本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种橡胶树胶乳表达酰基辅酶a结合蛋白hbacbp1和hbacbp2及应用。
背景技术：
脂类物质在植物体生长发育和适应外界环境中发挥重要作用，其代谢过程需要酰基载体蛋白的参与，其中一类酰基载体蛋白是酰基辅酶a(coa)结合蛋白(acyl-coa-bindingprotein，简称acbp)。acbp家族蛋白普遍存在于原核和真核生物细胞中，其共同特征是含有1个高度保守的酰基coa结合结构域(acyl-coa-bindingdomain，简称acbd)，部分成员除含有acbd外还具有介导蛋白质互作的ankyrinrepeats和kelchmotif等重复序列。根据这些结构特点，可将acbp家族蛋白分为四大类，它们具有不同的结构域组成、亚细胞定位及生物学功能等。
植物acbp蛋白主要通过调节脂肪酸、酰基coa库、脂肪酸β氧化和囊泡运输等细胞内多种复杂的代谢活动，参与植物生长发育、胁迫响应和膜修复等生理过程。目前，已从木薯、蓖麻、油菜、水稻、拟南芥、杨树和苹果等植物中分离鉴定了acbp，而世界上最重要的产胶植物巴西橡胶树(heveabrasiliensis)中的acbp基因迄今为止还没有得到鉴定和研究。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种橡胶树胶乳表达酰基辅酶a结合蛋白hbacbp1和hbacbp2及应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种橡胶树胶乳表达酰基辅酶a结合蛋白hbacbp1和hbacbp2，其氨基酸序列分别如seqidno.3和seqidno.6所示。
本发明还公开了一种编码上述的橡胶树胶乳表达酰基辅酶a结合蛋白基因hbacbp1和hbacbp2。
进一步地，其核苷酸序列分别如seqidno.1和seqidno.4所示。
本发明还公开了一种含有上述的基因的重组表达载体。
本发明还公开了一种含有上述的基因的转基因重组菌。
本发明还公开了一种编码橡胶树胶乳表达酰基辅酶a结合蛋白基因hbacbp1和hbacbp2的克隆方法，所述hbacbp1基因采用的引物如下：hbacbp1正向引物：ttctcgaccaacttctaagt，其核苷酸序列如seqidno.7所示；反向引物：gttttatttcaataaataattgactagg，其核苷酸序列如seqidno.8所示；所述hbacbp2基因采用的引物如下：hbacbp2正向引物：cccccgaggcgcaaatcaatc，其核苷酸序列如seqidno.9所示；反向引物：gggaacttcggcctcaattcg，其核苷酸序列如seqidno.10所示。
本发明还公开了一种上述基因在提高橡胶树胶乳产量中的应用。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明首次在橡胶树产胶细胞中发现了hbacbp1和hbacbp1基因。hbacbp1基因的cdna全长为707bp，cds序列279bp，编码92个氨基酸的蛋白。hbacbp2基因的cdna全长为1215bp，cds序列855bp，编码285个氨基酸的蛋白。
2)本发明用cdd、pfam、smart和interproscan软件分析预测，hbacbp1和hbacbp2均有acbd保守结构域，但它们具有不同的亚细胞定位方式，hbacbp1为可溶性蛋白，定位于细胞液中，而hbacbp2具有跨膜结构域，是一个膜结合蛋白。
3)本发明采用割胶、乙烯利和茉莉酸刺激可显著提高hbacbp1和hbacbp2在橡胶树胶乳中的表达水平，并与胶乳产量呈显著正相关，在橡胶树品种改良和基因工程领域具有较大的经济价值和应用前景。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明橡胶树胶乳表达hbacbp1和hbacbp2的蛋白质结构域示意图；
图2是本发明橡胶树hbacbp基因的组织特异性表达模式；
图3是本发明割胶对橡胶树胶乳hbacbp1和hbacbp2基因表达的促进作用；
图4是本发明乙烯利(et)和茉莉酸(ja)对橡胶树胶乳hbacbp1和hbacbp2基因表达的促进作用；
图5是本发明橡胶树胶乳表达hbacbp1和hbacbp2的亚细胞定位分析；其中，a-d,hbacbp1-gfpfusionprotein；e-i,co-transfectionofhbacbp2-gfpfusionproteinandermarker；j-m,gfpcontrol.a,f,j,transientexpressionofgfp；b,g,k,chloroplastautofluerescence；c,h,l,visiblelight；d,i,m,mergedimages；e,ermarker.scalebar＝10μm。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1橡胶树乳管细胞表达hbacbp1和hbacbp2基因的克隆
首先，利用拟南芥acbp蛋白的保守acb序列为探针搜索橡胶树基因组数据库，共得到6个含acb结构域的橡胶树acbp基因，其中包括hbacbp1和hbacbp2。然后，根据hbacbp1和hbacbp2的cdna序列设计引物，从橡胶树的胶乳中分别克隆hbacbp1和hbacbp2的全长cdna序列，并进行克隆重测序验证，最后获得橡胶树胶乳表达的hbacbp1和hbacbp2的全长cdna序列。hbacbp1和hbacbp2克隆引物和rt-pcr扩增过程简单如下：
