一种“三角电子推‑拉”线粒体靶向型检测SO2的荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于分析化学领域，涉及一种“三角电子推-拉”线粒体靶向型检测so2的荧光探针及其制备方法和应用。适用于生物样本中so2的定性、定量分析，实时监测细胞线粒体中so2的改变。

背景技术：

近年来，功能化荧光染料在生物和医学方面的研究成为热门领域之一。其中，荧光探针具有结构可控、合成成本低、基于不可逆的化学反应识别等优点，能实现实时的细胞成像。然而，在生物环境的实际应用中，有机荧光探针的功效会受到诸如灵敏度、特异性、响应时间等问题的限制。

哺乳动物细胞总是处于氧化的环境中，其生存需要在氧化剂和抗氧化剂之间找到适当的平衡。活性氧的过量生产或者细胞抗氧化防御的失败，将导致发病机理如：代谢综合征、dna损伤甚至致癌。很明显，氧化还原反应的途径和状态在这些严重的疾病中起着至关重要的作用。有证据表明，在癌症细胞中，几乎都可以观察到氧化还原状态的改变伴随着ros升高，氧化还原信号调节不同的转录因子。转录因子反过来控制炎症标记物的表达例如抗细胞凋亡，细胞因子，酶，增殖以及大多数癌症密切相关的血管生成。晚期肿瘤中的癌细胞经常表现出很高的氧化应激，这为癌症细胞调节氧化还原状态提供了重要信息。这是进化的自然结果，生物体通过抗氧化剂抵抗ros的生长从而调节氧化还原的体内平衡，从而建立起了免疫机制。抗氧化剂可以抑制氧化应激的途径，表现出控制或治疗癌症的潜力。因此，氧化应激与抗氧化能力之间的相互关系对生物具有重要的意义。

二氧化硫，在生物体中以hso3^-形式存在，可以通过含硫氨基酸的氧化或亚硫酸酯的分解产生。越来越多的证据证明，so2在调节氧化还原状态中作为抗氧化剂对活性氧方面发挥不可忽视的作用。然而，so2也具有潜在的氧化能力。因此，在复杂的生物环境中，它既是信号分子又是氧化应激诱导物。因此，探索so2与ros对细胞的交叉影响，对于进一步了解so2在细胞内的二分作用具有重要意义。线粒体在细胞能量代谢和凋亡细胞死亡中起着众所周知的作用。与此同时，线粒体是免疫系统的中枢信号中枢，其中活性氧(ros)会驱动关键的免疫信号反应。在谷氨酸的作用下，线粒体可以将天冬氨酸转移酶定位，催化l-半胱氨酸的反应，从而产生so2。考虑到二氧化硫的抗氧化作用，无论线粒体的绝对数量是多少，线粒体的二氧化硫都有可能抑制氧化应激，延缓氧化应激下细胞凋亡的进展。由于so2的氧化作用，受损的线粒体会引起细胞凋亡的恶性循环，从而导致ros的增加，进而导致更多的细胞凋亡。将so2的相互冲突的特性结合在一起，进一步探索线粒体so2的二分作用将为细胞调控机制提供无价的信息，并为癌细胞发展化疗药物治疗。但是，目前还没有一份报告描述线粒体二氧化硫在氧化应激下对癌细胞的相互冲突的影响。此外，就凋亡类型而言，不同类型的细胞凋亡，如早期或晚期细胞凋亡，将反映不同的系统调控，酶表达，或氧化还原破坏等。例如，在某些情况下，氧化应激会导致与晚期细胞凋亡相关的dna碎片化。然而，并没有发现线粒体so2对特定细胞凋亡类型的影响。因此，对线粒体so2的研究也越来越多。

