一种提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法与流程

本发明涉及一种提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法，属于遗传工程领域。

背景技术：

乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。

枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养品的生产宿主，其产品被fda认证为“generallyregardedassafe”(gras)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。然而，专利申请201510761678.6中构建的重组枯草芽孢杆菌(bsgnkap-pxyla-glms-p43-gna1)存在产量不高、产物转化率较低的缺点。因此，提高乙酰氨基葡萄糖合成途径代谢通量，是提高乙酰氨基葡萄糖产量亟待解决的问题。目前枯草芽孢杆菌中催化乙酰氨基葡萄糖合成途径的最后一步反应，即6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖的酶尚不清楚。据报道在酿酒酵母中表达来自于大肠杆菌的had-like家族的三个磷酸酶后对乙酰氨基葡萄糖的合成都有明显的促进作用；而以大肠杆菌作为宿主菌时只需强化6-磷酸氨基葡萄糖合酶glms与6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1便可达到很高的乙酰氨基葡萄糖产量，很可能是因为其周质空间中存在丰富的磷酸酶可以催化6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖。而枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，其不存在大肠杆菌那样的周质空间结构，因此推测在重组枯草芽孢杆菌bsgnkap-pxyla-glms-p43-gna1中6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖的反应可能为其合成乙酰氨基葡萄糖的限速步骤(图1)。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是构建一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。

本发明的第一个目的是提供一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌表达了氨基酸序列如seqidno.2所示的磷酸酶。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸酶的编码基因yqab是来源于大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌bsgnkap-pxyla-glms-p43-gna1为出发菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌bsgnkap-pxyla-glms-p43-gna1是以枯草芽孢杆菌168为基础，基因型作如下改造得到的：δnagpδgampδgamaδnagaδnagbδldhδptaδglckδpckaδpyk::lox72，并以木糖诱导启动子pxyla调控表达glms、在质粒上以启动子p43调控gna1的重组表达。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌bsgnkap-pxyla-glms-p43-gna1，是申请号为201510761678.6的申请中构建的重组枯草芽孢杆菌bsgnkap-pxyla-glms-p43-gna1。

在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因gna1是来源于秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)，表达的氨基酸序列如seqidno.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以pp43nmk为表达载体共表达磷酸酶编码基因与氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌，将来自于大肠杆菌的磷酸酶基因yqab与秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因gna1，克隆到表达载体pp43nmk上，然后转化重组枯草芽孢杆菌bsgnkap-pxyla-glms得到。

本发明的第二个目的是提供一种表达氨基酸序列如seqidno.2所示的磷酸酶的重组质粒，所述重组质粒还表达了氨基酸序列如seqidno.1所示的氨基葡萄糖乙酰化酶。

本发明的第三个目的是提供一种构建上述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)构建重组质粒

将氨基酸序列如seqidno.2所示磷酸酶的编码基因与氨基酸序列如seqidno.1所示氨基葡萄糖乙酰化酶的编码基因通过融合pcr的方式构建表达框进行共表达，并连接到载体pp43nmk上得到重组表达载体；

2)构建产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌

将上述重组表达载体转化枯草芽孢杆菌bsgnkap-pxyla-glms，得到积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。

本发明的第四个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌在药物、营养保健品或者化妆品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是利用所述重组枯草芽孢杆菌生产乙酰氨基葡萄糖。

在本发明的一种实施方式中，所述应用将35-38℃、200-240rpm下培养10-15h的重组枯草芽孢杆菌以5-10％的接种量转入发酵培养基，接种2-4h后加入诱导剂木糖，于35-38℃、200-240rpm条件下发酵30-60h。

在本发明的一种实施方式中，木糖用量为1-10g/l。

本发明的有益效果：

本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可高效利用葡萄糖合成乙酰氨基葡萄糖，其摇瓶发酵产量可达到14.5g/l，同时本发明提供的重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵乙酰氨基葡萄糖得率已提高到0.255g/g葡萄糖，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

附图说明

图1为重组枯草芽孢杆菌中乙酰氨基葡萄糖合成途径；

图2为不同磷酸酶对重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的影响。

具体实施方式

种子培养基(g/l)：胰蛋白胨10，酵母粉5，nacl10。

发酵培养基(g/l)：胰蛋白胨6，酵母粉12，(nh4)so46，k2hpo4·3h2o12.5，kh2po42.5，caco35，微量元素10ml/l；微量元素溶液按g/l计含有：mnso4·5h2o1.0，cocl2·6h2o0.4，namoo4·2h2o0.2，znso4·7h2o0.2，alcl3·6h2o0.1，cucl2·h2o0.1，h3bo40.05，含5mhcl。

