一个梨组成型表达启动子PbTMT4P及其应用的制作方法

本发明属于植物生物技术领域，涉及一个梨组成型表达启动子pbtmt4p及其应用。

背景技术：

启动子(promoters)就像“开关”，决定基因的活动，外源dna序列通过连接到特定的启动子从而启动在植物宿主中的表达，启动子类型的不同决定了基因的表达特性的不同。用于植物基因工程的启动子常根据其作用方式及功能分为三类：组成型启动子(在多数或全部组织中保持持续的活性)、特异型启动子(组织特异性或者发育时期的特异性)和诱导型启动子(受外界化学或物理信号调控)。目前，农业生物技术领域广泛应用的主要是一些组成型的强启动子,高活性的组成型启动子在植物基因功能研究和遗传改良中具有很好的应用前景。

组成型启动子(constitutivepromoter)能够使基因在所有组织中都能启动表达，所启动基因的表达具有持续性，但不表现出时空和器官特异性、不受外界因素的诱导。目前，在植物基因工程改良中使用最普遍的组成型启动子主要有花椰菜花叶病毒camv35s启动子、根癌农杆菌ti质粒的胭脂碱合成酶基因nos启动子、水稻actin启动子以及玉米泛素蛋白ubiquitin启动子。camv35s启动子和nos启动子能够驱动外源基因在大部分植物中表达，如在转基因水稻、拟南芥、小麦等植物的研究中均有应用，然而这两个启动子毕竟不是来源植物，因此在植物基因工程中应用这些启动子在生物安全性方面存在一定争议。有研究表明内源型启动子在驱动转基因盐藻外源基因的高效表达中比外源启动子更具有优势。因此，克隆植物内源组成型启动子非常重要。

组成型启动子为植物基因工程中应用最早、最广泛的一类启动子。在转基因育种或研究基因功能时，为了充分发挥外源基因表达产物的功能，一般都使用组成型启动子使外源基因在植物中高效、稳定、持久地表达。为了避免同时使用同一个启动子驱动2个或2个以上的外源基因而导致基因沉默或共抑制现象，需要用到不同的启动子分别驱动不同的外源基因、筛选基因和报告基因。虽然在先前的工作中也已经分离得到一些组成型启动子，但这些还远远不够，还需要我们做大量的工作。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种从梨中分离的组成型表达启动子。

本发明的目的之二是提供含有上述组成型表达启动子的表达盒、表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。

本发明的目的之三是将所述的组成型表达启动子以及含有该启动子的表达载体应用于调控异源核苷酸序列在植物中的转录或表达。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种分离的组成型表达启动子，所述启动子包含seqidno:1所示的核苷酸序列，或者与seqidno:1互补的核苷酸序列。该启动子可以驱动操作性连接的核苷酸序列在植物各器官中的组成型表达。

本文中“启动子”一词指dna调控序列，其中通常含有一个tata盒，该序列能够指导rna聚合酶ii在合适的转录起始位点上起始特定编码序列的转录。启动子也可另外含有其他识别序列，它们通常位于tata盒的上游或5'端，被称作上游启动子元件，这些元件能够影响转录速率。应认识到当鉴别了本文所公开的启动子区域的核苷酸序列后，分离并鉴定位于本文所鉴别的特定启动子区域上游的其它调控元件就属于现有技术范围了。因此,本文公开的启动子区域可另外包含上游调控元件，如负责组织特异性和时间特异性表达的元件、调控组成型表达的元件和增强子等。

本文中的“组成型表达”是指目的基因在个体各个生长阶段的几乎全部组织中持续表达或变化很小这类基因的表达方式。本发明所提供的pbtmt4p启动子就是一个在植物的各个发育阶段的根、茎、叶和花等组织器官中都有较强表达的组成型启动子。

启动子的活性和强度可以根据其驱动的报告基因的mrna或蛋白质的表达量来测定。报告基因(reportergene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来确定目的基因的表达调控特性。常用的报告基因有β-葡萄糖苷酸酶基因gus和绿色荧光蛋白基因gfp。

本发明通过报告基因gus来检测启动子的活性和表达特性。根据gus基因检测所用的底物不同，有三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法，其中最为常用的是组织化学法。组织化学法检测以5-溴-4-氯-3吲哚-β-葡萄糖苷酸(x-gluc)作为反应底物。将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞转入了gus基因，并表达出了gus酶蛋白，在适宜的条件下，该酶就可将x-gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用形成的靛蓝染料，它使各组织细胞中有gus表达活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出gus活性的强弱。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。