研究线粒体二氧化硫的主要的挑战在于，在进行实时监测时，几乎不可能立即将二氧化硫与生物系统分离开来。在这种情况下，荧光探针是有能力的，因为它有能力在复杂的生物环境中有选择性地报告目标。尽管已经详细阐述了许多关于二氧化硫的荧光探针，直到最近几年，很少有针对线粒体二氧化硫的荧光探针被设计和应用到活细胞上。作为一项开创性的工作，第一个线粒体靶向测量荧光探针是由chang和yuan开发的，并应用于在活细胞中检测内在生成的细胞内so2衍生物。随后，许多其他线粒体so2荧光探针相继设计并应用于活细胞的荧光成像。但该项技术仍缺乏对线粒体so2对细胞的二分影响的深入探索，表明其探针适用性差。此外，还需要改进荧光探针的适用范围，以适应于相对量化线粒体so2的策略以及线粒体的so2对细胞凋亡的调节影响的探讨。造成这些问题的原因在于，so2与探针的反应往往是新核加成反应，将导致产生的给电子基脱离共轭平面，从而影响荧光的强度与灵敏度。因此，我们认为迫切需要开发一种新的探测器来进一步了解生物样品中的so2。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的上述不足，设计了一种“三角电子推-拉”线粒体靶向型检测so2的荧光探针，即荧光探针(e)-4-(3-4-羟基苯乙烯)-1-甲基吡啶(fhmi分子探针)。

同时本发明还提供了上述探针fhmi的制备方法及其应用，用于检测线粒体内so2。

本发明技术方案如下：

一种“三角电子推-拉”线粒体靶向型检测so2的荧光探针，所述探针为荧光探针(e)-4-(3-4-羟基苯乙烯)-1-甲基吡啶，即fhmi分子探针，包含一个用于电子推动的羟基，一个用于拉电子与so2反应的醛基，和一个用于拉电子与线粒体定位的吡啶盐结构；其结构如式i所示：

所述“三角电子推-拉”线粒体靶向型检测so2的荧光探针，具备两个吸电子基团和一个给电子基，且两个吸电子基团分别充当线粒体靶向和待测物检测基团。

所述“三角电子推-拉”线粒体靶向型检测so2的荧光探针，可用于检测易亲核目标物，最低检测限为13.2nm，与线粒体共定位系数为0.91；所述的易亲核目标物优选为加成反应导致非共轭产物的目标物。

进一步地，所述“三角电子推-拉”线粒体靶向型检测so2的荧光探针，效果判断指标为：

探针本身荧光淬灭，被待测物hso3^-触发后释放荧光；

检测灵敏度：检测限hso3^-为13.2nm；

检测速度：检测hso3^-的速度为60秒。

一种“三角电子推-拉”线粒体靶向型检测so2的荧光探针的制备方法，步骤包括：

（1）将甲苯和冰乙酸按照体积比1:1~1.5配制为混合溶液，然后向混合溶液中加入浓度为6～7mg/ml苯酚，溶解后，再加入苯酚质量3～4倍的六亚甲基四胺，混合均匀，加热回流至溶液颜色变为橙红色，冷却至室温，加入浓度为5~7mol/l的盐酸，然后用乙酸乙酯萃取，萃取的有机层用0.5~1倍体积的饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂后，再经硅胶柱纯化，得到黄色固体，即4-羟基间苯二甲醛；

（2）将4-甲基吡啶与乙醚、碘甲烷按体积比4：12~16：1~2混合，避光常温搅拌反应1~2h，得到白色固体，即1,4二甲基吡啶碘化盐；

（3）取步骤（1）制备的4-羟基间苯二甲醛，配制为0.8～1.5mg/ml的4-羟基间苯二甲醛的乙醇溶液，然后向溶液中加入哌啶和1,4二甲基吡啶碘化盐，加入的哌啶与乙醇体积比为1：80～120，加入的1,4二甲基吡啶碘化盐与4-羟基间苯二甲醛的质量比为3～3.3：1，然后在氮气保护下反应20~50min，反应结束后旋蒸除去有机溶剂，再经硅胶柱纯化，梯度洗脱，得到红色油状物，即“三角电子推-拉”线粒体靶向型检测so2的荧光探针。