乙酰氨基葡萄糖的测定方法：

高效液相色谱(hplc)检测法：agilent1260，rid检测器，hpx-87h柱(bio-radhercules,ca)，流动相：5mmh2so4，流速0.6ml/min，柱温35oc，进样体积为10μl。

乙酰氨基葡萄糖得率的计算：

乙酰氨基葡萄糖得率(yglcnac/glc)＝乙酰氨基葡萄糖产量(g/l)/消耗的葡萄糖(g/l)

实施例1：重组质粒的构建

根据氨基酸序列如seqidno.1所示的来源于秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)的氨基葡萄糖乙酰化酶的编码基因gna1，设计序列如seqidno.3/seqidno.4所示的引物gna1-yqab-1-fkpni：5’-tagcggtaccattataggtaagagaggaatgtacacatgagccatatcttcgacgc-3’，gna1-yqab-1-rrbs：5’-gtacatgtgtacgcctccttttataatgttaaaagcgctgggtcataaaat-3’；使用上述引物从质粒pp43-gna1中克隆出氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因gna1。

根据氨基酸序列如seqidno.2所示的来源于大肠杆菌(escherichiacoli)的磷酸酶基因yqab，设计序列如seqidno.5/seqidno.6的引物gna1-yqab-2-frbs：5’-gcttttaacattataaaaggaggcgtacacatgtacgagcgttatgcag-3’，gna1-yqab-2-rhindiii：5’-acgccaagctttcacagcaagcgaacatcc-3’；使用上述引物分从大肠杆菌(escherichiacoli)基因组中扩增出磷酸酶基因yqab，并在其上游引入rbs序列aaaggagg。

然后通过重叠延伸pcr的方式将两个基因通过融合pcr的方式构建共表达框，融合片段经kpni和hindiii双酶切后连接至pp43nmk表达载体。酶切验证并测序，确认重组质粒构建成功，命名为pp43-gna1-yqab。表达载体pp43nmk的构建方法参见：high-levelexpressionandsecretionofmethylparathionhydrolaseinbacillussubtiliswb800.xiao-zhouzhang,etal.appliedandenvironmentalmicrobiology,71(4102-4103)。

实施例2：重组枯草芽孢杆菌的构建

将构建好的表达载体pp43-gna1-yqab转化重组枯草芽孢杆菌bsgnkap-pxyla-glms。采用gna1-yqab-1-fkpni及gna1-yqab-2-rhindiii引物挑选转化子进行菌落pcr，出现1151bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌构建成功。

实施例3：重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖

采用实施例1构建得到的重组芽孢杆菌进行摇瓶发酵，将37℃、220rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，两小时后加入木糖进行诱导，于37℃、220rpm条件下培养48h。最终发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到14.5g/l，乙酰氨基葡萄糖得率达到0.255g/g葡萄糖。

对照菌株以bsgnkap-pxyla-glms为出发菌株，将秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因gna1连接到表达载体pp43nmk上，转化枯草芽孢杆菌bsgnkap-pxyla-glms中，得到对照菌株，在相同培养条件下发酵培养，最终发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到11.1g/l，乙酰氨基葡萄糖得率为0.192g/g葡萄糖。

通过比较，共表达大肠杆菌来源的yqab基因与秀丽隐杆线虫来源的gna1的重组枯草芽孢杆菌发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖产量较只表达了秀丽隐杆线虫来源gna1基因的对照菌株提高了30.6％(结果如表一所示)，乙酰氨基葡萄糖得率提高了32.8％。通过量表达磷酸酶yqab，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外的积累。

表1表达磷酸酶前后细胞生长和乙酰氨基葡萄糖合成情况

对照例1：表达其他磷酸酶对重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的影响

以大肠杆菌基因组为模板分别克隆出磷酸酶核苷酸序列如ncbi-geneid:948380所示的yihx、核苷酸序列如ncbi-geneid:948357所示的yigb与核苷酸序列如ncbi-geneid:947904所示的yrfg，利用实施例1中融合pcr的方式构建分别含有6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶gna1与不同磷酸酶的的共表达框，融合片段经kpni和hindiii双酶切后连接至pp43nmk表达载体。酶切验证并测序，确认重组质粒构建成功。将含有不同磷酸酶基因的表达载体转化重组枯草芽孢杆菌bsgnkap-pxyla-glms，采用实施例3的方式进行发酵验证，结果如图2所示，除yqab外，均对产量无明显的促进作用，说明在重组枯草芽孢杆菌中只有yqab可以特异性地催化6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一种提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法

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<170>patentinversion3.3

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<213>人工序列

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