一种表达盒，包含本发明所述的组成型表达启动子和待驱动的异源核苷酸序列。

一种表达载体，含有本发明所述的组成型表达启动子。

一种制备转基因植物或其衍生物的方法，是将本发明所述的表达盒转入宿主植物。

所述的植物优选双子叶植物；进一步优选梨。

所述转基因植物的衍生物优选所述转基因植物的种子、组织或者细胞的至少一部分。

所述的方法优选通过农杆菌介导法，在植物的至少一部分中引入本发明所述的表达载体。

本发明所述的启动子的应用,包括用于在植物中组成型表达与其操作性相连的目的基因，所述启动子的核苷酸序列如seqidno:1所示。

一种用于扩增本发明所述的启动子的引物对，由seqidno:2所示的引物1和seqidno:3所示的引物2组成。

在一些实施方式中，包括(a)将核苷酸序列可操作地连接于包括seqidno：1的启动子，以产生表达盒；和(b)生成含有该表达盒的转基因植物，由此在植物中表达所述核苷酸。在一些实施方式中，所述“生成”包括用表达盒转化植物细胞并从所转化的植物细胞中再生出植物。

本发明的实施案例中也包括dna载体，该载体含有操作性连接于异源核苷酸序列上的启动子，该启动子含有本发明公开的序列，并可在植物细胞中驱动上述异源核苷酸序列进行表达。本发明的实施方案还提供了表达载体，以及在基因组中稳定包含上述dna载体的植物或植物细胞。“操作性连接”指使异源核苷酸序列处于启动子作用下的连接方式，也指将两个核苷酸序列连接起来从而使每个dna片段的编码序列都保持在适当的阅读框内。“异源核苷酸序列”指天然状态下没有与本文所述启动子序列pbtmt4p操作性连接的序列，对于植物宿主来说可以是同源的，或是异源的。

本文所公开的pbtmt4p植物组成型表达启动子及其变异体和片段可用于植物基因工程，例如制备转化或转基因植物，以产生目的表型。“转化植物”或“转基因植物”，指在基因组内含有异源核苷酸序列的植物。通常转化植物或转基因植物基因组稳定含有这些异源核苷酸序列，可将该异源核苷酸序列稳定地遗传给下一代。这些异源核苷酸序列可单独或与重组dna载体一起存在于基因组中。这里所述的“转基因事件”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物体部分或完整植物体，只要它们的基因型被外源核酸的存在而改变，包括通过转基因操作而改变的起始宿主，以及通过这些起始宿主进行有性或无性繁殖所得的后代。这里所用的“转基因事件”并不包括通过传统植物种植方法或天然事件(例如随机杂交、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)改变了基因组(染色体或染色体外)的植物。

“转基因事件”通过以下步骤获得，使用外源dna载体(含有核酸表达盒，其中含有本发明所提供的启动子序列)转化植物细胞，用基因组插入了外源dna构建体的植物细胞再培养获得大量植物体，根据插入的外源基因进行筛选获得所需的阳性转基因系。转基因事件的典型表型特征是目的基因的表达。在遗传水平上，“目的基因”是植物基因组组成的一部分。“转基因事件”也指转基因植物体与其它植物体进行杂交所得的含有外源dna的后代。

本文的“植物”包括整株植物、植物组织器官(如叶、根、茎等)、种子、植物细胞,以及它们的后代。实施方案中转基因植物的部分植株应理解为包括转基因植物或其后代的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚，及从转基因植物或其后代长出的花、茎、果实、胚珠、叶或根等。

这里所用的“植物细胞”包括但不限于种子悬浮培养物、胚芽、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子、花粉、孢子体和小孢子。可用于本文所公开方法的植物种类包括所有可进行转化的高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物。