进一步地，步骤（1）中，甲苯和冰乙酸按照体积比优选1：1.25，然后向混合溶液中加入浓度为6.7mg/ml的苯酚，溶解后，再加入苯酚质量3.3倍的六亚甲基四胺。

进一步地，步骤（1）中，所述加热回流，时间优选18h；所述萃取，反应液与乙酸乙酯体积比1:1~2，萃取的有机层用0.67倍体积的饱和食盐水洗涤，萃取三次；所述硅胶柱纯化，选用石油醚溶解，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=10:1。

进一步地，步骤（2）中，4-甲基吡啶与乙醚、碘甲烷按体积比优选4：12：1.5。

进一步地，步骤（3）中，4-羟基间苯二甲醛的乙醇溶液浓度优选1mg/ml，加入的哌啶与乙醇体积比优选1：100，加入的1,4二甲基吡啶碘化盐与4-羟基间苯二甲醛的质量比优选3.12：1。

进一步地，步骤（3）中，所述硅胶柱纯化，选用二氯甲烷溶解；所述梯度洗脱，洗脱剂为由200:1的二氯甲烷：甲醇至纯甲醇；所述梯度洗脱优选为二氯甲烷：甲醇=200:1（除去原料点）；二氯甲烷：甲醇=50:1（除去杂质点）；甲醇（荧光探针）。

本发明还提供了上述“三角电子推-拉”线粒体靶向型检测so2的荧光探针的应用。

所述荧光探针适用于细胞内线粒体中so2的检测分析；所述细胞为hela细胞株等。

一种“三角电子推-拉”线粒体靶向型检测so2的荧光探针用于细胞内线粒体中so2的检测方法，步骤包括：

1）配制溶液

配制fhmi分子探针储备液：称取fmhi分子探针溶于dmso(二甲亚砜)中，配制浓度为1×10^-4mol/l，得fhmi分子探针储备液；

配制待测目标物nahso3储备液：称取待测目标物nahso3溶于水中，配制浓度为1×10^-3m的nahso3储备液；

2）制备待测样品溶液

取100µl待测样品，加入10µlfhmi分子探针储备液、100µl浓度为0.1mm、ph7.40的pbs缓冲液、790µldmso混合均匀，得待测样品溶液；

3）建立标准品的线性方程

取步骤1）配制的待测目标物nahso3储备液，稀释得到梯度浓度为1～100μm的nahso3标准品溶液，然后分别取100µl稀释后的各浓度nahso3标准品溶液与10µlfhmi分子探针储备液和790µldmso混合后，再分别加入100µl浓度为0.1mm、ph7.40的pbs缓冲液，振摇混合均匀，于37℃下放置1min，然后经荧光分光光度计或紫外光谱仪检测，建立nahso3浓度与荧光信号强度或吸收强度的线性方程，即nahso3标准品的线性方程；

4）检测细胞内线粒体中so2：

a）荧光检测法：将1000µl步骤2）中待测样品溶液注入石英比色皿后，置入荧光分光光度计，收集荧光发射位置的强度数据，代入so2浓度与荧光信号强度的线性方程，计算得待测样中的so2含量；

b）紫外检测待法：将1000µl步骤2）中待测样品溶液注入石英比色皿后，置入紫外分光光度计，收集最大吸收波长位置的强度，求出反应前后最大吸收峰强度比率并代入紫外的线性关系中，计算得待测样中的so2含量。

进一步地，上述实时检测方法，检测待测样品前，分别以荧光检测法或紫外检测法对待测样品细胞内线粒体中so2进行平行多次检测，并与标准品进行校准，得到荧光检测法或紫外检测法的最优检测范围，从而根据待测样品所含待测物的浓度范围来选择最优化的检测方法检测so2含量。