(1)克隆引物序列
hbacbp1正向引物：ttctcgaccaacttctaagt，其核苷酸序列如seqidno.7所示；反向引物：gttttatttcaataaataattgactagg，其核苷酸序列如seqidno.8所示；
hbacbp2正向引物：cccccgaggcgcaaatcaatc，其核苷酸序列如seqidno.9所示；反向引物：gggaacttcggcctcaattcg，其核苷酸序列如seqidno.10所示。
(2)hbacbp1和hbacbp2基因克隆及序列分析
提取橡胶树胶乳总rna，用试剂盒primerscriptrt将胶乳总rna反转录成cdna作模板，分别用上述hbacbp1和hbacbp2克隆引物进行rt-pcr扩增，并将扩增产物亚克隆至测序载体中，筛选阳性克隆进行测序，最终获得hbacbp1和hbacbp2的全长cdna序列，分别如seqidno.1和seqidno.4所示；hbacbp1和hbacbp2的cds序列分别如seqidno.2和seqidno.5所示。
生物信息分析表明，hbacbp1和hbacbp2均有1个acb保守结构域，此外，hbacbp2还含有1个ankyrin重复序列，它们的蛋白质结构域如图1所示，hbacbp1和hbacbp2蛋白的氨基酸序列分别如seqidno.3和seqidno.6所示。
实施例2橡胶树乳管细胞表达hbacbp1和hbacbp2的鉴定及其功能
利用拟南芥acbp蛋白的保守acbd序列搜索橡胶树基因组数据库，共得到6个橡胶树的acbp基因，分别命名为hbacbp1-hbacbp6。荧光定量rt-pcr分析表明，橡胶树的6个acbp基因中，只有hbacbp1和hbacbp2在乳管细胞即胶乳中具有较高水平的表达，而其余4个acbp基因在胶乳中的表达水平极低(图2)，因此，在橡胶树乳管细胞中发挥生理作用的acbp家族成员主要是hbacbp1和hbacbp2。
橡胶树胶乳hbacbp基因表达的荧光定量rt-pcr实验过程如下：所用试剂为sybrpremixextaqtmii试剂盒(takara)，pcr仪为cfx96real-timesystem(bio-rad,hercules,ca,usa)。pcr扩增体积20μl，反应条件为95℃预变性30s,95℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸30s，共40个循环。
割胶、乙烯利(et)和茉莉酸(ja)刺激对橡胶树胶乳hbacbp1和hbacbp2基因的表达均具显著的诱导作用(图3，图4)，这表明hbacbp1和hbacbp2与割胶、et和ja刺激促进橡胶树胶乳代谢及胶乳产量增加具有密切的关系，在橡胶树乳管细胞伤害信号转导中发挥重要作用。
实施例3hbacbp1和hbacbp2的亚细胞定位
分别将hbacbp1和hbacbp2基因的cds序列与绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)相连，构建表达载体，并转化拟南芥叶肉细胞原生质体进行亚细定位分析。如图5所示，hbacbp1是1个定位于细胞液的可溶性蛋白，而hbacbp2是定位于内质网上的膜结合蛋白。
实施例4hbacbp1和hbacbp2的应用实例
割胶、et和ja刺激条件下，橡胶树胶乳hbacbp1和hbacbp2基因的诱导表达与橡胶树胶乳产量增加表明，hbacbp1和hbacbp2在橡胶树胶乳代谢中发挥重要作用，是与橡胶树胶乳产量密切相关的重要功能基因。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110>中国热带农业科学院橡胶研究所
<120>橡胶树胶乳表达酰基辅酶a结合蛋白hbacbp1和hbacbp2及应用
<130>2017
<160>10
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>707
<212>dna
<213>橡胶树胶乳表达酰基辅酶a结合蛋白(heveabrasiliensisacyl-coa-bindingprotein)
<400>1
ttctcgaccaacttctaagtgactaaccaatcaatacaagccacgtaaaatagtacaaag60
gaataaacctacgaatatctgagtgtttacatactagacttccttcctcactctgcattg120
taattaactaccgctagcttcacgtctctgcattcattccttcatcaaatcacagagcaa180
aatgggtttgaaggaggaatttgaggagtatgctgagaaagctaagacccttccagaaaa240
tacaacaaatgagagcaaacttattttatatgggctttataagcaagccactgttggacc300
agtgaacaccagccgtcctggaatgtttaacatgagggacagagcaaagtgggatgcatg360
gaaggctgttgaaggcaaatcaaaggaacaagcaatgagtgactatatcactaaggtgaa420
acagttgcaggaagaagctgctgctgctgcttctgcttagtgtcttgaccatgtgtgtgt480
gcctgtaggttccttgtgttcaaaataatttaaaaaataataaattcaataattatctgg540
agtggtgtaatgttgtttctatattttctgaattaaattcagacttgtactaaaatggat600