本文所公开的启动子序列可在宿主植物中调控任何异源核苷酸序列的表达。因此，所述的异源核苷酸序列可以是操作性连接于本文所公开的启动子之上的功能基因(编码目的蛋白)。实施方案中的功能基因包括参与信号传导调控的基因如转录因子、激酶等,持家基因如热休克蛋白基因。更具体地说，转基因的种类包括如，所编码蛋白赋予植物耐受非生物逆境和生物逆境的抗性基因，所述非生物逆境包括干旱、温度、盐和毒素(杀虫剂和除草剂)等，所述生物胁迫包括真菌、病毒、细菌、昆虫和线虫的侵害，以及由这些胁迫引起的疾病。或是所编码蛋白属生长发育相关基因，如细胞分化蛋白基因、成熟控制基因、矿质离子及大分子物质转运蛋白基因等。表型的编码包括改变植物中某个基因的表达，从而改变植物对病原体或昆虫等的防御机制，或是增强植物对某种生长必需物质的转运能力，根据环境改变植物的生长发育过程等。这些改变可通过在植物体内表达外源基因或提高内源特定基因的表达来获得。或者是通过降低植物体内一个或多个内源基因的表达产物，如酶、转运蛋白、辅因子等，通过影响植物的代谢机制来获得相应的表型。

由上可见，可将任何目的基因操作性连接到实施方案中的启动子序列上，并在植物体中进行表达。

其中根据rna干扰技术(rnainterference，rnai)，操作性连接于本文所公开的pbtmt4p启动子上的异源核苷酸序列,可以是某些靶基因的反义序列。“反义核苷酸序列”指一段与靶基因核昔酸序列互补的双链dna分子。当导入到植物细胞中后，反义dna序列的转录能阻止靶基因dna序列的正常表达。反义核苷酸序列编码的转录产物可与靶基因转录生成的内源mrna互补,并可与其杂交，由此，靶基因编码的天然蛋白的合成就受到限制，从而获得相应的表型。

有益效果：

本发明提供了一种来源于梨的组成型启动子，能够在宿主植物中调控任何异源核苷酸序列的表达。在植物的根、茎、叶和花等器官中都表现很强的活性，在植物转基因领域具有很好的应用前景。

附图说明

图1为载体pb35s：：gfpxb-4的结构示意图。

图2是表达载体pb35s：：gfpxb-4-pbtmt4p的结构示意图。lb和rb分别为t-dna的左边界和右边界，hygromycin(hyg)表示潮霉素抗性基因，gus表示gus蛋白基因，35spola表示35s基因的终止子，hindiii和bamhi表示限制性内切酶hindiii和bamhi的酶切位点，启动子即为本发明所分离鉴定的组成型表达启动子pbtmt4p。

图3是pbtmt4p驱动的gus基因在拟南芥的幼苗、叶、茎、花和果荚器官的表达情况，其中se表示幼苗、r代表根、st代表茎、l代表叶、fr代表花、fp代表果荚，wt表示野生型株系，a、b、c分别代表三个不同的转基因拟南芥的株系。

图4是转基因拟南芥的pbtmt4p表达特性分析，图为转基因拟南芥gus基因在不同组织器官中的rt-pcr检测，其中r代表根、st代表茎、l代表叶、fr代表花，fp代表果荚。

具体实施方案

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由北京擎科生物技术有限公司合成，测序由南京一道生物科技有限公司完成，试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶、t4dna连接酶购自康为世纪生物科技有限公司,peasy-t1连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体pb35s：：gfpxb-4由本实验改造所得(载体的结构示意图为图1所示)，hindiii到ecori之间的片段来源于pbi101.3。

实施例1

(1)启动子pbtmt4p的分离和鉴定

设计克隆启动子pbtmt4p所需引物：

引物1：5’ccaagctttaaatctaagacctctcg3’(seqidno:2)

引物2：5’cgggatccttttccactcaaaaataaaaaccaattgcaacc3’(seqidno:3)

引物1中序列aagctt为hindiii的酶切位点，cc为保护碱基；引物2ggatcc为bamhi的酶切位点，cg为保护碱基。

利用启动子的正反向引物(其中带下划线部分的序列为启动子序列)，以植物基因组提取试剂盒(南京有晴生物科技有限公司)提取的砀山酥梨基因组作为模板，进行扩增，反应条件是：95℃预变性3分钟；94℃变性30秒,62℃退火30秒,72℃延伸1.5分钟；35个循环；72℃延伸10分钟。反应结束后,pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入peasy-t1，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明所扩增序列为pbtmt4p启动子序列，其核苷酸序列如seqidno:1所示。

(2)表达载体的构建

将测序验证已经插入pbtmt4p启动子序列的质粒用hindiii和bamhi双酶切，连入同样用hindiii和bamhi双酶切的载体pb35s：：gfpxb-4，挑取菌落结果为阳性的菌落进行测序，测序验证正确后，提取相应阳性克隆质粒，命名为pb35s：：gfpxb-4-pbtmt4p。