本发明通过苯酚溶于甲苯和冰乙酸中，在六亚甲基四胺的催化下，得到4-羟基间苯二甲醛。然后由4-甲基吡啶、乙醚、和碘甲烷常温搅拌下得到1,4二甲基吡啶碘化盐。4-羟基间苯二甲醛和1,4二甲基吡啶碘化盐，以乙醇为溶剂，哌啶为催化剂，氮气保护下反应得到fhmi分子探针。该探针克服了亲核反应对待测物检测所造成的给电子基脱离共轭系统这一问题。本发明fhmi分子探针是一种小巧而精致的分子探针，包含一个用于电子推动的羟基，一个用于拉电子和与so2反应的醛基，还有一个用于拉电子和线粒体定位的吡啶。当遇到so2时，fhni的醛基与so2发生反应，改变了三角关系间的推拉，从而引发了荧光的转变。吡啶盐结构可以使fhmi在线粒体内积累，即对线粒体具有靶向性。羟基结构可以增加亲水性，所以探针fhmi易溶于水。并且反应时间快，反应时间在1min之内。高灵敏性（最低检测线：13.2nm）,特殊性（共定位系数：0.91，与检测二氧化硫的荧光染料（mtr））。探针fhmi已经成功的应用于hela细胞中，检测线粒体中二氧化硫的相对量。此外，探针fhmi可用来观察线粒体中二氧化硫的氧化作用和抗氧化作用。尤其，发现线粒体中的二氧化硫与hela细胞的早期凋亡有密切关系，对以后荧光探针的设计以及生物体内细胞线粒体内二氧化硫的检测起到指导作用。

本发明技术方案有益效果为：

1）检测速度快：检测s02的响应速度快，60s左右。

2)多种生物样品成像：成功实现了待测物在细胞中的成像，并在细胞中进行了一系列的线性荧光检测，成像的实现对于so2这一标志物的深入研究起到很大的推动作用。

3)肉眼监测，方便快捷：本发明探针和检测方法填补了so2检测方法的空白，使待测物的肉眼监测（无需仪器，直接观测）成为可能，检测过程比普通探针更加快捷。

4）发光机理新颖独特，更适于光学检测：本发明探针的发光机理为ict电子转移机理，原理非常新颖,且过程中荧光无发射位移，因而不会干扰比色分析。

附图说明

图1为本发明制备的fhmi分子探针及发光原理；

图2为fhmi分子探针h谱图；

图3为fhmi分子探针c谱图；

图4为荧光检测so2的线性关系；

图5为动态的hela细胞(a~f)的荧光强度进行时间追踪图；

图6为加入不同浓度的hso3^-细胞图；

图7为hela细胞存活率实验；

图8为针反应时间优化（（探针浓度为10μm，缓冲溶液：pbs缓冲液，温度为37℃）；

图9为探针对ph的响应（探针浓度为10μm，缓冲溶液：pbs缓冲液，温度为37℃）；

图10为温度对fhmi分子探针(10μm)与hso3^-(20μm)反应的荧光信号影响(缓冲溶液：pbs缓冲液，ph7.40，时间：1min)；

图11为探针分子对选择性分析。

具体实施方式

通过结合具体实施例描述本发明，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均包括在本发明的范围内。

本发明实施例中，高效液相-质谱分析是利用agilent1290连接agilent6460三重四极杆质谱系统(agilent,usa)，并配备agilentjetstream电喷雾系统.高效率液相色谱分离是借助sbc18柱(2.1mm×50mm,1.8μmi.d.,agilent,usa)来完成。高效液相–紫外分析实验是采用agilent1260在线真空抽气装置、自动进行样器、荧光检测器联合工作。分离梯度设为0min:70%a+30%b;10min:0%a+100%b;15min:0%a+100%b;其中a与b分别为0.5%甲酸+5%乙腈和100%乙腈溶液。荧光检测是利用日立hitachif-7000荧光光谱仪来进行，激发波长为475nm，发射波长为540nm,激发和发射狭缝宽度均为10.0nm,电压400v，扫描速度2400nm/min。紫外可见光谱是通过cary300bio紫外可见光谱仪来进行，扫描范围为350～700nm。荧光成像观测是通过olympus,ix73-dp80(japan)倒置荧光显微镜来进行。化合物的分离纯化是采用薄层色谱硅胶柱来实现(填料300-400目)。

