一种用于检测EGFR基因突变的扩增引物、测序引物、试剂盒和方法与流程

本发明属于生物检测
技术领域：
，更具体地，本发明涉及一种用于检测egfr基因突变的扩增引物、测序引物、试剂盒和方法。
背景技术：
：egfr(epidermalgrowthfactorreceptor)是上皮生长因子(egf)细胞增殖和信号传导的受体。egfr属于erbb受体家族的一种，该家族包括egfr(erbb-1),her2/c-neu(erbb-2),her3(erbb-3)和her4(erbb-4)。egfr也被称作her1、erbb1，突变或过表达一般会引发肿瘤。egfr是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，细胞膜贯通，分子量170kda。egfr位于细胞膜表面，靠与配体结合来激活，包括egf和tgfα(transforminggrowthfactorα)。激活后，egfr由单体转化为二聚体，尽管也有证据表明，激活前也存在二聚体。egfr基因由28个外显子组成。其酪氨酸激酶功能区由外显子18-24编码，迄今为止发现的egrf基因突变主要位于外显子18-21。肺癌是我国发病率和死亡率最高的癌症，其中非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)约占所有肺癌的80％。egfr酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼和厄洛替尼，能特异性地抑制具有egfr基因突变的非小细胞肺癌的生长，改善预后。因此，在使用酪氨酸激酶抑制剂治疗前，《非小细胞肺癌临床实践指南》推荐进行egfr的突变检测。目前市场主要的检测技术有：egfr基因突变的检测主要有sanger测序法、arms、fish等。其中fish技术主要适用于拷贝数变异的检测，同时由于操作过程繁琐，该方法以逐渐显现其局限性；arms技术是目前国内应用最为广泛的技术，但只能检测已知的位点，且要将样本分成多个管进行实验才能实现分型，对样本量要求高；而sanger测序法是dna序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取dna的序列，因此被认为是基因分型的金标准，其主要优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。所以探索一种sanger测序法检测egfr基因的技术具有重要的临床意义。技术实现要素：基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种用于检测egfr基因突变的扩增引物、测序引物、试剂盒和方法。为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：一种用于检测egfr基因突变的扩增引物，所述扩增引物包括：针对egfr基因exon18突变的seqidno:1和seqidno:2、针对egfr基因exon19突变的seqidno:3和seqidno:4、针对egfr基因exon20突变的seqidno:5和seqidno:6、以及针对egfr基因exon21突变的seqidno:7和seqidno:8。本发明还提供了一种用于检测egfr基因突变的测序引物，所述测序引物包括：针对egfr基因exon18突变的seqidno:9、针对egfr基因exon19突变的seqidno:10、针对egfr基因exon20突变的seqidno:11、以及针对egfr基因exon21突变的seqidno:12。本发明还提供了一种检测egfr基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括上述扩增引物和测序引物。在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括ung(udg)/dutp体系，ung(udg)/dutp体系是一种防污染体系，能消除因pcr产物污染引起的假阳性检测结果。在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括热启动taq酶，热启动taq酶采用化学修饰，经95℃热激15分钟，taq酶才能发挥作用，热启动taq酶可减少引物二聚体的形成增加反应特异性。在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括质控品，所述质控品为egfr阴性质控品、egfr野生型阳性质控品、egfrexon19突变型阳性质控品、和egfrexon18突变型阳性质控品。本发明还提供了检测egfr基因突变的方法，使用上述试剂盒进行检测，包括以下步骤：(1)、提取、纯化待测样品中的dna；(2)、以上述dna作为模板，利用扩增引物进行pcr扩增，获得扩增产物，纯化扩增产物；(3)、利用测序引物对上述pcr扩增产物进行测序pcr反应，对测序pcr反应后的产物进行sanger测序，确定egfr基因突变位点。在其中一些实施例中，步骤(2)中所述pcr扩增的反应体系为：egfrpcr反应液37ul、酶反应液3ul、模板10ul；所述egfrpcr反应液包括10xpcrbuffer5ul、25mmmgcl20.5ul、25mmdntps1ul、h2o30.5ul；所述酶反应液包括ung酶0.1ul、热启动tag酶0.5ul，余量为超纯水和甘油。