserlysglypheargvalserpheilethrthrile
354045
serthrtyrlysaspalalysasnlysilegluserlysserglygly
505560
leuileasnleugluserileproaspglythrglulyslysleuser
65707580
metserhistyrpheasnlyspheargaspservalthrgluasnval
859095
serglyileileglulystyrlysleuglyvalaspphepropropro
100105110
lysvalpheiletyraspserthrmetprotrpmetleuaspvalala
115120125
hisglyhisglyileleuglyalaserleuphethrglnprocyscys
130135140
valseralavaltyrtyrhismetleuglnglythrleuaspserser
145150155160
serserserserargvalserleuleuprocysleuproproleuglu
165170175
aspargaspleuproglupheasptyrphelysgluaspglygluphe
180185190
valserasnleuleuthrasnglnpheleuasnileasplysileasp
195200205
tyrvalleupheasnthrpheglulysleuglualagluilealaasn
210215220
trpmetserserlystrplysileleuthrileglyprothralapro
225230235240
thrprovalglyalaalaleugluthrgluglugluargileasnasn
245250255
tyrvalleugluthrasnthrgluvalcysmetlystrpleuasnglu
260265270
arggluproasnservaliletyrvalserpheglyserilealaser
275280285
leuthrgluleuglnmetglugluileleuglualaleuleualaala
290295300
asnpheasnpheleutrpvalvalarggluglugluargalalysleu
305310315320
proasntyrsergluserserserglyileilethrvalthrglylys
325330335
leuglyleuilevalasntrpcysproglnleugluvalleuserhis
340345350
gluserleualacysphemetthrhiscysglytrpasnserthrleu
355360365
glualaileserserglyvalvalmetileglyvalproglntrpval
370375380
aspglnthrthrasnalalyspheilegluaspvaltrplysilegly
385390395400
valargvallysasnasnserasnglygluasnglyglyleuvallys
405410415
lysglugluilegluargcysilelysgluvalcysgluserglulys
420425430
glylysgluleulysargasnalametlystrplysgluleualathr
435440445
glualavalsergluglyglyserseraspthrasnleuasptyrphe
450455460
alaserthrleuleuphetyr
465470
<210>2
<211>1416
<212>dna
<213>马利筋(asclepiascurassavica)
<220>
<223>糖基转移酶ugt74an1核苷酸序列
<400>2
atgggtacaatagagatatcttctccaagaaaaacccacattcttgcttttcctttccca60
gcaaaaggtcacataaatcctatgctacatttatgcaaccgtttggcttccaaaggtttt120
agagtcagctttatcacaactatctccacatacaaagatgccaaaaacaaaatcgaatcc180
aaatccgggggattaattaacctggaatcaattccagatgggactgagaagaaattaagt240
atgagccattatttcaacaagtttagagattctgtcacagaaaacgtatccggaatcatt300
gaaaagtacaaattaggagtcgatttcccacctccaaaggtttttatatatgattcaact360
atgccatggatgctagatgttgcacatggacatggaattcttggagcttcgttatttaca420
caaccatgttgtgtaagtgctgtttattaccatatgcttcaagggacattagattcttct480
tcatcttcttctagggtttcattactaccttgtttgccaccattggaggacagggattta540
cctgaattcgattactttaaggaagatggtgaatttgtttcgaatctgcttacgaatcaa600
ttcttgaatattgacaagattgattacgttctcttcaatacttttgaaaagttggaggcc660
gagatagcaaattggatgtccagcaaatggaaaatcttgactatcggaccgacagctccg720
acccccgtcggagccgcccttgagacggaggaggagagaatcaacaattatgtcttggaa780
acaaatacagaagtatgtatgaaatggttaaacgaaagagaaccaaattcagtaatctac840
gtatcatttggaagcatagcttcattaacagaattacaaatggaagaaattctggaagct900
ttattagcagcaaattttaattttttatgggttgttcgggaagaagaaagagctaagctt960
ccaaattactcggaatcctcctccggcatcatcaccgtcaccggaaaattaggtttgata1020
gtaaactggtgtccacagctggaagttttgtcgcatgaatctctagcatgttttatgaca1080
cactgtggttggaattcgacgttggaagcaataagctccggcgtggttatgatcggcgtg1140
ccacaatgggtggatcaaacgacaaatgctaagttcatagaagatgtatggaagattgga1200
gttcgagttaagaataacagtaatggtgaaaatggtggattggtgaagaaggaagaaata1260
gagagatgtataaaagaagtgtgtgagagtgagaaagggaaggaattgaaaaggaatgct1320
atgaaatggaaagaattggctacagaagctgtcagtgaaggtggaagttctgatacaaat1380
ttggactattttgcttctactcttttgttttactag1416