实施例1：制备fhmi分子探针

一种“三角电子推-拉”线粒体靶向型检测so2的荧光探针的制备方法，步骤包括：

（1）将300mg的苯酚溶于20ml甲苯和25ml冰乙酸的混合溶液中，然后加入983mg的六亚甲基四胺，混合均匀，加热回流18h，至溶液颜色变为橙红色。冷却至室温，加入浓度为6m的盐酸，然后用乙酸乙酯萃取（70ml，萃取三次）。萃取的有机层用150ml的饱和食盐水进行洗涤，再用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂后，再经硅胶柱纯化，（选用石油醚溶解，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=10:1），得到黄色固体，即4-羟基间苯二甲醛。

（2）4ml的4-甲基吡啶、12ml的乙醚、1.5ml的碘甲烷加入到50ml的圆底烧瓶中，用锡箔纸包住整个烧瓶，避光，常温搅拌反应2h，得到白色固体，即1,4二甲基吡啶碘化盐。

（3）将0.010g的4-羟基间苯二甲醛溶于10ml的乙醇中，然后加入100μl的哌啶和0.0312g的1,4二甲基吡啶碘化盐。在氮气保护下，反应30min。反应结束后旋蒸除去有机溶剂，再经硅胶柱纯化（二氯甲烷溶解），梯度洗脱（洗脱剂为二氯甲烷：甲醇200:1至甲醇），得到红色油状物，即“三角电子推-拉”线粒体靶向型检测so2的荧光探针（fhmi分子探针）。

实施例1制备得到的fhmi分子探针，效果如下：

检测灵敏度：检测限hso3-为13.2nm；

检测速度：检测hso3-的速度为60s；

其核磁表征如图2~3。

实施例2：制备fhmi分子探针

一种“三角电子推-拉”线粒体靶向型检测so2的荧光探针的制备方法，步骤包括：

（1）将240mg的苯酚溶于20ml甲苯和20ml冰乙酸的混合溶液中，然后加入720mg的六亚甲基四胺，混合均匀，加热回流16h，至溶液颜色变为橙红色。冷却至室温，加入浓度为7m的盐酸，然后用乙酸乙酯萃取（40ml，萃取三次）。萃取的有机层用120ml的饱和食盐水进行洗涤，再用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂后，再经硅胶柱纯化，（选用石油醚溶解，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=10:1），得到黄色固体，即4-羟基间苯二甲醛。

（2）4ml的4-甲基吡啶、16ml的乙醚、1ml的碘甲烷加入到50ml的圆底烧瓶中，用锡箔纸包住整个烧瓶，避光，常温搅拌反应1.5h，得到白色固体，即1,4二甲基吡啶碘化盐。

（3）将0.008g的4-羟基间苯二甲醛溶于8ml的乙醇中，然后加入80μl的哌啶和0.024g的1,4二甲基吡啶碘化盐。在氮气保护下，反应20min。反应结束后旋蒸除去有机溶剂，再经硅胶柱纯化（二氯甲烷溶解），梯度洗脱（洗脱剂依次为二氯甲烷：甲醇=200:1，除去原料点；二氯甲烷：甲醇=50:1，除去杂质点；甲醇，荧光探针。），得到红色油状物，即“三角电子推-拉”线粒体靶向型检测so2的荧光探针（fhmi分子探针）。