在其中一些实施例中，步骤(2)中所述pcr扩增的反应程序为：50℃2min；95℃15min预变性；94℃30s、55℃30s、72℃45s，40个循环；72℃7min。在其中一些实施例中，步骤(3)中所述测序pcr反应的反应体系为：pcr扩增产物(根据配制的浓度计算所需的体积)10-50ng、bigdye(abi)2ul、bigdyesequencingbuffer(abi)3ul、测序引物1ul、无菌纯化水加至20ul。在其中一些实施例中，步骤(3)中所述测序pcr反应的反应程序为：96℃1min；96℃10s、50℃5s、60℃4min，25个循环；4℃保温。双脱氧终止法是上个世纪70年代由弗雷德·桑格尔发明的，他因此于1980年再度获得了诺贝尔奖。2001年，allanmaxam和waltergibert发明了sanger测序法。sanger测序利用双脱氧终止法，即在sanger测序反应中，利用碱基互补的原则合成新的dna链，然而在测序引物延伸的过程中，如果遇到带有荧光标记的双脱氧核苷酸(ddntp)时，dna的合成就会终止，产生长短不一，带有荧光标记的dna片段。复制的dna片段带有负电荷，在毛细管电泳中会朝正极移动。不同长度的片段移动速度不同，因此到达检测窗口的时间也不同。当dna片段通过检测窗口时，被标记的ddntp的荧光被激活产生不同颜色的信号，从而读取原始dna序列上每个位置的碱基序列。sanger测序是目前使用最普遍的dna序列分析技术，可分析未知dna序列，且单向反应的读序能力较长，是行业内金标准，准确度高。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1、本发明的检测egfr基因突变的引物是针对egfr基因exon18、19、20和21四个外显子的保守序列，设计特异性引物，特异性强，灵敏度高；2、本发明的检测egfr基因突变的方法采用独创的引物进行扩增测序，可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过sanger测序法检测出样本中egfr基因主要突变位点型别，检测位点包括egfr基因18、19、20和21四个外显子的29个突变位点，且能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。附图说明图1是本发明的检测egfr基因突变方法的流程图；图2～5是试验例1中使用本发明的方法对egfr野生型阳性质控品的检测结果图；图6是试验例2中使用本发明的方法对egfr19号外显子突变型阳性质控品的检测结果图；图7是试验例3中使用本发明的方法对egfr21号外显子突变型阳性质控品的检测结果图；图8是试验例4中使用本发明的方法对未知样品的检测结果图。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。本发明中所涉及的专业术语解释如下：ddntp:双脱氧核苷酸egfr:上皮生长因子细胞增殖和信号传导的受体sanger测序:双脱氧链终止法pcr：聚合酶链式反应实施例1检测egfr基因突变的引物基于sanger测序技术的egfr基因突变检测的引物，包括扩增引物和测序引物。根据egfr基因在肺癌等疾病中的突变情况及个体化治疗后产生的耐药机制，利用引物设计软件，如primerpremier5，从egfr基因dna序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计egfr基因exon18、19、20和21四个外显子的特异性引物，用于扩增样本中dna。引物序列分别是seqidno：1-8。用于测序pcr产物的测序引物，测序引物的设计与用于扩增样本中dna的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一条即可，引物序列是seqidno：9～12，长度在17-25个碱基。实施例2检测egfr基因突变的试剂盒本实施例的检测egfr基因突变的试剂盒包括下表组分：`1、pcr检测试剂，包括扩增引物(具有如seqidno:1和seqidno:2所示的碱基序列)、tris盐酸buffer、热启动taq酶(热启动taq酶采用化学修饰，经95℃热激15分钟，taq酶才能发挥作用，热启动taq酶可减少引物二聚体的形成增加反应特异性)。2、pcr测序试剂，包括测序引物(具有如seqidno:3所示的碱基序列)、测序染料(bigdye)、测序反应液(bigdyesequencingbuffer)、高纯度去离子甲酰胺(hi-diformamide)3、质控品，包括egfr阴性质控品、egfr野生型阳性质控品、egfr12号密码子突变型阳性质控品、egfr13号密码子突变型阳性质控品；4、ung(udg)/dutp体系，ung(udg)/dutp体系是一种防污染体系，能消除因pcr产物污染引起的假阳性检测结果。实施例3检测egfr基因突变的方法请参阅图1，为本发明检测egfr基因突变的方法的操作流程图；本实施例的检测egfr基因突变的方法包括以下步骤：1、pcr扩增从试剂盒中取出egfrpcr反应液(18-21)、egfr酶系，室温融化后震荡混匀，8000,rpm离心数秒后使用。