tgaaattaatgtcatgatagtttcttaagtgtttgaaatttgcatagtgctaaccaaaat660
tccagccattaactaggatcctagtcaattatttattgaaataaaac707
<210>2
<211>279
<212>dna
<213>橡胶树胶乳表达酰基辅酶a结合蛋白(heveabrasiliensisacyl-coa-bindingprotein)
<400>2
atgggtttgaaggaggaatttgaggagtatgctgagaaagctaagacccttccagaaaat60
acaacaaatgagagcaaacttattttatatgggctttataagcaagccactgttggacca120
gtgaacaccagccgtcctggaatgtttaacatgagggacagagcaaagtgggatgcatgg180
aaggctgttgaaggcaaatcaaaggaacaagcaatgagtgactatatcactaaggtgaaa240
cagttgcaggaagaagctgctgctgctgcttctgcttag279
<210>3
<211>92
<212>prt
<213>橡胶树胶乳表达酰基辅酶a结合蛋白(heveabrasiliensisacyl-coa-bindingprotein)
<400>3
metglyleulysglugluphegluglutyralaglulysalalysthr
151015
leuprogluasnthrthrasngluserlysleuileleutyrglyleu
202530
tyrlysglnalathrvalglyprovalasnthrserargproglymet
354045
pheasnmetargaspargalalystrpaspalatrplysalavalglu
505560
glylysserlysgluglnalametserasptyrilethrlysvallys
65707580
glnleuglngluglualaalaalaalaalaserala
8590
<210>4
<211>1215
<212>dna
<213>橡胶树胶乳表达酰基辅酶a结合蛋白(heveabrasiliensisacyl-coa-bindingprotein)
<400>4
cccccgaggcgcaaatcaatccccgactttggttcccgtagcgaggatttaactgccgct60
gatttaaccgccgtccacgacactgattctgtgatggctgagcacggtagcgtgaggaac120
gagagcatagcgggtagtgatgttggtgatcaagatattgatgatgatgatgacgatgat180
gatgattgggagggcgtcgagagcaccgaactggacgaaacgtttagtgctgctaccgca240
tttgtggcggcggctgcagcggatcggctttctcagaaggtgtcgacggatgtgcagttg300
cagctttacggcttgtacaagattgccaccgaaggaccttgcagtactccccctccttcc360
gccatcaaaattagtgctcgtgccaagtggcaagcatggcagaaactcggtgctatgcct420
ccagaggatgcaatgcaaaagtacattgatattgttacagaattatatccttcttgggct480
tctggttcagccatgaaaaggaaaggtggagatggtgatgcacaaagtatggatgccaaa540
gggcccatgggtccagttttcagcacttatgtgtatgaggaggaatctggaaatgaattg600
aaaatggatgccattcatgcctttgccagagaaggagatttgaagaatttgctcaaatgt660
atagagactggtgtttctgcaaacctgaaagatagtgagggtcggaccccattgcactgg720
gctgtagatcgtggccatcttaacgtggtggaagttcttgttgaaaggaattctgatata780
aatgcaaaggataatgaaggccaaacacctttgcattatgctgctgtctgtgagagagaa840
gccattgcagaatttcttgttaagcaaaatgcagacgccagtttgaaagacaatgatggc900
aagtctgctcatgatctttgtgaattagactggccttgcctgcgggcatagcaacgtgga960
catgctgatattgtgttttgtggtttcttcggcctagtccttgacaaaatccccacggat1020
gtatgtatagtatatggctaattatggcccctccccccactttttaaacttatatcttaa1080
tgacaaaatttgcattgggataaatcacctgtccagttcatatttaaaagactatgtctc1140
tcatgtgggttcatgactaatgttggaaaattctagacatggtttttgccgaattgattt1200
gaggccgaagttccc1215
<210>5
<211>858
<212>dna
<213>橡胶树胶乳表达酰基辅酶a结合蛋白(heveabrasiliensisacyl-coa-bindingprotein)