经检测实施例2制备得到的fhmi分子探针，其结构式为：

。

实施例3：制备fhmi分子探针

一种“三角电子推-拉”线粒体靶向型检测so2的荧光探针的制备方法，步骤包括：

1）将350mg的苯酚溶于20ml甲苯和30ml冰乙酸的混合溶液中，然后加入1.400g的六亚甲基四胺，混合均匀，加热回流20h，至溶液颜色变为橙红色。冷却至室温，加入浓度为8m的盐酸，然后用乙酸乙酯萃取（100ml，萃取三次）。萃取的有机层用200ml的饱和食盐水进行洗涤，再用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂后，再经硅胶柱纯化，（选用石油醚溶解，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=10:1），得到黄色固体，即4-羟基间苯二甲醛。

（2）4ml的4-甲基吡啶、14ml的乙醚、2ml的碘甲烷加入到50ml的圆底烧瓶中，用锡箔纸包住整个烧瓶，避光，常温搅拌反应1h，得到白色固体，即1,4二甲基吡啶碘化盐。

（3）将0.020g的4-羟基间苯二甲醛溶于20ml的乙醇中，然后加入200μl的哌啶和0.060g的1,4二甲基吡啶碘化盐。在氮气保护下，反应50min。反应结束后旋蒸除去有机溶剂，再经硅胶柱纯化（二氯甲烷溶解），梯度洗脱（洗脱剂为二氯甲烷：甲醇200:1至甲醇），得到红色油状物，即“三角电子推-拉”线粒体靶向型检测so2的荧光探针（fhmi分子探针）。

经检测实施例3制备得到的fhmi分子探针，其结构式为：

。

实施例4：应用

一种“三角电子推-拉”线粒体靶向型检测so2的荧光探针用于细胞内线粒体中so2的检测方法，步骤包括：：

1）配制溶液

配制fhmi探针储备液，准确称取荧光探针fmhi溶于dmso(二甲亚砜)中，配制浓度为1×10^-4mol/l，得fhmi探针储备液。

配置待测目标物nahso3储备液，准确称取待测目标物nahso3溶于水中，配制浓度为1×10^-3m的nahso3储备液。

2）制备待测样品溶液

取100µl待测样品，加入10µlfhmi分子探针储备液、100µl浓度为0.1mm、ph7.40的pbs缓冲液、790µldmso混合均匀，得待测样品溶液；

3）建立标准品的线性关系

取步骤1）配制的待测目标物nahso3储备液稀，稀释得到梯度浓度为1～100μm的

nahso3标准品溶液，然后分别取100µl稀释后的各浓度nahso3标准品溶液与10µl探针fhmi储备液和790µldmso混合后，再分别加入100µl浓度为0.1mm、ph7.40的pbs缓冲液，振摇混合均匀，于37℃下放置1min，然后经荧光分光光度计或紫外光谱仪检测，建立nahso3浓度与荧光信号强度或吸收强度的线性方程，即nahso3标准品的线性方程，如图4所示。

4）检测细胞内（hela细胞株）线粒体中so2

a）荧光检测法：将1000µl步骤2）中待测样品溶液注入石英比色皿后，置入荧光分光光度计，收集荧光发射位置的强度数据，代入so2浓度与荧光信号强度的线性方程，计算得待测样中的so2含量；

b）紫外检测待法：将1000µl步骤2）中待测样品溶液注入石英比色皿后，置入紫外分光光度计，收集最大吸收波长位置的强度，求出反应前后最大吸收峰强度比率并代入紫外的线性关系中，计算得待测样中的so2含量。

分别以上述a)荧光检测法和b）紫外检测法对待测样品细胞内线粒体中so2进行平行次检测，并与标准品进行校准，得到荧光检测法最优检测范围为0~100μm；紫外检测法最优检测范围为0~60μm。