18、20外显子测序：取n个(n＝待测样本个数+egfr阴性质控品+egfr野生型阳性质控品)反应管19外显子测序：取n个(n＝待测样本个数+egfr阴性质控品+egfr野生型阳性质控品+egfr突变型阳性质控品(19))反应管21外显子测序：取n个(n＝待测样本个数+egfr阴性质控品+egfr野生型阳性质控品+egfr突变型阳性质控品(21))反应管单人份egfr18-21外显子pcr扩增体系配制如下表:组分egfr(18-21)反应液egfr酶系总体积用量37μl3μl40μl将各组分充分混合，混合好后进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底，之后将40μl扩增体系分装到pcr管中。2、加样(样本制备区)往上述pcr反应管中用带滤芯吸嘴分别加入提取后的待测样本核酸、egfr阴性质控品、egfr野生型阳性质控品、egfr突变型阳性质控品(19)、egfr突变型阳性质控品(21)各10μl。盖紧管盖，8,000rpm离心数秒后转移至扩增区。3、pcr扩增(扩增区)将各反应管放入pcr仪，按下列条件扩增：50℃2分钟，95℃15分钟预变性，然后按(94℃30秒→55℃30秒→72℃45秒)×40个循环扩增；最后72℃延伸7分钟。4、产物纯化(产物分析区)pcr扩增结束以后，取5μlpcr产物进行1-2％琼脂糖凝胶电泳，观察是否有目的条带扩增(18外显子pcr目的条带大小为382bp；19外显子pcr目的条带大小为297bp；20外显子pcr目的条带大小为390bp；21外显子pcr目的条带大小为304bp)，如观察到明显的单一目的条带，则将上述pcr产物及时进行纯化，具体操作详见pcr产物纯化试剂盒说明书。按试剂盒步骤纯化获得的pcr产物进行电泳鉴定定值(pcr产物浓度范围为10-50ng)，可立即进行测序pcr或置于-20±5℃保存备用(保存时间不要超过2天)。5、测序pcr经过电泳鉴定定值的pcr产物，按下述表格配制测序pcr体系：试剂用量pcr产物xμl(约10-50ng)bigdye2μlbigdyesequencingbuffer3μl测序引物1μl无菌纯化水14-xμl总体积20μl无菌纯化水用量视pcr产物加入体积而定，总体积应为20μl。将各反应管放入定性pcr仪，按下列条件扩增：96℃1分钟→(96℃10秒→50℃5秒→60℃4分钟)×25个循环→4℃保温。6、测序pcr产物纯化后的核酸即可用于测序7、加样：变性后的测序产物加入与基因分析仪配套的96孔板，盖好，按加样顺序编辑样品列表。根据测序仪型号选用具有ivd标志的seq_std_bdtv3.1_assyxl_pop7或seq_std_bdtv3.1_assy_pop7进行测序。使用abi基因分析仪时，应用abi公司data与sequencinganalysis软件进行数据收集和分析。data与sequencinganalysis分析软件的进一步信息请参阅data与analysissoftware用户手册。测序结果自动保存在预设位置，反应结束后打开测序结果进行分析，得到.ab1、.phd.1格式的文件。8、结果分析8.1运行seqscanner程序，导入测序结果。8.2(1)egfr外显子18：按find快捷键，找到序列“caaagtgctg”。(2)egfr外显子19：按find快捷键，找到序列“tatcaa”。(3)egfr外显子20：按find快捷键，找到序列“gtgatggcca”；找到序列“ctcatca”。(4)egfr外显子21：按find快捷键，找到序列“gattttgggc”。如果不能找到此序列，可能样本序列个别碱基发生突变情况，应校正后重新查找。8.3突变分析：(1)egfr外显子18：从找到的序列往后的第1-3个碱基，野生型为ggc；否则为egfr外显子18突变，详细如下表。(2)egfr外显子19：从找到的序列往后的第1-12个碱基，野生型为ggaattaagaga；否则为egfr外显子19突变，详细如下表。(3)egfr外显子20：从找到的序列往后的第1-21个碱基，野生型为gcgtggacaacccccacgtgt；从找到的序列往后的第1个碱基，野生型为c；否则为egfr外显子20突变，详细如下表。(4)egfr外显子21：从找到的序列往后的第1个碱基和第10个碱基，野生型为t；否则为egfr外显子21突变。详细如下表。试验例1使用本发明的方法对egfr野生型阳性质控品进行检测使用本发明实施例3的检测方法，对野生型阳性质控品(细胞核酸，自制)进行检测。1.运行seqscanner程序，导入测序结果。2.(1)egfr外显子18：按find快捷键，找到序列“caaagtgctg”。(2)egfr外显子19：按find快捷键，找到序列“tatcaa”。(3)egfr外显子20：按find快捷键，找到序列“gtgatggcca”；找到序列“ctcatca”。(4)egfr外显子21：按find快捷键，找到序列“gattttgggc”。如果不能找到此序列，可能样本序列个别碱基发生突变情况，应校正后重新查找。3.突变分析：(1)egfr外显子18：从找到的序列往后的第1-3个碱基，野生型为ggc；否则为egfr外显子18突变。(2)egfr外显子19：从找到的序列往后的第1-12个碱基，野生型为ggaattaagaga；否则为egfr外显子19突变。(3)egfr外显子20：从找到的序列往后的第1-21个碱基，野生型为gcgtggacaacccccacgtgt；从找到的序列往后的第1个碱基，野生型为c；否则为egfr外显子20突变。(4)egfr外显子21：从找到的序列往后的第1个碱基和第10个碱基，野生型为t；任一个t突变则为egfr外显子21突变。