<400>5
atggctgagcacggtagcgtgaggaacgagagcatagcgggtagtgatgttggtgatcaa60
gatattgatgatgatgatgacgatgatgatgattgggagggcgtcgagagcaccgaactg120
gacgaaacgtttagtgctgctaccgcatttgtggcggcggctgcagcggatcggctttct180
cagaaggtgtcgacggatgtgcagttgcagctttacggcttgtacaagattgccaccgaa240
ggaccttgcagtactccccctccttccgccatcaaaattagtgctcgtgccaagtggcaa300
gcatggcagaaactcggtgctatgcctccagaggatgcaatgcaaaagtacattgatatt360
gttacagaattatatccttcttgggcttctggttcagccatgaaaaggaaaggtggagat420
ggtgatgcacaaagtatggatgccaaagggcccatgggtccagttttcagcacttatgtg480
tatgaggaggaatctggaaatgaattgaaaatggatgccattcatgcctttgccagagaa540
ggagatttgaagaatttgctcaaatgtatagagactggtgtttctgcaaacctgaaagat600
agtgagggtcggaccccattgcactgggctgtagatcgtggccatcttaacgtggtggaa660
gttcttgttgaaaggaattctgatataaatgcaaaggataatgaaggccaaacacctttg720
cattatgctgctgtctgtgagagagaagccattgcagaatttcttgttaagcaaaatgca780
gacgccagtttgaaagacaatgatggcaagtctgctcatgatctttgtgaattagactgg840
ccttgcctgcgggcatag858
<210>6
<211>285
<212>prt
<213>橡胶树胶乳表达酰基辅酶a结合蛋白(heveabrasiliensisacyl-coa-bindingprotein)
<400>6
metalagluhisglyservalargasngluserilealaglyserasp
151015
valglyaspglnaspileaspaspaspaspaspaspaspaspasptrp
202530
gluglyvalgluserthrgluleuaspgluthrpheseralaalathr
354045
alaphevalalaalaalaalaalaaspargleuserglnlysvalser
505560
thraspvalglnleuglnleutyrglyleutyrlysilealathrglu
65707580
glyprocysserthrproproproseralailelysileseralaarg
859095
alalystrpglnalatrpglnlysleuglyalametproprogluasp
100105110
alametglnlystyrileaspilevalthrgluleutyrprosertrp
115120125
alaserglyseralametlysarglysglyglyaspglyaspalagln
130135140
sermetaspalalysglyprometglyprovalpheserthrtyrval
145150155160
tyrgluglugluserglyasngluleulysmetaspalailehisala
165170175
phealaarggluglyaspleulysasnleuleulyscysilegluthr
180185190
glyvalseralaasnleulysaspsergluglyargthrproleuhis
195200205
trpalavalaspargglyhisleuasnvalvalgluvalleuvalglu
210215220
argasnseraspileasnalalysaspasngluglyglnthrproleu
225230235240
histyralaalavalcysgluargglualailealaglupheleuval
245250255
lysglnasnalaaspalaserleulysaspasnaspglylysserala
260265270
hisaspleucysgluleuasptrpprocysleuargala
275280285
<210>7
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
ttctcgaccaacttctaagt20
<210>8
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
gttttatttcaataaataattgactagg28
<210>9
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
cccccgaggcgcaaatcaatc21
<210>10
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
gggaacttcggcctcaattcg21