所构建的表达载体的t-dna的图谱如图2所示，其中：lb和rb分别为t-dna的左边界和右边界，hyg表示潮霉素抗性基因，gus表示gus蛋白基因，35spola表示35s基因的终止子，hingiii和bamhi表示限制在内切酶hindiii和bamhi的酶切位点，启动子即为本发明实施例1中通过pcr克隆出的组成型表达启动子。

(3)农杆菌转化

利用热激法将质粒pb35s：：gfpxb-4-pbtmt4p转入农杆菌gv3101菌株，利用农杆菌介导法对拟南芥进行转化。

(4)转基因拟南芥的gus染色和活性鉴定

从转基因拟南芥植株中挑选几株幼苗，进行gus活性检测，将幼苗置于含有gus染色缓冲液的ep管中，放于37℃温箱温育过夜，然后室温条件下在无水乙醇中脱色保存。

结果如图3所示,拟南芥幼苗呈现很强的表达活性，幼苗对应株系的根、花、茎、叶、果荚的染色结果也呈现出很强的表达活性，说明启动子pbtmt4p驱动的gus基因在植物的各个组织器官中都有强的表达，是一个组成型表达启动子。

(5)转基因拟南芥的rt-pcr分析

为了进一步确定pbtmt4p启动子是否呈组成型表达，我们对其转基因苗进行了rt-pcr分析，收集转基因拟南芥植株纯系的根、茎、叶、果荚和花器官，提取rna，反转录为cdna作为模板，以拟南芥actin基因作为内参照，分析pbtmt4p启动子驱动的gus报告基因在转基因拟南芥中的表达情况，结果如图4所示。

rt-pcr的检测引物是：

引物3：5’gctctacaccacgccgaacacctg3’(seqidno:4)

引物4：5’tcttcagcgtaagggtaatgcgaggta3’(seqidno:5)

引物5：5’ttgagaccttcaatgtgcctg3’(seqidno:6)

引物6：5’ccagcagcttccattcca3’(seqidno:7)

其中，引物3和引物4是gus基因的检测引物，其扩增片段大小为483bp。引物5和引物6是拟南芥内参基因actin的分析引物，其扩增片段大小为199bp。

pcr检测体系和程序是：

pcr反应条件：94℃,预变性3分钟；94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃,延伸30秒；28个循环,72℃,10分钟。

反应结束后，对pcr产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图4所示，在转基因植株中，gus基因在根、茎、叶、果荚和花等器官中都呈现出很强的表达，并且表达量很高且各个组织器官间没有明显差异。这再一次表明，本发明的启动子能够在转基因植株中驱动操作性连接于其下游的目的基因表达，而且这种表达具有组成型表达的特性。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一个梨组成型表达启动子pbtmt4p及其应用

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1220

<212>dna

<213>梨(pyrusbretschneideri)

<400>1

taaatctaagacctctcgaatttacaagtaaaaataaataccataagatcgtagtaataa60

gtagcatatcattgctttagtttaaggcttcttcttttcttaatacaagattgatttgag120

ctaatacatgtcctacacgcttacaggtacagggactctgatatttacacaaacaaatcc180

cagttaaattattaaaaaattctgctaaacatgcttttgatttgatttacctttttattg240

gtcttgtccattacgtaataatggcattaattgaagatttgaaagtgggaaatattcaag300

agctgagctgggttggtgctgttgtgctgtcctctacagagactgcaggccaatcgttat360

gaatttcttttaattttttaccaaatctttatttttagcaaattctttaagttttttttc420

tttatatttcttttggtttgttaaacttaaacctacacggccttggttcagctggttctc480

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ttataaaaaaaaaaaaagtgaaaatatcatctgcaaagagtcaaagtctcgaactcctga900

cggtgtcgtgtcattcgaagacagacgcacacaacagaacagacccactatcaatcaaac960

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ttttatttttgagtggaaaa1220

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ccaagctttaaatctaagacctctcg26

<210>3

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cgggatccttttccactcaaaaataaaaaccaattgcaacc41

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gctctacaccacgccgaacacctg24

<210>5

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tcttcagcgtaagggtaatgcgaggta27

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ttgagaccttcaatgtgcctg21

<210>7

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ccagcagcttccattcca18