结果分析：由该样本egfr18,19,20,21外显子测序结果判断，该样本为egfr野生型，结果如图2～5所示。试验例2使用本发明的方法对egfr外显子19突变型阳性质控品进行检测使用本发明实施例3的检测方法，对egfr外显子19突变型阳性质控品进行检测。1.运行seqscanner程序，导入测序结果。2.egfr外显子19：按find快捷键，找到序列“tatcaa”从找到的序列往后的第1-12个碱基，野生型为ggaattaagaga；否则为egfr外显子19突变。结果分析：由该样本egfr19外显子测序结果判断，该样本为egfr外显子19突变型，结果如图6所示。试验例3使用本发明的方法对egfr外显子21突变型阳性质控品进行检测使用本发明实施例3的检测方法，对egfr外显子21突变型阳性质控品进行检测。1.运行seqscanner程序，导入测序结果。2.egfr外显子21：按find快捷键，找到序列“gattttgggc”从找到的序列往后的第1个碱基和第10个碱基，野生型为t；任一个t突变则为egfr外显子21突变。结果分析：由该样本egfr21外显子测序结果判断，该样本为egfr外显子21突变型，结果如图7所示。试验例4使用本发明的方法对未知样品进行检测使用本发明实施例3的检测方法，对待检临床标本(非小细胞肺癌患者石蜡包埋肺部癌组织)进行检测。1.运行seqscanner程序，导入测序结果。2.(1)egfr外显子18：按find快捷键，找到序列“caaagtgctg”。(2)egfr外显子19：按find快捷键，找到序列“tatcaa”。(3)egfr外显子20：按find快捷键，找到序列①“gtgatggcca”；找到序列②“ctcatca”。(4)egfr外显子21：按find快捷键，找到序列“gattttgggc”。如果不能找到此序列，可能样本序列个别碱基发生突变情况，应校正后重新查找。3.突变分析：(1)egfr外显子18：从找到的序列往后的第1-3个碱基，野生型为ggc；否则为egfr外显子18突变。(2)egfr外显子19：从找到的序列往后的第1-12个碱基，野生型为ggaattaagaga；否则为egfr外显子19突变。(3)egfr外显子20：从找到的序列①往后的第1-21个碱基，野生型为gcgtggacaacccccacgtgt；从找到的序列②往后的第1个碱基，野生型为c；否则为egfr外显子20突变。(4)egfr外显子21：从找到的序列往后的第1个碱基和第10个碱基，野生型为t；任一个t突变则为egfr外显子21突变。结果分析：由该样本egfr18,19,20,21外显子测序结果判断，该样本为egfr野生型21外显子l858r突变型，结果如图8所示。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表<110>广州立菲达安诊断产品技术有限公司<120>一种用于检测egfr基因突变的扩增引物、测序引物、试剂盒和方法<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>25<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>1ctgtgtttctaccaacttctgtcaa25<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>2tccccaccagaccatgag18<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>3agatcactgggcagcatgt19<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>4gacatagaaagtgaacatttaggat25<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>5ccctgcgtaaacgtccct18<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>6ctcccctccccgtatctc18<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>7tcagtagtcactaacgttcgcc22<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>8tccttactttgcctccttctg21<210>9<211>18<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>9tccccaccagaccatgag18<210>10<211>25<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>10gacatagaaagtgaacatttaggat25<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>11ctcccctccccgtatctc18<210>12<211>21<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>12tccttactttgcctccttctg21当前第1页12