根据待测样品所含待测物的浓度范围选择荧光检测法，检测方法检测待测样品so2含量，检测结果为6.82μm。

5）细胞内稳定性的检测

探针加入细胞后，对细胞的荧光强度进行时间追踪得到图5，由此可以看出本实验的探针的光稳定性在细胞里面的表现还是比较良好的。其中探针浓度为10μm。

6)细胞内so2监测（以hela细胞为例）

在37℃下含有5％co2气体的湿润培养箱中，将hela细胞分别在含有10％胎牛血清（fbs，invitrogen）的dmem培养基和1640培养基中孵育24h。以dmem培养基溶液进行洗涤，然后加入10μm的荧光分子探针（探针fhmi）于37℃共培育30min，再加入mitotrackerred(mtr)(0.08μm)培育15min，然后分别加入nahso3(0-80μm)。置入共聚焦下观测成像，然后待测活细胞样品观测成像。如图7所示，可以看出探针很好的作用在线粒体上，根据发光强度判断待测细胞线粒体中so2的量。待测细胞线粒体中fhmi的颜色为：蓝色（紫外灯下）。

实施例5：细胞存活率监测（以hela为例）

本实施例hela细胞存活率的细胞毒性实验主要为了检验本发明实施例1制备的荧光探针对细胞寿命的影响。

具体方法为：分别培养五组hela细胞，培养24h后，分别计算五组中的细胞个数，然后分别加入0~40μm的探针，然后再计算各自的细胞个数百分比，不加入探针的为1，加入40μm的探针的为0.9左右。因此可以看出本探针的细胞毒性很小，适应于生物体（如图7）。

本发明制备的荧光探针各项技术指标的实验验证，具体如下：

一、时间用量优化

反应时间将影响探针分子与待测物hso3^-的反应效率与反应程度，同时也将决定最终信号的强度与稳定性。因此，在确定探针浓度后，本发明对反应的时间进行优化。从图8中可以看出，本发明的探针的响应非常灵敏，大约在60s反应结束。

二、探针对ph的优化

探针对探针有一定的影响作用，首先要研究一下本探针在什么条件下比较稳定，适合研究。首先探针fhmi浓度控制为10μm，ph的变化3.0~9.5，由图9可以看出本探针在7.0~7.4时荧光强度变化最大，人体的ph在7.4左右，因而特别适合于生物样本的应用与研究。

三、反应温度的优化

温度对化学反应的影响至关重要，对于本发明所研究的生物样本如活细胞、组织体系更是如此。通常动物体的温度一般为37℃左右，在此温度下探针能否对待测目标物有良好的响应将关系到整个实验的成败。如图10所示，本发明对温度在20~45℃范围的反应所带来的荧光响应进行了调查。从中不难发现，本探针在37℃时，荧光强度变化最大，因而特别适合于生物样本的应用与研究。

四、探针分子的选择性分析

下述物质储备液分别有：a图)1:br^-,2:cl^-,3:oh^-,4:f^-,5:so4^2-,6:so3^2-,7:co3^2-,8:hco3^-,9:no2^-,10:no3^-,11:scn^-,12:clo3^-,13:n3^-,14:s2o3^2-,15:ch3coo^-,16:po4^3-,17:h2po4^-,18:hpo4^2-,19:hso3^-.b图)1:hso3^-,2:mn²⁺,3:sr²⁺,4:ga²⁺,5:co²⁺,6:cd²⁺,7:ni²⁺,8:mg²⁺,9:al³⁺,10:zn²⁺,11:cu²⁺,12:fe³⁺,13:cys,14:hcy,15:gsh.ph=7.40pbs缓冲液100μl.。用于后续分析，后续实验中所需低浓度溶液均在此储备液基础上稀释制得；

基于本探针较强的荧光响应，本发明分析了探针对hso3^-的选择性（图11）：相对于hso3^-，探针对其他离子表现出极差的响应。因此，优秀的选择性使得探针fhmi完全适合在生物样本中的应用。此外，温度实验也证实了本探针非常适用于生物样品。